異牛肝菌素通過阻斷SM22α泛素化降解抑制血管平滑肌細胞表型轉化

呂 品，范素芳，宋 楠，王璐琪，孫 勇，趙俊霞,*，張 巖,,*

（1.河北醫科大學基礎醫學院，河北 石家莊 050017；2. 河北省食品檢驗研究院 河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050071；3.北京食品科學研究院，中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

異牛肝菌素通過阻斷SM22α泛素化降解抑制血管平滑肌細胞表型轉化

呂 品1，范素芳2，宋 楠1，王璐琪1，孫 勇3，趙俊霞1,*，張 巖1,2,*

（1.河北醫科大學基礎醫學院，河北 石家莊 050017；2. 河北省食品檢驗研究院 河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050071；3.北京食品科學研究院，中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

從黃乳粘蓋牛肝菌（Suillus flavus）中分離得到的異牛肝菌素（iso-suillin）具有顯著的抗腫瘤活性，但其在心血管系統的功效尚不明確。本研究用不同濃度的異牛肝菌素預處理原代血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）24 h或48 h后，再采用血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）-BB處理細胞，細胞計數法檢測VSMC增殖活性；流式細胞術檢測細胞周期分布；Western blot分析檢測蛋白表達情況；免疫沉淀檢測平滑肌22 alpha（smooth muscle 22 alpha，SM22α）磷酸化和泛素化水平。結果顯示，異牛肝菌素顯著抑制PDGF-BB引發的VSMC增殖；上調分化標志蛋白SM22α表達，下調增殖相關蛋白PCNA表達；抑制SM22α磷酸化及其泛素化降解，且該過程可能與其阻斷蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）δ的活性有關。通過以上結果推測，異牛肝菌素通過抑制PKCδ的活性，降低SM22α磷酸化水平，阻止SM22α泛素化降解，進而抑制VSMC表型轉化，發揮血管保護的功能。

異牛肝菌素；血管平滑肌細胞；表型轉化；平滑肌22α（SM22α）

引文格式：

呂品, 范素芳, 宋楠, 等. 異牛肝菌素通過阻斷SM22α泛素化降解抑制血管平滑肌細胞表型轉化[J]. 食品科學, 2017, 38(15): 208-214. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715034. http://www.spkx.net.cn

Lü Pin, FAN Sufang, SONG Nan, et al. Iso-suillin inhibits VSMC phenotypic modulation via repressing ubiquitinationmediated SM22α degradation[J]. Food Science, 2017, 38(15): 208-214. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201715034. http://www.spkx.net.cn

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的表型轉化是高血壓、動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄等血管重構性疾病共同的病理生理學基礎。在血管損傷等因素刺激下，VSMC可從收縮（分化）表型轉化為合成（去分化）表型，喪失收縮功能并獲得增殖、遷移和分泌細胞外基質的能力，該過程是血管重構的根本原因和血管損傷病變復雜性的重要因素[1-3]。因此，抑制VSMC表型轉化對預防血管損傷性疾病具有重要的意義。

真菌可以產生多種次生代謝產物，其中聚異戊二烯酚類化合物表現出了很高的生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗感染和消炎止痛等[4-6]。本課題組于2014年從一種食藥兼用的大型真菌-黃乳粘蓋牛肝菌的石油醚相中純化出一種代謝產物，相對分子質量為440.29，化學名稱為3,6-二羥基-2-（2Z,6E,10E）-3,7,11,15-六甲基十六碳-2,6,10,14-四烯苯乙酯，與之前研究發現的牛肝菌素是同分異構體，命名為異牛肝菌素（iso-suillin）（圖1）。經過研究發現，異牛肝菌素具有較強的抗腫瘤活性，能夠有效抑制SMMC-7721、BGC、K562、A549等腫瘤細胞系的生長，與順鉑和5-氟尿嘧啶比較，異牛肝菌素表現出較強的抑瘤作用，且對正常人的淋巴細胞幾乎沒有毒性[7-9]。然而，異牛肝菌素在心血管系統中的作用尚不明確。

