乳酸鏈球菌素和檸檬酸對甜櫻桃中沙門氏菌的抑制

錢紅玫,胡文忠,李 琳,戰 楊,管玉格

(1.大連工業大學食品學院,遼寧大連 116034;2.生物技術與資源利用教育部重點實驗室,遼寧大連 116600;3.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600;4.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

乳酸鏈球菌素和檸檬酸對甜櫻桃中沙門氏菌的抑制

錢紅玫1,2,胡文忠2,*,李 琳2,3,戰 楊2,3,管玉格2,4

(1.大連工業大學食品學院,遼寧大連 116034;2.生物技術與資源利用教育部重點實驗室,遼寧大連 116600;3.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600;4.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

為了研究沙門氏菌污染采后甜櫻桃果實的生長繁殖狀況及其控制情況,分別采用乳酸鏈球菌素(Nisin)、檸檬酸及二者復配溶液處理人工接種沙門氏菌的甜櫻桃,觀察和分析Nisin和檸檬酸的抑菌效果。結果表明,Nisin與檸檬酸處理均具有抑菌效果,并且隨著溶液中Nisin從10 μg/mL上升至100 μg/mL、檸檬酸從1 g/L上升至5 g/L時,抑菌效果顯著增強，(p<0.05)。研究還發現,Nisin溶液100 μg/mL、檸檬酸溶液5 g/L、Nisin 10 μg/mL與3 g/L檸檬酸復配溶液和Nisin 50 μg/mL與檸檬酸1 g/L復配溶液這4種處理具有相似的抑菌除菌效果,處理5 min菌落濃度可以降低至104cfu/mL;Nisin 50 μg/mL與3 g/L檸檬酸復配溶液處理樣品15 min時,沙門氏菌的菌落降至檢測限以下,無法檢出;當貯存時間一直延長至第10 d時,Nisin和檸檬酸處理仍然保持一定的抑菌效果,充分除菌抑菌。

甜櫻桃,沙門氏菌,Nisin,檸檬酸,抑菌

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌,屬腸桿菌科,是需氧或兼性厭氧型細菌[1]。當輕度感染沙門氏菌時,會引發人體腹瀉,嘔吐等輕微現象,但重度感染時,其會引發潛在的致命性的腸道傷寒,威脅生命[2-3]。在不同地域的細菌性食物中毒事件中,由沙門氏菌所引起的中毒事件占我國食源性致病的70%～80%[4],在各國的中毒事件中,沙門氏菌感染果蔬中毒也不在少數[5-7],是食品安全問題的熱點之一,備受關注。因此,為了能夠避免沙門氏菌侵染食物而被人食用,從源頭抑制沙門氏菌是十分必要的。

Nisin是一種天然多肽抗菌素類物質,其在半個世紀前就在食品中得到應用[8-9],其可應用于肉類、飲料等多種食物中,是一種常見的食品添加劑;檸檬酸作為食品添加劑,是在檸檬、柑橘等水果中提取出的一種無臭、無毒害產品,是食品加工中最常用的酸味劑,在國家標準GB2760-2014中,明確表示其可以作為安全食品添加劑使用[10]。甜櫻桃是一種典型的季節性水果,作為一種即摘即食水果,其抑菌保鮮一直是研究的熱點[11-16],一般采用涂膜保鮮、物理輻照、精油處理等方法處理甜櫻桃,但清洗處理使其菌體降低的方式還未發現;Nisin和檸檬酸的抑菌效果目前已經有學者進行了研究[17-21],涉及動物食品、生菜、鮮切蓮藕、苦瓜、黃瓜等多個方向,用于抑制單增李斯特菌,致腐菌等,但使用Nisin溶液、檸檬酸溶液及其復配溶液處理甜櫻桃,抑制沙門氏菌生長的研究還未見報道,本研究采用不同濃度的Nisin溶液、檸檬酸溶液及二者的復配溶液對甜櫻桃處理,既作為抑菌劑,又做為清洗劑,觀察其對接種在甜櫻桃中的沙門氏菌的抑制效果,為探究Nisin和檸檬酸對果蔬的抑菌效果提供更多的研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美早甜櫻桃(10±0.5)g 購于大連開發區百果園超市;鼠傷寒沙門氏菌標準菌株(CICC 21484) 購于中國工業微生物菌種保藏管理中心;沙門氏菌顯色培養基 青島海博生物技術有限公司;乳酸鏈球菌素(Nisin)、檸檬酸、無水乙醇 天津市科密歐化學試劑有限公司;實驗用水,新鮮去離子水 實驗室自制。

