苦蕎蛋白對腸道有害菌生長抑制機理研究

李恩偉

(山西省食品工業研究所，山西太原 030024)

苦蕎蛋白對腸道有害菌生長抑制機理研究

李恩偉

(山西省食品工業研究所，山西太原 030024)

本文以水溶性苦蕎蛋白為研究對象,利用體外模擬發酵,通過對苦蕎蛋白作用下小鼠糞便發酵液中pH、短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的含量以及有害菌(腸球菌、腸桿菌、產氣莢膜梭菌)的數量進行測定,對苦蕎蛋白抑制腸道有害菌群生長機理進行了初步研究。結果表明:添加不同濃度的苦蕎蛋白與對照組相比,均可以有效降低有害菌的數量,其中高劑量組分別使腸球菌、腸桿菌和產氣莢膜梭菌減少了65%、72%和78%(32 h);同時,不同劑量組的苦蕎蛋白使小鼠糞便發酵液pH分別下降了35%、39%、40%(32 h)。此外,高劑量組的苦蕎蛋白較對照組分別使乙酸、丙酸、丁酸及乳酸的濃度增加了8.94、33.77、27.34、25.55倍(32 h)。綜上所述,苦蕎蛋白能夠提高腸道中短鏈脂肪酸含量,從而降低腸道環境的pH,抑制腸道有害菌(腸球菌、腸桿菌、產氣莢膜梭菌)的生長。

苦蕎蛋白,體外模擬,抑制,pH,短鏈脂肪酸(SCFAs)

腸道菌群被認為是機體的一個重要“器官”,其組成和數量在維持人體健康中起重要作用,且主要由益生菌和有害菌(條件致病菌和病原菌)組成[7]。而有害菌是腸道中的非優勢菌群,其在腸道中只占較少的比例,其中腸球菌、腸桿菌以及產氣莢膜梭菌等是腸道中主要的有害菌,它們能夠將食物中的一些成分變為多種腐敗物質(如:胺、吲哚、酚類)、有毒及致癌物質(如:微生物毒素、硝基化合物)等,從而引起某些腸道疾病的發生[8-10]。研究發現,花生蛋白對腸球菌、腸桿菌、產氣莢膜梭菌的生長具有明顯的抑制作用[11]。目前,對于苦蕎蛋白的研究主要集中在降低膽固醇、調節血脂以及其對益生菌增殖作用等方面,而對于其在腸道有害菌方面的研究則鮮有報道。

因此,本文以苦蕎蛋白為研究對象,通過模擬結腸發酵進行體外培養,從苦蕎蛋白對腸道有害菌(腸球菌、腸桿菌、產氣莢膜梭菌)的生長的抑制影響、小鼠糞便發酵液pH以及短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的含量三個方面研究其對腸道有害菌生長及抑制作用的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豐1號苦蕎 購于山西省左云縣;SPF級C57BL/6小鼠45只 購于上海斯萊克實驗動物有限公司;L-半胱氨酸鹽酸鹽、膽鹽、維生素K1、氯高鐵血紅素、刃天青、胃蛋白酶(≥3000 U/g)、胰酶(≥4000 U/g)、豬膽汁粉,均為BR級 購于上海寶曼生物科技有限公司;伊紅美藍瓊脂(EMB)、胰月示-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂基礎、膽汁七葉苷疊氮鈉、D-環絲氨酸、50%卵黃乳液 購于青島海博生物技術有限公司;乙酸、丙酸、丁酸、乳酸,均為色譜純 購于上海麥克林生化科技有限公司;酪蛋白、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏,均為AR級 購于國藥集團化學試劑(上海)有限公司;其他試劑均為分析純。

體外模擬基礎培養基的制備(1 L):參考Mao Sheng-yong等人[12]的方法,并略作修改。

PBS:磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline),分別配制0.01 mol/L和0.1 mol/L、pH7.0的PBS。其中將配制好的PBS(0.1 mol/L,pH7.0)經高壓滅菌后,置于厭氧培養箱中37 ℃過夜,用于稀釋腸道內容物。