圖1 異牛肝菌素化學結構式Fig. 1 Chemical structure of iso-suillin

肌動蛋白（actin）相關蛋白平滑肌22 alpha（smooth muscle 22 alpha，SM22α），又稱轉凝（transgelin）蛋白，屬于calponin家族，主要表達于成體平滑肌組織。雖然SM22α缺失不影響生理條件下血管組織的正常發育和功能，但病理狀態下，它的功能是不可替代的。SM22α在損傷誘導的血管重塑性疾病中，如動脈粥樣硬化斑塊[10-11]、血管新生內膜[12-13]、血管鈣化[14-15]、主動脈夾層動脈瘤[16-17]等，表達急劇下調，且下調水平與血管損傷程度呈正相關，因此，SM22α表達降低已成為VSMC去分化的一種特異性標志物[12,18-20]。本課題組前期的研究結果顯示，血管緊張素（angiotensin，Ang）Ⅱ和血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）-BB等刺激因素可抑制VSMC分化標志物SM22α、SM α-actin、calponin、caldesmon等表達，進而誘導VSMC表型轉化[12,21-22]。各種刺激因素引起的SM22α表達降低，除了與SM22α的表達受抑有關外，其泛素化降解加快也是一個重要因素[21,23]，但影響其泛素化水平的藥物研究較少。本研究觀察異牛肝菌素對VSMC表型轉化的調節以及與SM22α泛素化降解的關聯，并對其分子機制進行初步探討，為該藥物在血管重塑性疾病的防治提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性SD大鼠（清潔級）由河北醫科大學實驗動物中心提供。

異牛肝菌素由本課題組提取，經高效液相色譜法檢驗純度為99.0%。

低糖DMEM培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國Gibco公司；PDGF-BB 美國R&D公司；MG132 美國Sigma公司；兔抗SM22α抗體 英國Abcam公司；ProteinA/G-瓊脂糖、小鼠抗增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、小鼠抗β-actin抗體、兔抗Ub抗體、小鼠抗p-Ser單克隆抗體美國Santa Cruz公司；兔抗蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）δ抗體、兔抗磷酸化（p）-PKCδ抗體 美國Cell Signaling公司。

1.2 儀器與設備

電泳槽、電泳儀、半干快速轉膜儀 美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統 美國GE公司；流式細胞儀 美國BD公司；自動細胞計數儀 美國Life Technologies公司；CO2培養箱 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 VSMC培養

選取80～100 g雄性SD大鼠（清潔級），用貼塊法分離培養胸腹主動脈中膜VSMC，置于含體積分數10% FBS的DMEM培養基中。待細胞生長至100%匯合后，用0.25 g/100 mL胰蛋白酶溶液消化傳代，取3～5 代細胞進行實驗。

1.3.2 VSMC增殖活性測定

采用細胞計數法，將細胞接種于96 孔板中，每孔100 μL，待細胞生長至50%匯合時，換用含體積分數1% FBS的DMEM培養基培養24 h（對照：0 μmol/L異牛肝菌素、0 μmol/L PDGF-BB），分別用0.0（單獨PDGF-BB處理為陰性對照）、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 μmol/L異牛肝菌素預處理細胞24 h 或48 h，然后給予PDGF-BB（20 ng/mL）刺激24 h。用細胞計數儀進行細胞計數，計算相對細胞數量。

1.3.3 流式細胞術分析

將細胞接種于細胞瓶中，待細胞生長至50%匯合時，換用含體積分數1% FBS的DMEM培養基培養24 h（對照組），用0（陰性對照組）、6、12、24 μmol/L異牛肝菌素預處理細胞24 h，然后給予PDGF-BB（20 ng/mL）刺激24 h。消化并收集細胞，生理鹽水洗滌3 次，70%乙醇固定。加入50 mg/L的碘化丙啶（propidium iodide，PI）DNA熒光染色，避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.3.4 VSMC總蛋白提取與Western blot分析

按文獻[21]常規方法收集和裂解細胞，取上清液體，用改良Lowry法進行蛋白定量。取等量的蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE），半干法將分離膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，5 g/100 mL脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后以遠紅外標記的熒光二抗室溫封閉1 h，洗膜后Odyssey遠紅外熒光成像系統掃描成像。

1.3.5 免疫沉淀分析

取200 μg細胞總蛋白與相應的抗體混合，4 ℃搖動混合過夜后加入20 μL ProteinA/G-agarose，4 ℃搖動混合2～4 h后，4 ℃、12 000 r/min離心1 min，洗滌后收集Protein A/G-抗原-抗體復合物進行Western blot分析。按文獻[21]常規方法，用兔抗SM22α抗體檢測SM22α的磷酸化水平；用兔抗Ub抗體檢測SM22α的泛素化水平。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 異牛肝菌素對VSMC表型轉化的影響

