山藥多糖和燕麥多糖發酵產酸及發酵產物對結腸癌細胞的增殖抑制作用

殷丹婷,郝麗鑫,王 琦,趙新淮

(乳品科學教育部重點實驗室,東北農業大學,黑龍江哈爾濱 150030)

山藥多糖和燕麥多糖發酵產酸及發酵產物對結腸癌細胞的增殖抑制作用

殷丹婷,郝麗鑫,王 琦,趙新淮*

(乳品科學教育部重點實驗室,東北農業大學,黑龍江哈爾濱 150030)

采用水提取、醇沉淀法制備山藥多糖和燕麥多糖,利用健康成人糞便提取物中的腸道微生物體外發酵多糖,確定發酵產酸情況(乙酸，丙酸，丁酸，乳酸)以及發酵產物對結腸癌細胞HCT-116的增殖抑制作用。山藥多糖和燕麥多糖的糖含量分別為82.63%和80.32%。發酵24 h,山藥多糖和燕麥多糖產生23.28、25.14 mmol/L乙酸、2.49、1.97 mmol/L丙酸、11.04、7.99 mmol/L丁酸和0.19、0.46 mmol/L乳酸;發酵48 h,它們產生四種酸為28.14、42.53，6.48、2.45，13.76、9.64，0.08、0.09 mmol/L。發酵時間從24 h延長至48 h,產物中乙酸、丙酸和丁酸含量顯著提高(p<0.05),而乳酸含量明顯降低(p<0.05)。兩種多糖對細胞的抑制作用小于24.5%,而兩種多糖發酵產物有更強的抑制作用,分別達到46.2%～69.1%、44.6%～67.3%;48 h發酵產物抑制作用更強,處理細胞48 h產生的抑制作用更大。結果表明,兩種多糖經過腸道微生物發酵后,其產物對結腸癌細胞具有更強的增殖抑制活性。

山藥多糖,燕麥多糖,發酵,短鏈脂肪酸,結腸癌細胞

在植物性食品中,天然植物多糖被認為是一種最重要的成分[1]。植物多糖是相對復雜的碳水化合物,也是最豐富的有機化合物[2]。研究表明,一些非消化性植物多糖具有各種各樣的生物活性,例如免疫調節作用[3-5]、抗腫瘤[6-7]、降血糖[8]、降血脂[9]、抗病毒[10]、抗衰老[11]、抗氧化[12]等。這些多糖備受關注,對其提取、純化以及生物活性的研究頗多,例如山藥多糖和燕麥多糖[13-14]。水提取、醇沉淀法是最常見的多糖制備方法[13]。非消化性多糖在體內不吸收,但是可以被腸道微生物發酵[15-16]。抗性淀粉、非淀粉多糖和非消化性低聚糖等被腸道微生物發酵后,產生各種短鏈脂肪酸主要包括乙酸、丙酸和丁酸等[17]。短鏈脂肪酸對機體健康有益,因為它們可以降低腸內環境pH,抑制有害菌的生長,防止腸道功能紊亂[18]。此外,短鏈脂肪酸還有其他方面的健康作用。例如,乙酸和丙酸可以影響血脂和膽固醇的代謝,有降低血脂和膽固醇的作用[19-20]。又如,丁酸可以抑制腫瘤細胞增殖以及促進腫瘤細胞分化和凋亡,具有抗癌作用[21-23]。

山藥和燕麥是重要的食材,其組成成分包括多糖。進食山藥和燕麥后,山藥多糖和燕麥多糖將進入消化道、并被腸道微生物所發酵。但是,山藥多糖和燕麥多糖發酵后是否會影響抗結腸癌作用,目前尚缺乏必要的體外、體內評估。因此,本研究采用水提取、醇沉淀法提取山藥多糖和燕麥多糖,利用健康成人糞便的微生物菌群體外發酵兩種多糖,評估發酵產物的產酸情況以及對結腸癌細胞的抑制作用。本研究以期為開發、剖析食品成分的健康作用提供必要的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮山藥 市售河南種植鐵棍山藥;燕麥粒 市售;α-淀粉酶、堿性蛋白酶 北京奧博星生物技術有限責任公司;正己烷(色譜純) 天津市科密歐化學試劑有限公司;無水乙醇、無水乙酸鈉 天津市天力化學試劑有限公司;丙酸鈉 天津市巴斯夫化工有限公司;丁酸鈉 上海阿拉丁化學試劑有限公司;McCoy′5A培養基 Sigma公司;胎牛血清 Wisent公司;胰蛋白酶 Amresco公司;CCK-8 日本同仁化學研究所;其他所有試劑均為分析純。

