NF—kB在肝癌中表達及其與上皮間質轉化的關系

盧穗萬+曾文龍+闕敢波+簡以增+余強鋒+張洪彬+黃騰欽+潘偉華+陳煌祥

[摘要] 目的 探討核轉錄因子NF-kB在肝癌中的表達情況及其與肝癌上皮間質轉化（EMT）的關系。方法 （1）方便收集福建省龍巖市第二醫院2014年12月—2015年10月肝癌患者12例外周血樣本，采用CanPatrol CTC二代富集技術分離循環腫瘤細胞（CTCs）；②采用RNA原位雜交（RNA-ISH）技術，鑒定CTCs類型和檢測NF-kB的表達。結果 91.7%（11/12）肝癌患者外周血樣本中檢測出CTCs，根據EMT標志物，CTCs可被分為3個亞群，包括上皮型CTCs，上皮/間質混合型CTCs和間質型CTCs。間質型CTCs、NF-kB在肝癌外周血中表達率分別為66.7%（8/12）、83.3%（10/12）；NF-kB表達與CTCs檢出率、間質型CTCs表達顯著相關（P<0.05）。結論 NF-kB可能和肝癌的EMT發生有關，并促進腫瘤轉移。

[關鍵詞] 肝癌；NF-kB；循環腫瘤細胞；EMT

[中圖分類號] R735 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）06（b）-0019-03

[Abstract] Objective To study the expression of NF-kB in liver cancer and correlation with epithelial-mesenchymal transition. Methods Convenient selection The peripheral blood samples of 12 cases of liver cancer patients admitted and treated in our hospital from December 2014 to October 2015 were collected and the CTCs was isolated by the CanPatrol CTC second-generation enrichment technique， and the CTCs type was identified by the RNA-ISH and the expression of NF-kB was tested. Results The CTCs was tested in the peripheral blood samples of 91.7%（11/12） liver cancer patients， and CTCs could be divided into three subgroups according to the marker of EMT， including epitheliated type CTCs， epithelial / interstitial mixed type CTCs and interstitial type CTCs， and the expression rate of interstitial type CTCs and NF-kB in the peripheral blood of liver cancer was respectively 66.7%（8/12）and 83.3%（10/12）， and the expression of NF-kB was obviously correlated with the test rate of CTCs and expression of interstitial type CTCs（P<0.05）. Conclusion NF-kB may be related to the occurrence of EMT of liver cancer and promote the neoplasm metastasis.

[Key words] Liver cancer； NF-kB； Circulating tumor cell； EMT

循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）是存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統稱，CTCs的出現是發生遠處轉移的前提，是形成轉移灶的關鍵環節。腫瘤細胞在進入外周血循環的過程中會發生上皮-間質轉化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT），因此，根據EMT標志物，CTCs可被分為：上皮型CTCs，上皮/間質混合型CTCs和間質型CTCs，其中間質型CTC具有更強的轉移潛能。核轉錄因子NF-kB可激活細胞因子或其受體基因轉錄，促進了非調節性淋巴細胞的生長而阻斷凋亡[1]。近來研究表明，NF-kB不僅可導致腫瘤的發生，還與腫瘤浸潤、轉移存在密切關系。該研究方便收集福建省龍巖市第二醫院2014年12月—2015年10月肝癌患者12例外周血樣本，旨在應用CanPatrol CTC二代富集技術聯合RNA原位雜交技術分離和鑒定肝癌患者CTCs，并檢測NF-kB在肝癌中的表達，進一步分析NF-kB與肝癌EMT的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究方便收集了福建省龍巖市第二醫院肝癌患者12例，男5例，女7例，年齡22～93歲，中位年齡58.5歲，全部病例經組織病理學檢查確診為肝癌。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 分型雜交探針、NF-kB檢測探針由上海生工公司合成；154 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTA、4%多聚甲醛溶液、PBS、DAPI、0.1×SSC、30%馬血清、1.5%SDS、3 mM Tris-HCl （pH=8.0）。

1.2.2 樣本采集 嚴格消毒后，應用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采血管采集肘正中靜脈血5 mL靜脈血，采集后置于4℃保存并于4 h內富集分離腫瘤細胞。

1.2.3 分離富集CTCs與檢測 將血液樣本從采血管轉移到樣本保存管中，室溫放置30 min后，離心去除上清，固定劑固定8 min，使用濾膜濾法富集得到CTCs。采用RNA-原位雜交法（RNA-ISH）檢測CTCs上皮標志物、間質標志物和NF-kB mRNA。

1.2.4 CTCs的判定標準 及陽性定義形態學標準：①細胞呈圓形、橢圓形或長形，直徑大于10 μm；②光鏡下可見完整細胞形態及細胞核；③熒光下細胞形態及邊緣完整。RNA-ISH陽性信號標準：結果判定：由兩位經培訓實驗員在熒光顯微鏡下分別觀察細胞顯色情況，按照以上標準采集陽性細胞圖像并計數。若存在分歧，則由第三人或更多協助下共同判定結果。陽性界定值：目前尚無國際標準化CTCs的陽性界定標準，該研究以CTCs≥1判定為CTCs陽性結果。