如圖2所示，與對照相比，PDGF-BB顯著促進細胞增殖。不同濃度異牛肝菌素預處理VSMC 24 h后，與陰性對照相比，1.5 μmol/L和3.0 μmol/L異牛肝菌素對VSMC增殖無顯著影響（P＞0.05），而6～24 μmol/L異牛肝菌素可極顯著抑制細胞增殖活性（P＜0.01）；不同濃度異牛肝菌素預處理VSMC 48 h后，1.5～24 μmol/L均可顯著抑制細胞增殖活性（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。上述結果表明，異牛肝菌素以時間和濃度依賴性方式抑制VSMC增殖。

圖2 異牛肝菌素對VSMC增殖的影響（n=3）Fig. 2 Effect of iso-suillin on the proliferation of VSMCs (n = 3)

圖3 流式細胞檢測異牛肝菌素對VSMC細胞周期分布的影響（n=3）Fig. 3 Effect of iso-suillin on cell cycle distribution of VSMC (n = 3)

由圖3可知，PDGF-BB處理24 h后，與對照相比，VSMC S期細胞數目增加，G0/G1期細胞數目減少；與陰性對照相比，隨異牛肝菌素濃度升高，G0/G1期細胞數量逐漸增加，而S期細胞數目顯著減少。該結果表明，異牛肝菌素可能通過誘導VSMC G0/G1期阻滯從而抑制細胞增殖活性。

圖4 Western blot檢測牛肝菌素對VSMC表型轉化的影響（n=3）Fig. 4 Effect of iso-suillin on VSMC phenotypic modulation (n=3)

從細胞計數中選取了一個濃度和一個時間點進行實驗（6 μmol/L異牛肝菌素預處理VSMC 24 h，PDGF-BB處理VSMC 24 h），Western blot分析結果如圖4所示，PDGF-BB處理VSMC 24 h顯著促進增殖相關蛋白PCNA表達，抑制分化相關蛋白SM22α表達，標志VSMC發生表型轉化；而6 μmol/L異牛肝菌素預處理VSMC 24 h后，PDGF-BB引發的PCNA表達上調和SM22α表達下調明顯受抑。提示，異牛肝菌素可抑制VSMC表型轉化。

2.2 異牛肝菌素上調SM22α表達的作用機制

圖5 異牛肝菌素對SM22α泛素化的影響（n=3）Fig. 5 Effect of iso-suillin on ubiquitination of SM22α (n = 3)

為進一步探究異牛肝菌素上調SM22α表達的可能機制，VSMC裂解液用抗SM22α抗體進行免疫沉淀（IP）后，用抗泛素化（ubiquitination，Ub）的抗體檢測泛素化SM22α水平（IB）。由圖5可知，VSMC經蛋白酶體抑制劑MG132（10 μmol/L）預處理2 h后，PDGF-BB處理VSMC 4 h，SM22α泛素化水平升高，而6 μmol/L異牛肝菌素預處理VSMC 24 h后，隨SM22α表達升高，PDGF-BB引發的SM22α泛素化水平顯著降低。上述結果表明，SM22α泛素化降解受到抑制可能是異牛肝菌素上調SM22α表達的機制之一。

2.3 異牛肝菌素抑制SM22α泛素化降解的作用機制

為明確異牛肝菌素抑制SM22α泛素化降解的上游機制，細胞裂解液用抗p-Ser抗體進行免疫沉淀（IP），用抗SM22α的抗體檢測磷酸化SM22α水平（IB）。由圖6可知，PDGF-BB作用于VSMC 30 min，SM22α磷酸化水平明顯升高，而6 μmol/L異牛肝菌素預處理VSMC 24 h后，PDGF-BB引發的SM22α磷酸化水平顯著降低。

圖6 異牛肝菌素對SM22α磷酸化的影響（n=3）Fig. 6 Effect of iso-suillin on phosphorylation of SM22α (n = 3)

2.4 異牛肝菌素抑制SM22α磷酸化的作用機制

圖7 異牛肝菌素對PKCδ磷酸化的影響（n=3）Fig. 7 Effect of iso-suillin on phosphorylation of PKCδ (n = 3)