7890N氣相色譜儀 美國Agilent儀器有限公司;UV-2401PC型紫外可見分光光度計 日本島津公司;HF-90型CO2培養箱 美國力康公司;Model 680型酶標儀 美國BIO-RAD公司;DHP-9082型電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;C10-2.4A型低速離心機 北京京立離心機廠;DELTA 320型精密pH計、AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器中國有限公司;LGJ-1冷凍干燥機 上海醫分儀器制造有限公司;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山藥多糖及燕麥多糖的提取

1.2.1.1 原料預處理 新鮮山藥洗凈去皮,切成大小均一的方塊,勻漿處理,備用。燕麥粒經過粉碎、過篩(100目),備用。

1.2.1.2 多糖的提取 按照料液比1∶10(w/w)將原料與蒸餾水混合,在適宜溫度下浸提3 h(山藥:100 ℃,燕麥:60 ℃),冷卻到室溫,8000 r/min離心5 min,收集上清液;殘渣重復浸提2次;合并上清液。上清液用α-淀粉酶在pH7.0、45 ℃下處理4 h,沸水浴滅酶5 min;加入堿性蛋白酶,在pH9.0、55 ℃下再處理4 h,沸水浴滅酶5 min;然后,8000 r/min離心5 min。上清液濃縮4倍后,加入無水乙醇(終濃度為80%)于4 ℃過夜,離心,沉淀用乙醇洗滌后凍干,得到多糖粉末。

1.2.1.3 多糖含量測定 利用苯酚硫酸法[24]測定多糖的含量。標準曲線的繪制:取0.1 mg/mL葡萄糖標準液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80 mL于25 mL具塞刻度試管中,加蒸餾水至2.00 mL,分別加5%苯酚溶液1.00 mL,搖勻,迅速加入濃硫酸溶液5 mL,振搖5 min,放置10 min后在沸水浴中加熱60 min,冷卻后采用分光光度計在波長490 nm下測定吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標作圖。

樣品多糖含量的測定:取0.1 mg/mL多糖樣品溶液1.00 mL放入具塞試管中,按照上述方法測定吸光值,由標準曲線計算出葡萄糖濃度,乘以0.9即為多糖含量。

1.2.2 多糖的體外發酵

1.2.2.1 糞便提取物的制備 采集5個健康成人(2男3女,年齡為22～24歲)的新鮮糞便,所選對象在近一個月未服用抗生素、未得腹瀉和腸炎。采集和處理在1 h內完成。取40 g糞便樣品,于200 mL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH6.5)中勻漿2 min,懸浮液用四層紗布粗濾除去顆粒物質,得到糞便提取物。提取物于-20 ℃保存以備用。

1.2.2.2 體外發酵培養基的制備 參考文獻方法[25]稍作修改,配制體外發酵培養基。組成成分為:2.0 g NaHCO3,2.0 g蛋白胨,2.0 g酵母浸粉,0.5 g牛膽鹽,0.5 gL-半胱氨酸鹽酸鹽,0.01 g CaCl2,0.1 g NaCl,0.04 g K2HPO4,0.04 g KH2PO4,0.01 g MgSO4·7H2O,2.0 mL吐溫-80,蒸餾水定容至1 L。

1.2.2.3 糞便的體外發酵 在具塞試管中分別加入2.5 mL體外發酵培養基、2.5 mL糞便提取物和0.5 mL無菌去離子水,混勻后在37 ℃厭氧條件下分別發酵24 h和48 h。發酵結束后震蕩混合,將內容物轉移到10 mL離心管中,8000 r/min離心10 min得到上清液。將上清液的pH調節到7.0,并分成兩部分以便用于有機酸分析和細胞實驗;其中,用于細胞實驗的發酵上清液(即發酵產物),使用前需要經過0.22 μm的無菌微孔濾膜進行過濾除菌。發酵產物于-20 ℃保存備用。