GCMS-TQ8040氣相色譜質譜聯用儀 日本島津公司;YQX-II厭氧培養箱 上海龍躍儀器設備有限公司;3-18K高速冷凍離心機 Sigma儀器有限公司;冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;SW-CJ-IFD垂直潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司。

二維超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術鑒定氯化琥珀膽堿原料藥中的雜質 ………………………… 陳 紅等（7）：941

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗小鼠分組 SPF級C57BL/6小鼠購買后于SPF級動物房內單籠飼養,飼養溫度(25±1.0) ℃,濕度 50%±1.0% RH,并喂食2周以適應環境。在此期間,自由進食和飲水(飲用水121 ℃、20 min滅菌,基礎飼料和墊料紫外照射30 min殺菌)。然后,將小鼠隨機分為五組,空白對照組喂食基礎飼料，酪蛋白組喂食酪蛋白添加量1 mg/mL的飼料,其余三組小鼠按苦蕎蛋白添加量1、3、5 mg/mL將小鼠分為低、中、高劑量組。

1.2.2 苦蕎蛋白的制備 參考郭曉娜等人[13]的方法并略作修改?？嗍w籽粒粉碎后過篩,脫脂24 h;取100 g脫脂苦蕎粉以料液比1∶10用0.01 mol/L,pH7.0的PBS溶解,在磁力攪拌器上攪拌2 h;在4 ℃條件下,4000 r/min離心30 min,并向上清液中加入(NH4)2SO4使其濃度為40%,攪拌60 min;在4 ℃條件下,10000 r/min離心15 min,并向上清液中加入(NH4)2SO4使其濃度為80%,攪拌60 min;在4 ℃條件下,10000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀用少量去離子水復溶;然后將其加入到透析袋中進行透析48 h(每4 h換水一次),透析后進行凍干(-70 ℃,24 h),凍干粉保存備用。

1.2.3 苦蕎蛋白含量的測定 參照國標GB 50095-2010中凱氏定氮法進行樣品測定。

1.2.4 腸胃道環境模擬 體外消化:參考Mills等人[14]的方法并略作修改。具體如下:分別稱取5.0 g苦蕎蛋白，將pH調節到2.0±0.05(此時胃蛋白酶的活性最高),加入2.5 mL溶解在0.1 mol/L鹽酸中的胃蛋白酶溶液(0.108 g/mL),經37 ℃恒溫水浴震蕩2 h;經過模擬胃部條件消化后,再用6 mol/L NaOH將溶液的pH調節到6.8±0.05(此時胰酶活性最高),加入12.5 mL溶解在0.5 mol/L Na2CO3中的胰酶膽汁溶液(胰酶和膽汁濃度分別為4.5 mg/mL和28 mg/mL),37 ℃恒溫水浴震蕩2 h;進一步模擬食物在腸道中的消化。充分混勻后,將混合液置于透析袋進行透析,并于37 ℃,在10 mmol/L NaCl溶液中進行透析過夜,結束后,再次更換NaCl溶液并繼續透析2 h,最后將截留消化液進行冷凍干燥,于4 ℃冰箱保存用于體外模擬腸道發酵實驗。上述步驟以酪蛋白(Casein)作為對照以及用無菌水代替苦蕎蛋白作為空白對照。

1.2.5 體外發酵液的制備 體外發酵:參考Estibaliz等人[15]的方法,并略作修改。向無菌發酵瓶中加入90 mL基礎培養基并于厭氧工作站中37 ℃進行預還原(12 h)。1 L基礎培養基中含有:2 g葡萄糖,2 g蛋白胨,2 g酵母膏,0.1 g NaCl,0.04 g K2HPO4,0.04 g KH2PO4,0.01 g MgSO4·7H2O,0.01 g CaCl2·6H2O,2 g NaHCO3,0.5 gL-半胱氨酸鹽酸鹽,0.5 g膽鹽,10 mL維生素K1,2 mL吐溫-80和1 mL氯高鐵血紅素溶液,將以上成分溶解后調節基礎培養基pH至7.0(±0.05),最后加入4 mL 0.025%(w/v)刃天青溶液并滅菌。