本課題組前期實驗證實PKCδ信號通路是SM22α磷酸化所必需的[21]。由圖7可知，PDGF-BB作用于VSMC 10 min，PKCδ磷酸化水平升高，而6 μmol/L異牛肝菌素預處理VSMC 24 h后，PDGF-BB誘導的PKCδ磷酸化水平明顯降低。表明，異牛肝菌素可能通過阻斷PKCδ活化抑制SM22α磷酸化。

3 討 論

VSMC表型轉化是動脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管損傷性疾病發生發展的關鍵環節，研究和開發抗細胞增殖和遷移的藥物，對動脈粥樣硬化的防治具有重要意義。異戊二烯基酚類化合物（prenylphenols）是一類相對分子質量較低的有機化合物，主要從植物和真菌的代謝產物中分離提取或人工半合成。其基本結構含有聚合異戊二烯分子和苯酚，具有多種潛在的生物活性和藥用價值，包括抗氧化、抗腫瘤、鎮痛、減少炎癥損害、降血壓、降血脂、降低膽固醇含量、改善人體微循環、防止心腦血管疾病的發生、抗衰老、提高機體耐受力、增強免疫功能等效果。異牛肝菌素作為一種從黃乳粘蓋牛肝菌中提取的聚異戊二烯酚類化合物，能抑制多種腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡[7-9]，但其在脈管系統中的功能尚不明確。本研究發現，異牛肝菌素能夠明顯改變VSMC細胞周期分布，誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細胞增殖活性，降低增殖相關蛋白表達，促進分化標志蛋白SM22α表達，表明異牛肝菌素可抑制VSMC表型轉化，提示異牛肝菌素對于血管重塑性疾病的治療有著巨大的潛力。

SM22α主要表達于收縮型VSMC，我們和國內外實驗室大量的研究表明，當遭受損傷刺激或體外培養時，VSMC發生表型轉化而快速去分化，該過程的一個重要標志就是SM22α表達急劇下調[12,24]。Feil等[10]證實，高脂飼喂的Sm22α基因敲除（Sm22α-/-型）小鼠的動脈粥樣硬化斑塊的面積和VSMC增殖活性都大大高于野生型小鼠，該過程可能與SM22α影響了其他類型的細胞在血管病變部位的募集和增殖有關，表明在動脈粥樣硬化發生過程中SM22α可通過調節VSMC表型轉化及增殖活性影響動脈粥樣硬化病變的發生與發展。本課題組前期的研究證實，過表達SM22α顯著抑制PDGF-BB誘導的VSMC Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信號級聯；而敲低SM22α后，該信號通路被激活。進一步研究顯示，高水平的SM22α通過與Ras相互作用抑制Ras的募集和Raf-1的活化，進而阻斷MAPK信號通路。體內研究顯示，過表達SM22α通過阻斷MAPK信號通路削弱球囊損傷誘導的頸總動脈新生內膜形成[13]。與野生型相比，Sm22α-/-型小鼠頸動脈內皮剝脫后軟骨形成標志基因，包括Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、骨橋蛋白等，表達明顯升高，與VSMC分化標志基因表達下調相一致，表明SM22α缺失可通過促進VSMC向成骨細胞轉化，誘發血管鈣化[14-15]。Sm22α基因敲除后，頸總動脈炎性因子表達升高，并且通過促進ROS生成激活NF-κB（nuclear factor，NF）-κB信號通路，導致血管組織對炎性反應異常敏感而喪失抗炎能力，這可能與SM22α缺失導致的細胞骨架重塑有關[25]；我們實驗室前期的研究揭示了SM22α下調激活NF-κB的可能機制，過表達SM22α通過與NF-κB的阻遏物（inhibitor of NF-κB，IκB）形成復合物，抑制IκB的磷酸化和降解，使IκB和NF-κB緊密結合阻止NF-κB向核內轉位，從而阻斷NF-κB活化導致的血管炎癥反應，抑制結扎誘導的新生內膜形成[11,26]。上述發現闡明了VSMC以SM22α依賴的方式保持其收縮表型的機制，揭示了SM22α調制VSMC表型轉化的生物學功能。研究表明，生長因子等刺激因素不僅誘導SM22α等分化標志基因表達下調，而且還與它們的泛素化降解加快直接相關[27]。我們近年來的研究顯示，AngⅡ和PDGF-BB可誘導SM22α泛素化水平升高和降解加速[21,23]，但影響其泛素化水平的藥物研究較少。本研究發現，異牛肝菌素可顯著降低PDGF-BB誘導的SM22α泛素化水平升高，表明異牛肝菌素上調SM22α表達可能與其降低SM22α泛素化降解有關。