HVE-50高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司;AL204分析天平 瑞士梅特勒公司;HR40-II-A生物安全柜;TGL-20W臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀集團;DNP-9052電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;Harris Uni-CoreTM,Size 1.2 mm打孔器 海德創業(北京)生物科技有限公司;BagNixer4均質機 法國interscience公司;食品留樣恒溫箱 北京福意聯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 前準備 配制TSA固體培養基與TSB液體培養基,將TSB分裝至干燥的試管中,每支試管裝液10 mL,封口,121 ℃滅菌15 min,待用;將TSA 121 ℃滅菌15 min,將滅菌后的TSA溶液在無菌操作箱內分裝至一次性培養皿中,待用。

根據Chen[22]的實驗,配制不同濃度的Nisin溶液(10、50、100 μg/mL)、檸檬酸溶液(檸檬酸的質量分數分別為1、3、5 g/L)及二者的復配溶液(10 μg/mL Nisin溶液+1 g/L檸檬酸溶液、10 μg/mL Nisin溶液+3 g/L檸檬酸溶液、50 μg/mL Nisin溶液+1 g/L檸檬酸溶液、50 μg/mL Nisin溶液+3 g/L檸檬酸溶液),并在121 ℃滅菌15 min,待用。

1.2.2 沙門氏菌菌液制備 取出于-27 ℃保存的菌株,在生物安全柜中用無菌接種環取出菌株接種至TSA無菌平板上,在恒溫干燥培養箱中37 ℃培養24 h進行活化,挑取活化的單菌株,并接種至TSB液體培養基中,37 ℃培養24 h,得到原菌液,并稀釋涂到沙門氏菌顯色培養基上,確定原菌液菌落濃度,待用。

1.2.3 接種菌液制備 將原菌液冷凍離心,離心條件為4 ℃、5000 r/min,離心5 min,棄去上清液,將沉淀用0.1%蛋白胨水洗滌,重復3次上述實驗,得到接種菌液,并稀釋涂到沙門氏菌顯色培養基上,確定接種菌液菌落濃度在107cfu/mL,待用。

1.2.4 接種樣品制備 選取表面無破損,無腐爛點,果實較硬的甜櫻桃,每個櫻桃的質量為(10±0.5) g,使用無菌水清洗櫻桃3次,放入無菌室中,使用75%乙醇噴灑表面1次,并置于無菌操作臺中保持無菌狀態晾至櫻桃表面無任何液體。在每個櫻桃上用無菌打孔器均勻的打3個孔,放置30 min待用。

1.2.5 菌液接種到樣品 將接種菌液搖勻,使用100 μL的移液槍在生物安全柜中取100 μL原菌液均勻的接種到櫻桃的3個孔中,并在安全柜中放置30 min,使菌液完全侵入至櫻桃內,待用。

1.2.6 Nisin和檸檬酸對接種樣品的處理 在無菌室內的生物安全柜中,把接種晾干的(10±0.5) g樣品各9個分別放入100 mL無菌水、Nisin溶液、檸檬酸溶液以及二者復配溶液的無菌燒杯中,分別準備3杯上述溶液,用玻璃棒攪拌浸泡不同時間(5、10、15 min),取出燒杯中的樣品,在生物安全柜中晾干至無任何液體殘留,將晾干的樣品放入無菌均質袋中,并向均質袋中加入90 mL滅菌的0.1%蛋白胨水,在拍擊式均質機上連續均質1 min,取1 mL上清菌懸液,用0.1%蛋白胨水將原液稀釋,并選取10-2、10-4和10-63個濃度梯度,吸取100 μL涂至沙門氏菌顯色培養基上,每個濃度梯度做2個平行實驗,在恒溫干燥培養箱中37 ℃培養24～48 h,取出計數。

1.2.7 貯藏時間對抑菌效果的影響 將用無菌水、Nisin溶液、檸檬酸溶液以及二者復配溶液處理后晾干的樣品分別放入無菌均質袋中,放入8 ℃的冰箱中貯藏,在第2、4、6、8、10 d,分別取出樣品進行1.2.4的實驗,觀察貯藏時間對抑菌效果的影響。

1.3 數據處理

每個樣品設計三個平行,使用Excel軟件進行數據分析。實驗結果以平均值±正負偏差表示。數據采用ANOVA進行差異分析,以p<0.05為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 不同濃度Nisin溶液對甜櫻桃中沙門氏菌的影響

向甜櫻桃中接種沙門氏菌后,經過無菌水處理的樣品菌含量基本無下降,不斷攪拌清洗15 min后,菌落濃度僅僅從107cfu/mL降低至105cfu/mL,降低了2個數量級,而使用10 μg/mL的Nisin溶液攪拌清洗5 min即可以達到此效果,如圖1所示。隨著Nisin溶液中Nisin的質量分數增加,其抑菌效果也有顯著的提高(p<0.05),當使用100 μg/mL的Nisin溶液攪拌清洗5 min后,其菌落濃度可以從107cfu/mL降至102cfu/mL,當不斷攪拌清洗15 min,菌落濃度可以降至101cfu/mL,明顯的達到了清洗抑菌除菌的效果。