收集小鼠新鮮糞便(盡量保持無菌狀態),收集后立即用預還原的磷酸鹽緩沖溶液(PBS,0.1 mol/L,pH7.0)稀釋10倍,并在渦旋振蕩器上充分振蕩3 min,使之徹底勻漿化,500 r/min 離心2 min,分別迅速取上清液10 mL到90 mL預還原基礎培養基中,再加入低(0.2 g)、中(0.4 g)、高劑量組(0.8 g)經胃腸模擬環境處理后的苦蕎蛋白水解樣品BWPH(酪蛋白消化凍干樣品PC作為對照組,無菌水代替苦蕎蛋白的消化凍干產物CK作為空白對照)充分混勻;在厭氧培養箱中37 ℃發酵32 h,并在發酵的第0、8、16、32 h取樣。

1.2.6 苦蕎蛋白對三種有害菌生長的影響 在發酵的第0、8、16、32 h,分別取小鼠糞便發酵液并對其中的腸球菌、腸桿菌、產氣莢膜桿菌進行計數,發酵液用含有5 g/L 蛋白胨的稀釋液進行10倍梯度法稀釋(10-1～10-7),選擇合適稀釋度的樣品(100 μL)并分別涂布于各選擇性培養基上進行培養(培養基、培養方法及條件,見表1),以上操作均在厭氧培養箱中進行,從取樣至涂板完成所用時間控制在3 h內。每毫升小鼠糞便發酵液的菌落數用菌落形成單位的以10為底的對數值(lg CFU/mL)表示。

表1 腸道主要菌群培養計數方法Table 1 Cultivation and counting methods of the main intestinal flora

1.2.7 苦蕎蛋白對發酵液pH的影響 在發酵的第0、8、16、32 h,分別取不同樣品小鼠糞便發酵液,用pH計測定其pH。

1.2.8 苦蕎蛋白對短鏈脂肪酸的影響 短鏈脂肪酸(SCFAs)是腸道微生物發酵不被人體胃腸道吸收的食物成分而生成的代謝產物,主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、延胡索酸和一些相應的支鏈脂肪酸。其中乙酸、丙酸、丁酸及乳酸占90%以上,具有重要的生理功能[16]。為進一步研究苦蕎蛋白對腸道有害菌群生長抑制作用的機理,實驗對小鼠糞便發酵液中短鏈脂肪酸(SCFAs)的濃度變化進行分析。

在發酵的第0、8、16、32 h,分別取不同樣品小鼠糞便發酵液,采用氣質聯用(GC-MS-MS)法測定其中短鏈脂肪酸(SCFAs,包括乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的含量。

氣質分析條件:毛細管柱(Rtx-5MS,30 m×0.25 mm×0.25 μm);柱溫:35 ℃保持1 min,以10 ℃/min的速度升溫至100 ℃,保持1 min,再以20 ℃/min的速度升溫至250 ℃,保持3 min;進樣口溫度:250 ℃;離子源溫度:220 ℃;接口溫度:260 ℃;分流方式及分流比:分流進樣和10∶1;載氣:He,流速:1 mL/min;溶劑延遲1.5 min。GC分析時進樣量:1 μL[17]。

發酵液樣品的處理參考Fenster等人[18]的方法,并略作修改。

1.2.9 數據分析 采用SPSS 20.0軟件進行ANOVA(LSD檢驗),檢驗水準=0.05進行顯著性分析;每組數據均作3個平行樣,結果以平均值±標準差表示,并運用origin 9.0軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 苦蕎蛋白對三種有害菌生長的抑制作用