1.2.2.4 兩種多糖的體外發酵 在具塞試管中分別加入2.5 mL含9 g/L山藥多糖(或燕麥多糖)的體外發酵培養基、2.5 mL糞便提取物和0.5 mL無菌去離子水,混勻后在37 ℃厭氧條件下分別發酵24 h和48 h。其他處理同1.2.2.3。發酵產物于-20 ℃保存備用。用于細胞實驗的發酵產物也經過0.22 μm的無菌微孔濾膜過濾。

1.2.3 有機酸分析

1.2.3.1 短鏈脂肪酸的氣相色譜(GC)分析 根據參考文獻[26]的方法稍作改進。取1.00 mL標準溶液或發酵上清液,加入2.40 mL無水乙醇,混勻后吸取850 μL于安瓿瓶中,加入100 μL濃硫酸和1 mL正己烷,封口后于60 ℃水浴中加熱1 h;不斷震蕩使發酵產物中的短鏈脂肪酸充分酯化。反應完成后冷卻至室溫,劇烈震蕩5 min,靜置分層。上層有機相用于氣相色譜(GC)分析乙酸、丙酸和丁酸的含量。

表1 乙酸、丙酸、丁酸和乳酸的標準曲線、最低檢測限和平均添加回收率Table 1 Standard curves,detection limits,and average recoveries of f acetate,propionate,butyrate,and lactate

注：X,酸的濃度(mmol/L);Y,峰面積或吸光值。氣相色譜條件:色譜柱型號(HP-5毛細管柱,30 m×0.32 mm×0.25 μm);進樣口溫度,200 ℃;FID檢測器溫度,220 ℃;載氣:氮氣,流速1 mL/min,分流比為40∶1;燃氣:氫氣,流速30 mL/min;助燃氣:空氣,流速300 mL/min;隔墊掃吹為3 mL/min;進樣體積1 μL。柱箱升溫程序:初始溫度30 ℃,保持3.5 min,以5 ℃/min升溫至40 ℃;再以15 ℃/min升溫至150 ℃。

1.2.3.2 乳酸分析 根據參考文獻[27]的方法稍作改進。取1.00 mL發酵上清液,分別加入0.5 mL 10.6%亞鐵氰化鉀溶液、0.5 mL 21.9%乙酸鋅溶液,補充蒸餾水至5 mL,迅速混勻,靜置30 min后8000 r/min離心20 min。所得到的上清液適當稀釋。5 mL稀釋液加入到預先加有50 mg Ca(OH)2粉末的試管中,混勻,加入0.8 mL 20% CuSO4溶液混勻,沸水浴加熱3 min,冷卻,8000 r/min離心20 min。吸取0.5 mL上清液于大試管中,置于冰水中,緩慢加入6 mL預冷的濃H2SO4,邊加邊振蕩,混勻后沸水浴加熱5 min,冰水浴中冷卻,再加入0.125 mL對羥基聯苯溶液,充分搖勻,放置30 min,期間每10 min搖一次;沸水浴加熱1.5 min,冰水浴中冷卻后。在波長565 nm處測定吸光值。

1.2.4 發酵產物對HCT-116細胞的增殖抑制作用評估

1.2.4.1 細胞培養 HCT-116細胞購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。HCT-116細胞生長于含10%胎牛血清的McCoy′5A培養基中,于CO2培養箱中培養(37 ℃,5% CO2)。胰蛋白酶消化收集細胞,以1∶3～1∶5的比例進行傳代培養。

