3種酒類酒球菌發酵性能研究及其對櫻桃酒品質的影響

車長遠，董雪，張沁芳，王舒，胡瀟，李杰，董慶苓，孫舒揚*，趙玉平

1(魯東大學 食品工程學院，山東 煙臺，264025)2(煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺，264025)

生產與科研經驗

3種酒類酒球菌發酵性能研究及其對櫻桃酒品質的影響

車長遠1，董雪1，張沁芳2，王舒1，胡瀟1，李杰1，董慶苓1，孫舒揚1*，趙玉平2

1(魯東大學 食品工程學院，山東 煙臺，264025)2(煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺，264025)

在櫻桃酒的生產過程中，蘋果酸-乳酸發酵(malolactic fermentation, MLF)是降低酒體酸度、改善口感、提升生物穩定性、提高風味復雜性的重要過程，因此，選擇合適的乳酸菌株觸發MLF對于保障櫻桃酒的品質和安全性十分重要。以市售的3種酒類酒球菌(Enoferm ALPHA、VTT.D、Lalvin VP41)為研究對象，比較它們在蘋果酸-乳酸發酵過程中的增殖情況，以及它們對櫻桃酒基本理化指標、揮發性組分以及生物胺含量的影響，并據此選擇適宜的發酵乳酸菌株。研究結果表明，3株酒類酒球菌均可在20天內完成降酸過程，生物胺含量均在可控范圍，對酒體成分的影響也不存在顯著性差異。Lalvin VP41能夠增加櫻桃酒多種揮發性物質的合成量，如苯乙醇、丁酸乙酯、乙酸異戊酯和α-松油醇等，從而增強了櫻桃酒的果香和花香特征，因此，其更適宜作為櫻桃酒發酵的降酸菌株。

酒類酒球菌；櫻桃酒；揮發性組分；生物胺

櫻桃酒富含礦物質、維生素和多酚等保健成分，具有促進血液循環和機體代謝、改善心腦血管功能等功效[1-2]。櫻桃酒的釀造是一個復雜的微生物學過程，包括酒精發酵和蘋果酸-乳酸發酵(malolactic fermentation，MLF)2個主要的發酵階段。酒精發酵是利用酵母菌將果實內的大部分糖轉為乙醇和CO2，同時生成甘油、高級醇、酯類等代謝產物。酒精發酵結束后，櫻桃酒還面臨著降解有機酸的問題。適量的有機酸可以賦予櫻桃酒醇厚感和清爽感，抑制雜菌的活動，但是當有機酸含量較高時，會給人以酸澀、粗糙的感覺[3-4]。酒精發酵剛結束時，櫻桃酒中含有大量的蘋果酸和檸檬酸，這些有機酸帶有強烈的刺激味，嚴重影響櫻桃酒的口感。MLF過程是在乳酸菌的作用下，將L-蘋果酸轉化為L-乳酸，具有降低櫻桃酒酸度和澀度、改善口感、增強微生物穩定性、增加香氣復雜度的作用[5-6]。

MLF可以自然發生，也可以通過人為接種乳酸菌來啟動。自發的MLF在發酵時間上具有不確定性，而且不利于櫻桃酒的品質控制和安全控制，因此通過人為添加乳酸菌啟動MLF是目前櫻桃酒生產中的重要工序。MLF由多種降酸乳酸菌完成，這些乳酸菌主要分屬于4個屬，即酒球菌(Oenococcus)、乳桿菌(Lactobacillus)、片球菌(Pediocooccus)和明串珠菌(Leuconostoc)。其中酒類酒球菌(Oenococcusoeni)是公認的最優良的蘋果酸-乳酸發酵菌株[7-8]。在整個MLF過程中具有生長速率快、耐SO2、發酵平穩且完全、最終代謝產物能賦予櫻桃酒特有的風味等優點，且能保證櫻桃酒的安全性。本實驗對3種商業化酒類酒球菌(Enoferm ALPHA、VTT.D、Lalvin VP41)進行測試，通過比較它們的發酵進程，對櫻桃酒基本理化指標、生物胺含量以及揮發性組分的影響，確定適宜的蘋果酸-乳酸發酵菌株。