由圖1可知,不同實驗組中腸球菌、腸桿菌及產氣莢膜梭菌的數量均呈先上升后下降的趨勢,其中,中(MD)、高(HD)劑量組的苦蕎蛋白在發酵8 h時達到最大值,而空白組(CK)、酪蛋白組(PC)及低(LD)劑量組的苦蕎蛋白在16 h時達到最大值。另外,在發酵至32 h時,不同劑量組的苦蕎蛋白中腸球菌、腸桿菌及產氣莢膜梭菌的數量均顯著低于CK和PC組(p<0.05),且上述三種有害菌群的數量隨苦蕎蛋白濃度的增加而顯著性降低(p<0.05),同時,酪蛋白組中腸球菌、腸桿菌及產氣莢膜梭菌的數量與空白對照組之間無顯著性差異(p>0.05)。培養至32 h時,低、中、高劑量的苦蕎蛋白組較空白對照組,腸球菌減少了50%、57%、65%,腸桿菌減少了13%、52%、72%,產氣莢膜梭菌減少了66%、73%、78%;而酪蛋白卻使其分別減少了5%、7%、4%。研究結果表明,苦蕎蛋白能夠顯著地抑制腸道有害菌(腸球菌、腸桿菌及產氣莢膜梭菌)的生長,與文獻[19]報道的結論一致。

圖1 苦蕎蛋白體外發酵對三種腸道有害菌生長的影響Fig.1 Effects of in vitro fermentation of different tartary buckwheat protein on numbers of three kinds intestinal harmful bacteria注:CK:空白對照組;PC:酪蛋白組;LD:低劑量苦蕎蛋白組;MD:中劑量苦蕎蛋白組;HD:高劑量苦蕎蛋白組;A:腸球菌;B:腸桿菌;C:產氣莢膜梭菌,圖2、圖3同。

2.2 苦蕎蛋白對小鼠糞便發酵液pH的影響

由圖2可知,各實驗組pH變化趨勢均呈下降趨勢,而對照組(CK)卻呈先下降后上升的趨勢,這可能是由于隨著培養時間的增加,其菌群發生變化,使產酸菌群減少或氨類物質增多而導致;另外,當培養至32 h時,其中PC組pH由7.21降到4.72,LD組pH由7.18降到4.68,MD組pH由7.09降到4.35,HD組pH由7.17降到4.33,各組pH下降程度高低為HD>MD>LD>PC>CK。酪蛋白組和不同劑量組的苦蕎蛋白組發酵液中的pH均低于空白對照組,且與其之間均具有顯著性差異(p<0.05)。在培養結束時,不同劑量組的苦蕎蛋白組的發酵液pH與腸道中三種有害菌(腸球菌、腸桿菌、產氣莢膜梭菌)數量之間存在正相關關系,即發酵液pH越低,腸球菌、腸桿菌及產氣莢膜梭菌的數量越少。由此說明,有害菌生長受到抑制可能是由于腸道菌群發酵苦蕎蛋白而產生短鏈脂肪酸等酸性物質,從而使腸道環境pH降低,這對于預防和治療腸道疾病具有重要意義[20]。

圖2 苦蕎蛋白體外發酵對pH的影響Fig.2 Effects of in vitro fermentation of different tartary buckwheat protein on pH

圖3 苦蕎蛋白體外發酵對短鏈脂肪酸的影響Fig.3 Effects of in vitro fermentation of different tartary buckwheat protein on SCFAs注:A:乙酸;B:丙酸;C:丁酸;D:乳酸。

2.3 苦蕎蛋白對短鏈脂肪酸的影響分析

由圖3可知,不同劑量的苦蕎蛋白均能促進乙酸、丙酸、丁酸、乳酸的生成,且隨著培養時間的延長,4種短鏈脂肪酸的濃度均顯著性增加(p<0.05),可能是由于腸道菌群將苦蕎蛋白作為發酵底物產生短鏈脂肪酸等有機酸。當培養至32 h時,中、高劑量的苦蕎蛋白組(MD、HD)較0 h使乙酸濃度增加了7.29、8.94倍,丙酸濃度增加了25.47、33.77倍,丁酸濃度增加了23.60、27.34倍,乳酸濃度增加了22.61、25.55倍(酪蛋白組(PC)使其濃度分別增加了6.73、27.60、22.93、20.70倍),此結果與方建東等[21]研究結論一致。在培養結束時,不同劑量組的苦蕎蛋白中乙酸、丙酸、丁酸及乳酸與對照組之間均具有顯著性差異(p<0.05),且中、高劑量組的苦蕎蛋白對短鏈脂肪酸(乙酸、丁酸、乳酸)的促進作用顯著高于酪蛋白,即苦蕎蛋白對短鏈脂肪酸的促進作用優于酪蛋白,且高劑量組較低劑量組效果更加顯著,其原因可能是苦蕎蛋白和酪蛋白均能夠被腸道菌群發酵,而且苦蕎蛋白更有利于被腸道菌群發酵產生乙酸、丙酸、丁酸、乳酸。當培養結束時,圖3中各組中短鏈脂肪酸的濃度可能與圖2中相對應的pH相關,即短鏈脂肪酸濃度越高,其對應的pH越低,從而表明pH的降低可能是通過發酵代謝產生的短鏈脂肪酸所引起的。