1.2.4.2 CCK-8法測定增殖抑制作用 將HCT-116細胞接種于96孔培養板中,接種密度為8(103個細胞/孔,預培養24 h,使細胞貼壁。吸除培養基,加入含發酵產物的細胞培養基,發酵產物的比例為10%(v/v),細胞處理時間為24 h和48 h。用100 μmol/L的5-氟尿嘧啶(5-FU)處理細胞組,作為陽性對照組。用含磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH6.5)的細胞培養基(10%,v/v)處理細胞,作為陰性對照組。調零組不含有細胞只含有磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH6.5)的細胞培養基(10%,v/v)。處理后的細胞,再加入10 μL CCK-8繼續培養2 h,并用酶標儀測定各孔吸光值(OD),檢測波長為450 nm。每組實驗設5個復孔,重復3次。按下式進行計算抑制率(%),并以此表示細胞增殖抑制作用。

1.2.5 數據分析 所有數據均為3次獨立重復實驗的平均值,結果以平均值±標準偏差表示。采用SPSS軟件(16.0)中的單因素方差分析(One-way AVONA)和Duncan多重比較法對數據進行統計分析,當p<0.05時即認為數據間存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 山藥多糖及燕麥多糖的糖含量

所得到的葡萄糖標準曲線方程為Y(吸光度)=0.0121X(葡萄糖濃度)+ 0.0106(R2=0.9991)。根據分析結果,所制備的山藥多糖中的糖含量為82.63%,而燕麥多糖中的糖含量則為80.32%。

2.2 發酵產物中有機酸的分析

采用1.2.3.1中所述的氣相色譜條件,分析各個發酵產物中乙酸、丙酸和丁酸的含量。從所得到氣相色譜圖(圖1A～圖1C)中可以看出,這3種短鏈脂肪酸均能被色譜柱有效分離,保留時間約為4～9 min。

圖1 GC法分析標準溶液(A)和山藥多糖(B)和燕麥多糖(C)Fig.1 GC profiles of acetate,propionate,and butyrate in standard solution(A)and fermented products of yam polysaccharides(B)and oat polysaccharides(c)注：1：乙酸；2：丙酸；3：丁酸。

采用不同濃度的乙酸、丙酸和丁酸標準溶液(10～60 mmol/L)或乳酸標準溶液(0.1～0.5 mmol/L),得到的標準曲線如表1。以3倍的信噪比(S/N)計算,得到這4種酸的檢出限,結果也列于表1中。分別添加不同濃度的乙酸、丙酸、丁酸和乳酸至發酵產物中,所得到的添加回收率結果見表1。表1中的數據表明,所采用的GC分析法以及分光光度法可以準確地測定發酵產物中的4種有機酸含量。

2.3 不同時間兩種多糖的發酵產酸情況

兩種多糖被糞便提取物中的腸道微生物發酵后,發酵體系的產酸情況如表2所示。表中數據首先證明,糞便提取物自身也可以發酵,并產生少量的4種有機酸。糞便提取物發酵24 h和48 h后,乙酸、丙酸和丁酸分別增加到9.98～10.48、1.98～2.16、2.69～2.93 mmol/L;不同的是,乳酸先增加到0.16 mmol/L,再降低到0.08 mmol/L。表1中的數據也表明,山藥多糖和燕麥多糖均可以被糞便提取物中的微生物發酵,并產生乙酸、丙酸、丁酸和乳酸。數據比較結果表明,添加山藥多糖或燕麥多糖于發酵體系中,所得發酵產物中4種有機酸的含量大幅度提高,明顯高于未發酵時各個體系中的有機酸含量(p<0.05),也高于糞便提取物自身發酵產酸。其中,發酵24 h,山藥多糖和燕麥多糖分別發酵產生23.28、25.14 mmol/L乙酸，2.49、1.97 mmol/L丙酸，11.04、7.99 mmol/L丁酸和0.19、0.46 mmol/L乳酸;發酵48 h,兩種多糖分別發酵產生28.14、42.53 mmol/L乙酸，6.48、2.45 mmol/L丙酸，13.76、9.64 mmol/L丁酸和0.08、0.09 mmol/L乳酸。可見,發酵時間從24 h延長至48 h,發酵產物中的乙酸、丙酸和丁酸含量得到顯著提高(p<0.05),而乳酸含量明顯降低(p<0.05)。進一步比較數據發現,山藥多糖在發酵時的產酸情況與燕麥多糖有所不同;例如山藥多糖發酵比燕麥多糖發酵能夠產生更多的丙酸和丁酸、較少的乙酸和乳酸。