1 材料與方法

1.1材料

實驗用櫻桃品種為拉賓斯，采自煙臺，2016年6月成熟并收集。其基本化學成分如下：總糖 159 g/L，可溶性固形物16.6%，滴定酸5.8 g/L，pH 3.78。

1.2釀造菌種

釀酒酵母Lalvin BM 4×4，酒類酒球菌Enoferm ALPHA、VTT.D、Lalvin VP41,加拿大Lallemand公司。

1.3試劑

2-辛醇、丹磺酰氯、甲醇、香氣標準品、生物胺標準品：色譜純，美國Sigma 公司；L-蘋果酸檢測試劑盒，德國Biopharm公司；氯化鈉、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀：分析純，國藥集團；其他試劑均為國產分析純。

1.4儀器

氣相色譜質譜聯用儀(Agilent 6890N -MS 5975)，美國Agilent公司；LC-20A高效液相色譜儀(配紫外檢測器)，日本Shimadzu公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭，美國 Supelco公司；FE20K pH計，瑞士梅特勒-托利多公司；DC-12型氮吹儀，上海安譜科學儀器有限公司；Cary60紫外可見分光光度計，美國Agilent公司。

1.5實驗方法

1.5.1 櫻桃酒發酵工藝

櫻桃果實采摘后清洗、破碎，輸入發酵罐中，102 ℃滅菌10 min，并加入50 mg/L SO2抑制果漿氧化，再加入果膠酶(30 mg/L)反應6 h。添加適量蔗糖使還原糖達到210 g/L，然后接種釀酒酵母Lalvin BM 4×4(300 mg/L)，并于25 ℃持續發酵7～8 d。酒精發酵過程中，監測果漿中糖度、溫度變化，定期攪拌循環。當櫻桃酒總糖小于4 g/L時，離心分離出釀酒酵母，終止酒精發酵。而后分別接種3株酒類酒球菌(10 mg/L)進行蘋果酸-乳酸發酵。MLF在20 ℃下進行，監測櫻桃酒中酒酒球菌和蘋果酸的變化。待蘋果酸濃度低于0.5 g/L，離心去除酒酒球菌終止蘋果酸乳酸發酵，而后測定櫻桃酒的基本理化指標、揮發性香氣組分以及生物胺含量。

1.5.2 分析方法

還原糖、總酸、酒精度、揮發酸的測定方法參照《葡萄酒、果酒通用分析方法》(GB/T 15038—2006)執行。其中：還原糖采用斐林試劑法測定，以葡萄糖計；酒精度采用密度瓶法；pH 通過pH計測定；揮發酸和總酸均通過氫氧化鈉滴定法測定，分別以乙酸和蘋果酸計。L-蘋果酸采用L-蘋果酸檢測試劑盒測定。

酵母活細胞數采用梯度稀釋法檢測。在酒精發酵過程中，間隔12 h取樣，用無菌水梯度稀釋后(稀釋倍數為101～108)，涂布于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養基(YPD)，于25 ℃好氧條件下培養2 d后計數[7]。菌體量的表示方法為CFU/mL。

乳酸菌活細胞計數也采用梯度稀釋法測定。在蘋果酸-乳酸發酵過程中，定時取樣。將樣品櫻桃酒用無菌生理鹽水梯度稀釋，稀釋倍數為101～108，然后涂布于含有200 μg/mL制霉菌素的MRS培養基上。培養皿置于30 ℃厭氧條件下培養3 d后計數。菌體量的表示方法為CFU/mL。

生物胺測定方法參照國標《食品中生物胺含量的測定》(GB/T 5009.208—2008)執行。

1.5.3 揮發性香氣物質的萃取和分析方法

15 mL的頂空瓶中加入5 mL櫻桃酒酒樣和1.5 g NaCl、5 μL 2-辛醇(內標)之后加蓋密封，再將頂空瓶放入30 ℃的水浴中預平衡10 min，將老化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插在樣品瓶上，吸附30 min后拔出，再將萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，在220 ℃解吸附5 min，進行GC/MS檢測。色譜柱為DB-Wax(60 m×0.25 mm，0.25 m i.d.)，不分流進樣。采用程序升溫法，初始溫度為40 ℃保持2 min，以6 ℃/min的速度升至230 ℃，并持續15 min。載氣為氦氣，體積流量為2 mL/min。質譜儀在70 eV的電子沖擊模式(EI)下操作，掃描范圍為34～348 m/Z，離子源溫度為230 ℃。揮發性化合物定性分析通過比較來自NIST數據庫(安捷倫)的質譜光譜數據和已經被文獻報道的保留指數(RI)來確定。