3 結論

本文初步研究了苦蕎蛋白對腸道中三種有害菌(腸球菌、腸桿菌、產氣莢膜梭菌)生長的抑制作用及其機理。結果表明,苦蕎蛋白對腸道中腸球菌、腸桿菌及產氣莢膜梭菌的生長均具有抑制作用且高于酪蛋白，其中,高劑量的苦蕎蛋白(HD)對三種菌的抑制作用最強,較空白對照組(CK)分別減少了65%、72%和78%(32 h)。不同劑量的苦蕎蛋白可顯著性地促進乙酸、丙酸、丁酸、乳酸濃度的增加,且中、高劑量組的苦蕎蛋白對其促進作用顯著高于酪蛋白(p<0.05),其中,高劑量組的苦蕎蛋白較對照組分別使乙酸、丙酸、丁酸及乳酸的濃度增加了8.94、33.77、27.34、25.55倍(32 h)。而產生的短鏈脂肪酸進一步使腸道pH降低,且不同劑量苦蕎蛋白組的pH均低于酪蛋白(高劑量組苦蕎蛋白的pH為4.33,而酪蛋白組為4.68)。從而證明了苦蕎蛋白對腸道有害菌的生長具有抑制作用,且這種抑制作用是通過促進腸道中短鏈脂肪酸的產生,進而降低腸道的pH。

綜上所述,苦蕎蛋白是可能通過促進乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸的生成,從而降低腸道的pH來抑制腸道有害菌(腸球菌、腸桿菌及產氣莢膜梭菌的)的生長。

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Effect of tartary buckwheat protein on the growth of harmful bacteria in intestinal

LI En-wei

(Shanxi Food Industrial Research Institue,Taiyuan 030024，China)

In this paper,water-soluble buckwheat protein was used as the research object,and the pH and the quantity of short-chain fatty acids(acetic acid,propionic acid,butyric acid,lactic acid)and harmful bacteria(Enterococcus,EnterobacteriaceaeandClostridiumperfringens)were determined by simulatedinvitrofermentation. The mechanism of buckwheat protein inhibition of intestinal harmful flora growth was investigated. The results showed that the addition of different concentrations of buckwheat protein could reduce the number of harmful bacteria compared with the control group. The high dose group reduced the quantity ofEnterococcus,EnterobacterandClostridiumperfringensby 65%,72% and 78%(32 h). The tartary buckwheat protein in different dosage groups decreased the pH of the fecal fermentation broth by 35%,39% and 40%(32 h),respectively.In addition,the concentration of acetic acid,propionic acid,butyric acid and lactic acid in high dose group were increased by 8.94,33.77,27.34 and 25.55 times(32 h),respectively,compared with the control group.In summary,tartary buckwheat protein can improve the intestinal short-chain fatty acid content,thereby reducing the intestinal environment pH,inhibit intestinal harmful bacteria(Enterococci,Enterobacteriaceae,Clostridiumperfringens)growth.

tartary buckwheat protein;invitrosimulation;inhibition;pH;short-chain fatty acids(SCFAs)

2017-01-05

李恩偉(1962-),男，本科，研究方向：食品工程，E-mail:sxfood@126.com。

TS201.4

A

1002-0306(2017)15-0306-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.057