表2 山藥多糖及燕麥多糖發酵體系中有機酸含量(mmol/L)Table 2 Four acids produced during in vitro fermentation of yam polysaccharides and oat polysaccharides(mmol/L)

注：數據后不同上標的小寫字母表示同一行內數據差異性顯著(p<0.05)。

已有研究結果表明,抗性淀粉和魔芋多糖可以被糞便提取物中的腸道微生物降解,產生短鏈脂肪酸和乳酸,并且隨著發酵時間的延長,乙酸、丙酸和丁酸的含量增加,而乳酸呈下降趨勢[28-29],這些結果與本研究兩種多糖的發酵產酸情況相同。乳酸作為發酵初期產物可被某些微生物利用,合成乙酸[30]和丁酸[31],所以較長時間發酵會減少乳酸含量。本研究的乳酸含量分析結果也證明了這一點。Ying[32]等利用豬腸道微生物發酵水溶性大豆多糖,發現發酵體系中3種短鏈脂肪酸的生成量明顯高于未加入多糖發酵體系中3種酸的生成量,并且在48 h產酸達到最大值。Drzikova等[33]研究也表明,燕麥粉體外發酵實驗中丁酸的生成量與發酵時間成正比。以上的這些研究工作結果與本研究結果基本一致,證明山藥多糖及燕麥多糖體外發酵可以產生短鏈脂肪酸(尤其是丁酸),這可能有助于提高兩種多糖在體內的抗結腸癌活性,因為丁酸已被證明具有抗結腸癌作用[21-23]。

2.4 不同時間發酵產物對HCT-116細胞的增殖抑制作用

通過CCK-8法評估所得到的發酵產物對HCT-116細胞的增殖抑制作用,結果如表3所示。未發酵時(即發酵時間為0 h),糞便提取物對細胞的抑制作用僅為6.3%、7.9%,而兩種多糖對細胞的抑制作用為12.2%～24.5%。糞便提取物自身發酵24 h和48 h后,發酵產物對細胞的增殖抑制作用為8.4%～25.7%。山藥多糖和燕麥多糖發酵產物對細胞的增殖抑制作用明顯大于糞便提取物自身發酵產物(p<0.05),達到44.6%～56.4%(發酵24 h)或63.5%～69.1%(發酵48 h)。因此,山藥多糖和燕麥多糖被糞便提取物中的微生物發酵后,產生了更強的細胞增殖抑制作用;同時,山藥多糖和燕麥多糖的發酵時間越長,發酵產物所具有的細胞增殖抑制作用越大。由表3數據還可以看出,任何一個發酵產物對細胞處理24 h或48 h,48 h處理所產生的增殖抑制作用更大。這意味著存在時間依賴關系,即發酵產物處理細胞的時間越長,發酵產物的增殖抑制作用越大。進一步比較兩種多糖發酵產物的細胞增殖抑制作用差異性,發現山藥多糖發酵產物的增殖抑制作用略高于燕麥多糖發酵產物,但發酵產物之間的抑制作用差異性并非很大。

表3 各個發酵產物對HCT-116細胞處理24 h和48 h的增殖抑制作用(%)Table 3 Growth inhibition of the fermentation products on HCT-116 cells with cell treatment times of 24,48 h(%)