揮發性組分的定量分析采用標準曲線法。標準曲線的做法是：用標準樣品配制成一系列不同濃度的溶液，在與待測組分相同的色譜條件下，等體積準確進樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標準曲線。

1.6數據處理

使用 SPSS v13.0(SPSS 公司，美國)對所有數據進行方差分析。利用方差分析和鄧肯的多重比較測試實驗來確定酒樣指標之間的差異。所有的變量都經標準化(1/Sdev)處理。

2 結果與分析

2.1酒精發酵和蘋果酸-乳酸發酵進程

在發酵初期，釀酒酵母Lalvin BM 4×4需要12 h左右的時間適應發酵醪液，而后開始迅速增殖，即進入對數生長期。該釀酒酵母在發酵60 h時進入穩定期，活細胞數達到最高值(5.57 × 107CFU/mL)，并維持了近30 h。在發酵后期，由于櫻桃漿液中的糖分和營養素已被大量消耗，剩余營養素不足，導致酵母開始衰老死亡，數量逐漸減少。

圖1 釀酒酵母增殖和還原糖代謝過程Fig.1 The evolution of BM 4 × 4 and consumption of reducing sugars during alcoholic fermentation

在酒精發酵結束后，分別接入3種商業化酒類酒球菌(Enoferm ALPHA、VTT.D、Lalvin VP41)啟動MLF，進行生物降酸實驗(圖2、圖3)。3株乳酸菌也表現出良好的適應性，能夠較快地觸發MLF。Enoferm ALPHA、Lalvin VP41的延滯期均為2天，VTT.D的延滯期只有1天，而后3種酒類酒球菌都進入對數生長期，開始了快速增殖。在蘋果酸-乳酸發酵第11天，Enoferm ALPHA和VTT.D的活細胞數均達到了最高，分別為5.06 × 107CFU/mL和3.98 × 107CFU/mL，Lalvin VP41則在發酵第13天達到最大生物量，為6.33 × 107CFU/mL。隨后，3種酒酒球菌進入衰亡期，活細胞數出現大幅下降。

圖3 蘋果酸乳酸發酵中蘋果酸的代謝過程Fig.3 The consumption of malic acid during malolactic fermentation

就蘋果酸的代謝過程而言，在發酵初期，接種3株酒類酒球菌的櫻桃酒中的蘋果酸的濃度幾乎都未變化，出現了短暫的延滯。待Enoferm ALPHA、VTT.D、Lalvin VP41適應酒體環境后，蘋果酸的含量開始下降。接種VTT.D的櫻桃酒最早開始進行降酸；接種Enoferm ALPHA和Lalvin VP41的櫻桃酒雖然前期降酸速度較慢，但是后期速度加快。MLF持續時間與所選用的酒酒球菌有關，VTT.D耗時最短，整個MLF持續17天，而Lalvin VP41和Enoferm ALPHA則需要19天使蘋果酸降至預定濃度之下。

2.2酒類酒球菌對櫻桃酒基本成分的影響

蘋果酸-乳酸發酵結束后，去除發酵殘渣，獲得澄清櫻桃酒，而后檢測酒體的各種基本理化指標，包括酒精度、還原糖、pH、滴定酸、揮發酸和蘋果酸含量，具體結果列于表1中。

表1 接種不同酒類酒球菌的櫻桃酒的基本酒體成分

注：同行字母(a-c)代表顯著性差異(P< 0.05)。

無論接種哪株酒類酒球菌，最終獲得的櫻桃酒的還原糖含量都低于4 g/L，說明櫻桃酒已發酵完全，成為干型紅櫻桃酒。測試酒樣的酒精度在10.2%～10.5%vol，pH值在pH 3.96～3.99，滴定酸含量在4.65～4.72 g/L，僅存在微小差異。根據葡萄酒國家標準(GB15037—2006)，揮發酸的質量濃度必須低于1.2 g/L，本研究中3種櫻桃酒的揮發酸含量均低于0.45 g/L，符合國標規定，但是接種Enoferm ALPHA的櫻桃酒的該指標濃度顯著高于其他2種酒樣。蘋果酸含量在MLF后已降低至0.39～0.43 g/L，說明3株酒類酒球菌分解蘋果酸的能力相當，不存在顯著性差異。