1.2.5 CTCs分型標準 根據EMT標志物，將CTCs分為：上皮型CTCs，上皮/間質混合型CTCs和間質型CTCs。上皮型CTCs：上皮標志物陽性；上皮/間質混合型CTCs：上皮標志物和間質型標志物陽性；間質型CTCs：間質型標志物陽性[2-3]。

1.2.6 NF-kB陽性表達判定標準 NF-kB陽性信號點呈紫色，位于細胞核內。陽性細胞數≥1即為NF-kB陽性表達。

1.3 統計方法

所有數據經SPSS 19.0統計學軟件處理，相關性評價采用Spearman雙變量相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTC檢測結果

12例肝癌患者外周血樣本中，有11例檢出CTCs，陽性率為91.7%（11/12），CTCs數量為1～26個，中位數6個。根據EMT標志物，CTCs可被分為3個亞群，包括上皮型CTCs，上皮/間質混合型CTCs和間質型CTCs。其中，8例肝癌患者外周血中檢出間質型CTCs，表達率為66.7%（8/12）。

2.2 NF-kB表達

NF-kB mRNA主要定位于細胞核，呈紫色信號點。在12例肝癌患者外周血樣本中NF-kB陽性表達10例，陽性表達率為83.3%（10/12）。

2.3 NF-kB表達與肝癌患者CTCs、間質型CTCs表達關系

對12例肝癌患者的NF-kB表達與CTCs、間質型CTCs表達關系進行統計學分析，結果表明，NF-kB陽性表達與CTCs檢出率、間質型CTCs陽性表達率均存在顯著正相關性（r=0.674，P<0.05；r=0.632，P<0.05），見表1。

3 討論

循環腫瘤細胞（CTCs）被稱為腫瘤轉移復發的“種子”，與腫瘤患者病情惡化密切相關。雖然血液中檢測到CTCs并不代表著必定形成轉移灶，但CTCs的數量及生物學狀態可為臨床治療和用藥提供重要依據，有助于盡早發現轉移復發高危人群，加強這部分患者的隨訪并及時采取相應的治療措施，對減少腫瘤的轉移復發、提高患者生存率具有重要意義[2]。

CTC檢測一般包括兩個過程：分離和鑒定，目前CTCs檢測技術很多，其中又以依賴腫瘤細胞表面上皮特異性粘附分子（EpCAM）表達而富集和鑒定CTC的方法為常見，如美國食品藥監局（FDA）審批通過的CellSeach系統。但是，CTCs發生上皮間質轉化（EMT）及其異質性使得傳統的依賴上皮特異性抗原表達來鑒定CTC的方法應用受到限制，只能檢測到EpCAM陽性的細胞，而無法檢測EpCAM陰性的細胞[3-6]。

與基于表皮標志物的CTC檢測技術相比，CanPatrol CTC二代富集技術具有更高的靈敏度，在5 mL血液樣本中可檢測到更多的CTCs，不僅可以檢測到上皮型CTCs，還可以檢測到間質型及上皮/間質混合型CTCs[7-8]。Zhao[8]應用CanPatrol CTC二代富集技術對1 203例結直腸癌患者的CTCs進行計數與分型，在1 046例患者中檢出CTCs，檢出率為86.9%，而CellSeach系統檢出率約為5%左右。該研究采用CanPatrol CTC二代富集技術，先使用過濾的方法分離CTCs，然后基于分支DNA信號擴增技術進行RNA原位雜交（RNA-ISH），通過EMT標志物對不同癌種中的CTCs進行了EMT分型，12例肝癌患者外周血樣本中，有11例檢出CTCs，檢出率為91.7%（11/12）。其中，8例肝癌患者外周血中檢出間質型CTCs，表達率為66.7%（8/12）。該結果證實了CanPatrol CTC二代富集技術具有高檢出率及可更全面檢測所有類型CTCs的特點。

NF-kB是由RelA（P65）、RelB、C-Rel、NF-kB1（P50）、NF-kB2（P52）組成，其編碼的產物由同源和各種異源的NF-kB/Rel蛋白二聚體構成，多為P50和P65，通過與其抑制蛋白IkB結合，參與下游信號轉導通路，激活一系列激酶，從而調控相關基因表達[1]。

NF-kB不僅參與了腫瘤的發生，而且與腫瘤轉移相關。徐沙沙等[9-10]報道了非小細胞肺癌（NSCLC）中NF-kB的表達與EMT密切相關，NF-kB可能協同Slug抑制E-cadherin表達，促進Vimentin表達，誘使NSCLC的EMT發生；此外，NF-kB還與分化程度（χ2=5.024，P<0.05）、有無淋巴結轉移（χ2=6.174，P<0.05）及腫瘤的分期（χ2=7.317，P<0.01）有關。

該研究觀察了NF-kB與CTCs的關系，初步研究表明肝癌外周血中NF-kB陽性表達與CTCs檢出率、間質型CTCs陽性表達率具有一定相關性，未來的研究應擴大樣本量并對患者進行隨訪觀察，進一步探討NF-kB、CTCs與肝癌患者臨床病理特征及預后之間的關系，以期研究NF-kB、CTCs在肝癌診斷、治療及預后的臨床價值。

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（收稿日期：2017-03-16）