注：數據后不同上標的小寫字母表示同一列內數據差異性顯著(p<0.05)。

腸道微生物發酵山藥多糖、燕麥多糖后,對細胞的增殖抑制作用明顯地高于未發酵的多糖,并且48 h發酵產物具有更高的增殖抑制作用。這一現象極有可能與發酵產物中丁酸含量增加和乳酸含量降低有關。丁酸已被證明具有抑制結腸癌細胞增殖,誘導凋亡和分化的作用[34]。Kautenburger等[35]的研究結果表明,高濃度的丁酸可以減少腫瘤細胞的存活率或緩解腫瘤的發展。Borowicki等[36]的研究結果也指出,小麥糊粉體外發酵產生較高的丁酸,導致其對LT97和HT29細胞產生更強的增殖抑制作用。本研究結果也發現,兩種多糖48 h發酵可以生成更多的丁酸,因此48 h發酵產物的增殖抑制作用更強。另外,腫瘤細胞可以把乳酸作為能量來源維持自身代謝[37]。乳酸也可以促進腫瘤血管生成[38],這意味著,高濃度的乳酸可能會降低發酵產物對結腸癌細胞的增殖抑制作用。反過來,低濃度的乳酸則可能會有利于發酵產物對結腸癌細胞的增殖抑制作用。因此,就本研究結果而言,兩種多糖48 h的發酵可以產生更多的丁酸、但是降低乳酸的含量,因此提高了發酵產物對細胞的增殖抑制作用。

3 結論

利用健康成人糞便提取物中的腸道微生物體外發酵山藥多糖和燕麥多糖,可以產生4種有機酸(乙酸、丙酸、丁酸和乳酸),并且48 h的發酵時間可以提高乙酸、丙酸和丁酸的生成,減少乳酸的生成。山藥多糖和燕麥多糖的發酵,使得發酵產物對結腸癌細胞HCT-116具有更強的增殖抑制作用。初步分析結果表明,發酵時間越長,增殖抑制作用越大;細胞處理時間越長,增殖抑制作用越大;發酵產物對細胞的增殖抑制作用極有可能與丁酸含量升高、乳酸含量降低有關。整體結果證明,腸道微生物發酵山藥多糖和燕麥多糖可以產生短鏈脂肪酸(尤其是丁酸),增強其對HCT-116細胞的增殖抑制作用。

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Acid production of the polysaccharides from yam and oatinvitrofermentation as well as the growth inhibition of the fermentation products on human colon cancer cells

YIN Dan-ting,HAO Li-xin,WANG Qi,ZHAO Xin-huai*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Yam polysaccharides and oat polysaccharides were both prepared using water extraction and alcohol precipitation methods. The intestinal microflora in a fecal extract from the health adults were used to ferment the two polysaccharidesinvitro. The amount of four organic acids(acetic,propionic,butyric and lactic acids)in the generated fermentation products were measured,and growth inhibition of these fermentation products on human colon cancer cells(HCT-116 cells)were assessed. Yam polysaccharides and oat polysaccharides contained saccharide contents of 82.63% and 80.32%,respectively. Being fermented for 24 h,yam polysaccharides and oat polysaccharides generated acetic,propionic,butyric and lactic acids in levels of 23.28 and 25.14,2.49 and 1.97,11.04 and 7.99,0.19 and 0.46 mmol/L,respectively. Being fermented for 48 h,yam polysaccharides and oat polysaccharides resulted in the levels of the four acids at 28.14 and 42.53,6.48 and 2.45,13.76 and 9.64,0.08 and 0.09 mmol/L,respectively. With the increase of fermentation time(24～28 h),acetate,propionate and butyrate contents in fermentation products were enhanced clearly(p<0.05),but lactate contents was also decreased markedly(p<0.05). Yam polysaccharides and oat polysaccharides showed lower growth inhibition(less than 24.5%)on the HCT-116 cells. However,the obtained fermentation products exerted growth inhibition effect(46.2%～69.1% and 44.6%～67.3%,respectively)on the cells. And more,a fermentation time of 48 h conferred the fermentation products with higher growth inhibition while treatment of the cells for 48 h also led to higher growth inhibition. It is thus concluded thatinvitrofermentation of the two polysaccharides by the intestinal microflora could bring enhanced anti-proliferation activities to the colon cancer cells.

yam polysaccharides;oat polysaccharides;fermentation;short-chain fatty acids;colon cancer cells

2017-02-21

殷丹婷(1993-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail:yindanting@163.com。

*通訊作者:趙新淮(1963-)，男，博士，教授，主要從事食品化學研究，E-mail:zhaoxh@neau.edu.cn。

高等學校博士學科點專項科研基金(20092325110012)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)15-0296-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.055