2.3酒類酒球菌對生物胺含量的影響

生物胺是一類含氮的、低分子量的堿性化合物，廣泛存在于富含蛋白質的食品和含酒精的發酵飲料中[10-11]。它主要通過微生物對氨基酸脫羧作用或氨基酸轉氨酶對醛類物質轉氨作用生成。果酒中的生物胺主要有組胺、酪胺、苯乙胺、精胺等，當這些生物胺過量攝入時，可致使人體出現頭痛、呼吸紊亂、心悸、血壓變化等應激反應[12-14]，嚴重情況下，可引起大腦出血，甚至死亡。生物胺中以組胺對人體健康的危害最大，其次是酪胺；腐胺和尸胺毒性也較大，并且可以增強組胺的毒性。目前，部分國家已制定了嚴格的食品(葡萄酒)中的組胺限量標準，如法國不得高于8 mg/L，比利時不得高于5～6 mg/L，德國不得高于2 mg/L[12]。

生物胺屬于果酒釀造過程中不良代謝物，其含量與水果品種、果實衛生狀況、釀造工藝、儲存條件等諸多因素相關[13]。在果酒的生產過程中，諸多環節都有可能導致生物胺的形成或積累，其中蘋果酸-乳酸發酵是果酒生物胺形成的最主要的階段[14-15]。果酒中的乳酸菌不僅能夠分解蘋果酸，而且還會對酒中的氨基酸進行脫羧反應，產生生物胺。

表2 接種不同酒類酒球菌的櫻桃酒的生物胺含量

注：同行字母(a-c)代表顯著性差異(P<0.05)。

筆者檢測和比對了接種3株酒類酒球菌的櫻桃酒中的生物胺的種類和含量，結果列于表2中。3種櫻桃酒中均檢出7種生物胺，分別是色胺、苯乙胺、尸胺、精胺、組胺、酪胺和亞精胺。精胺是櫻桃酒中含量最高的生物胺，在接種Enoferm ALPHA的櫻桃酒中達到了11.98 mg/L，在使用VTT.D和Lalvin VP41的櫻桃酒中也分別達到了7.36 mg/L和5.12 mg/L。酪胺是櫻桃酒中含量僅次于精胺的生物胺，在接種Enoferm ALPHA、VTT.D和Lalvin VP41的酒樣中含量分別達到了3.45、1.84、2.66 mg/L。其他生物胺的含量均較低，不超過2 mg/L。組胺在3種櫻桃酒中的含量介于0.49～0.91 mg/L之間，低于歐美等國對組胺限量標準。以上結果說明三株酒類酒球菌均為低產生物胺的安全菌株，可以在櫻桃酒應用。但是就三者之間相互比較，我們發現Lalvin VP41合成的生物胺總量最低，因此安全性最高。

2.4酒類酒球菌對揮發性組分的影響

櫻桃酒的香氣是由揮發性醇類、酸類、酯類、醛酮類和萜烯類等多種物質的香氣復合組成[16-20]，主要來自櫻桃果實本身、發酵過程和陳釀過程。本研究對櫻桃酒的主要的揮發性香氣組分也進行了定性和定量測定，以明確不同的酒類酒球菌對櫻桃酒芳香品質的影響。采用HS-SPME和GC-MS技術對3種櫻桃酒的揮發性組分進行萃取和檢測，結果如表3所示。

表3 接種不同酒類酒球菌的櫻桃酒的揮發性香氣組分含量 單位：mg/L

注：同行字母(a-c)代表顯著性差異(p< 0.05)。

3種酒類酒球菌發酵得到的櫻桃酒的揮發性組分大致相同，主要分屬于揮發性醇類、酯類、酸類、醛酮類和萜烯類化合物，但是含量差異較大。據此可以推斷，不同的酒類酒球菌可能會對櫻桃酒的芳香品質產生重要影響，使其風味特征有所改變。