蛋白的翻譯后修飾作為高度靈活的開關，調控著蛋白的活性、表達及其亞細胞定位。磷酸化和泛素化修飾是真核細胞蛋白質重要的翻譯后修飾方式，磷酸化是調節細胞信號轉導的主要機制，而泛素化在蛋白質降解中發揮重要作用，二者存在交互應答[28]。通常情況下，蛋白質泛素化修飾有賴于其磷酸化。E3泛素連接酶比較容易識別磷酸化的蛋白質，進而對磷酸化的底物進行泛素化標記，啟動蛋白質經由蛋白酶體途徑進行降解；另外，蛋白質的磷酸化還能直接調控各種泛素連接酶的活性，從而影響酶和底物的親和力，改變泛素連接酶的催化能力[29-30]。因此，蛋白質磷酸化修飾是其泛素化降解的關鍵環節。本課題組前期的結果已證實，AngⅡ經由PKCδ-SM22α磷酸化-SM22α泛素化軸加速SM22α降解[21]。本實驗發現，異牛肝菌素預處理VSMC后，隨PKCδ的活性降低，PDGF-BB誘導的SM22α磷酸化水平亦明顯下降。推測，異牛肝菌素可能通過阻斷PKCδ信號通路，抑制SM22α磷酸化，以及由此導致的SM22α泛素化降解，進而穩定平滑肌細胞的收縮表型。

綜上所述，異牛肝菌素通過削弱PKCδ活性，降低SM22α磷酸化水平，進而阻斷SM22α的泛素化降解，發揮抑制VSMC表型轉化的功能，證實SM22α泛素化降解介導的VSMC表型轉化可能是異牛肝菌素發揮血管保護作用的重要靶點。

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Iso-Suillin Inhibits VSMC Phenotypic Modulation via Repressing Ubiquitination-Mediated SM22α Degradation

Lü Pin1, FAN Sufang2, SONG Nan1, WANG Luqi1, SUN Yong3, ZHAO Junxia1,*, ZHANG Yan1,2,* (1. College of Basic Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China；
2. Hebei Food Safety Key Laboratory, Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050071, China; 3. China Meat Research Center, Beijing Academy of Food Sciences, Beijing 100068, China)

Iso-suillin, a phenolic compound isolated from Suillus flavus, has significant anti-tumor activity. However, the role of iso-suillin in cardiovascular system remains unclear. Herein, primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) were pretreated with iso-suillin for 24 or 48 h, and then stimulated by platelet-derived growth factor (PDGF)-BB. The cell proliferation was evaluated by cell counting. VSMC cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry. In addition, Western blot was used to examine protein expression, and immuneprecipitation analysis was used to identify the phosphorylation and ubiquitination of smooth muscle 22 alpha (SM22α). The results showed that iso-suillin inhibited PDGF-BB-induced VSMC proliferation. Iso-suillin increased the expression of SM22α (a marker of cell differentiation), and reduced the level of PCNA. Furthermore, iso-suillin decreased the levels of phosphorylated and ubiquitinated SM22α upon PDGF-BB treatment, which may be associated with iso-suillin-decreased protein kinase C (PKC) δ activity. Collectively, these data demonstrated that iso-suillin prevented VSMC phenotype transformation through decreasing PKCδ-mediated SM22α degradation via the ubiquitin-proteasome pathway in VSMCs.

iso-suillin; vascular smooth muscle cells; phenotypic modulation; smooth muscle 22α (SM22α)

10.7506/spkx1002-6630-201715034

R285

A

1002-6630（2017）15-0208-07

2017-04-08

“十三五”國家重點研發計劃重點專項（2016YFF0202300）；科技部質檢行業公益專項（201510208-08）；國家自然科學基金青年科學基金項目（81300225）；河北省自然科學基金資助項目（H2015206467）；河北省高等學校優秀青年基金項目（YQ2013018）

呂品（1979—），女，副教授，博士，研究方向為血管重塑性疾病的發病機制。E-mail：lvpinzy@163.com

*通信作者：趙俊霞（1966—），女，教授，博士，研究方向為天然藥物活性物質與功能。E-mail：zhaojunxia@hebmu.edu.cn張巖（1979—），男，正高級工程師，博士，研究方向為食品安全。E-mail：snowwinglv@126.com