Lalvin VP41促進了多種揮發性醇類、酯類和萜烯類化合物的合成，特別是苯乙醇、丁酸乙酯、乙酸異戊酯和α-松油醇。這些芳香化合物具有花香或果香類香氣特征，如丁酸乙酯有類似草莓的香氣，乙酸異戊酯能散發出類似香蕉的香氣，α-松油醇具有丁香氣味[21-22]。由于這些芳香化合物的存在，會賦予Lalvin VP41櫻桃酒更濃郁的花香和果香香氣。某些揮發性酸類化合物，如乙酸、己酸等，其含量在接種VTT.D的櫻桃酒中較高。乙酸具有酸味，己酸具有油脂味，濃度較低時能夠豐富櫻桃酒的風味特征，但是濃度過高則有可能帶來負面影響[23-24]，導致櫻桃酒出現酸敗或油膩的異味。VTT.D櫻桃酒中這2種物質含量雖然較高，但其濃度低于閾值或僅少量超過，因而不會對酒體產生負面影響。Enoferm ALPHA 也促進了很多芳香化合物的形成，如苯乙醇、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯等，但其增加幅度不及Lalvin VP41。總之，Lalvin VP41促進了揮發性酯類和萜烯類化合物的釋放，香氣總量高于其他2種酒類酒球菌的櫻桃酒，因而賦予酒樣更濃郁的花香和果香，提高了櫻桃酒的芳香特性和風味特性，具有在櫻桃酒中應用的價值。

3 結論

本研究選取了3種市售的酒類酒球菌(Enoferm ALPHA、VTT.D、Lalvin VP41)啟動蘋果酸-乳酸發酵，并觀察它們在MLF過程中的變化及蘋果酸的代謝過程。結果顯示，3種酒類酒球菌均能較好的適應櫻桃酒的酒體環境，快速觸發MLF，在3周內可將蘋果酸濃度降低至0.5 g/L以下。MLF發酵結束后，離心去除酒類酒球菌，獲得澄清酒體，而后檢測櫻桃酒的基本理化指標、揮發性組分及生物胺含量。研究結果表明，接種3種酒類酒球菌的櫻桃酒的酒體組成非常相近，僅有微小差異。生物胺中毒性最高的組胺在3種櫻桃酒中的含量均不超過2 mg/L，說明本研究獲得的櫻桃酒均具有較高的安全性。接種Enoferm ALPHA 的櫻桃酒的生物胺總量高于其他2種櫻桃酒。對揮發性香氣組分的檢測結果表明，Lalvin VP41能夠大幅增加苯乙醇、丁酸乙酯、乙酸異戊酯和α-松油醇等揮發性組分的產量，進而賦予櫻桃酒更濃郁的果香和花香，提高櫻桃酒的芳香特性。基于以上發現，Lalvin VP41更適宜作為櫻桃酒發酵的降酸菌株。

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ComparisonoffermentativeperformancesofthreeOenococcusoenistrainsandtheirinfluencesonthequalityofcherrywines

CHE Chang-yuan1,DONG Xue1,ZHANG Qin-fang2,WANG Shu1, HU Xiao1,LI Jie1,DONG Qing-ling1,SUN Shu-yang1*,ZHAO Yu-ping2

1(School of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China) 2(College of Life Sciences, Yantai University, Yantai 264025, China)

Malolactic fermentation (MLF) is vital for cherry wine production, since it can reduce the wine’s acidity, improve the mouth feel, enhance the biological stability and improve the wine’s flavor complexity. In the present study, three commercialOenococcusoenistrains were used as candidates to compare their evolutions during MLF and their influences on the compositional profile, volatile profile and biogenic amine contents of cherry wines. Obtained results demonstrated that all the MLF processes involving the threeO.oenistrains were finished within 20 days, and no significant differences or only slight differences were observed in the basic composition and biogenic amine levels among these cherry wines. Moreover,Lalvin VP41 was found to significantly boost the production of several volatile compounds in cherry wines derived from this strain, such as 2-phenylethanol, ethyl butyrate, 3-methylbutyl acetate and α-terpineol, and therefore reinforced the wine’s fruity and floral characters. Based on above findings, LalvinVP41 was selected as the most suitableO.oenistrain for the production of cherry wines.

Oenococcusoeni; cherry wine; volatile compounds; biogenic amine

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013802

碩士，講師(孫舒揚副教授為通訊作者，E-mail：sysun81@aliyun.com)。

國家自然科學基金(31501577)

2017-01-10，改回日期：2017-03-07