圖1 不同濃度Nisin溶液處理后沙門氏菌的菌落濃度Fig.1 Concentration of Salmonella in the treatment of Nisin solution with different concentrations

2.2 不同濃度的檸檬酸溶液對甜櫻桃中沙門氏菌的影響

使用檸檬酸溶液處理甜櫻桃后,其抑菌效果與Nisin溶液基本相似,如圖2所示。在使用最低濃度1 g/L檸檬酸溶液不斷攪拌清洗5 min后,菌落濃度從107cfu/mL降低至105cfu/mL,隨著溶液中檸檬酸的質量分數和攪拌時間的延長其抑菌效果也有顯著的提高(p<0.05),當使用5 g/L的檸檬酸溶液攪拌清洗5 min后,其菌落濃度可以從105cfu/mL降至102cfu/mL,當不斷攪拌清洗15 min,菌落濃度可以降至101cfu/mL,幾乎降低到最低檢出菌落數。

圖2 不同濃度檸檬酸溶液處理后沙門氏菌的菌落濃度Fig.2 Concentration of Salmonella in the treatment of citric acid solution with different concentrations

2.3 不同濃度的Nisin與檸檬酸復配溶液對甜櫻桃中沙門氏菌的影響

因單獨使用Nisin溶液或檸檬酸溶液無法達成低于沙門氏菌檢測限101cfu/mL的效果,故將二者復配處理樣品,其抑菌效果有著明顯的改善(p<0.05),結果如圖3所示。隨著復配溶液中Nisin與檸檬酸的質量分數增加,其抑菌效果隨之顯著增強,當使用10 μg/mL Nisin溶液與1 g/L檸檬酸溶液復配后攪拌清洗5 min,其菌落濃度可以從107cfu/mL降至104cfu/mL,當使用50 μg/mL Nisin溶液與3 g/L檸檬酸溶液復配后攪拌清洗5 min,菌落濃度可以降至102cfu/mL,而不斷清洗攪拌15 min,可以使菌落濃度降至檢測限以下,真正達到完全抑菌除菌的效果。

圖3 Nisin溶液與檸檬酸溶液復配處理后沙門氏菌的菌落濃度Fig.3 Concentration of Salmonella in the treatment of the mixture of Nisin and citric acid solution注：“*”低于檢測限。

2.4 貯藏時間對甜櫻桃中沙門氏菌的影響

2.4.1 最高濃度溶液處理后貯藏 為觀察抑菌劑是否可以達到始終抑菌的效果,將樣品進行不同處理后進行長時間的貯藏,從第2 d到第10 d,與空白組比較,可發現,檸檬酸溶液與Nisin溶液處理后效果基本一致,其一直具有良好的抑菌效果(p<0.05),如圖4與圖5所示。在貯藏2 d以后,隨著時間的延長,菌落數也隨之減少,空白組中,直至第10 d,樣品中沙門氏菌的菌落濃度才低于檢測限,而使用5 g/L檸檬酸溶液或100 mg/mL Nisin溶液處理5 min和10 min的樣品在第6 d即接近最低檢測限,第8 d降低至檢測限以下;當處理15 min,在第4 d就無法檢出,可以證明抑菌劑一直發揮著抑菌的作用。對于空白組在10 d無法檢出沙門氏菌,根據羅嬋[23]的實驗結果分析,因腐敗菌的生長及營養物質的消耗,且櫻桃的內部組織發生了某些肉眼無法觀測的變化,導致其內部pH也發生變化,無法滿足沙門氏菌的生長條件,最終導致沙門氏菌消亡。使用Nisin和檸檬酸的處理樣品,可能因二者影響了沙門氏菌的生長環境,且檸檬酸顯酸性,環境中的pH有所降低,隨著天數的增加,營養物質消耗,生長環境對沙門氏菌也不利,最終加快其消亡。

圖4 5 g/L檸檬酸溶液處理后沙門氏菌的菌落濃度Fig.4 Concentration of Salmonella in the treatment of 5 g/L citric acid solution

圖5 100 μg/mL Nisin溶液處理后沙門氏菌的菌落濃度Fig.5 Concentration of Salmonella in the treatment of 100 μg/mL Nisin solution

2.4.2 最優濃度溶液與復配溶液處理15 min后貯藏 因使用3 g/L檸檬酸溶液與50 μg/mL Nisin溶液復配處理樣品后,可以完全抑菌,菌體無法檢測,故只使用其他3種復配溶液處理樣品并與空白組作比對,從第2 d到第10 d,與空白組比較,處理組一直具有良好的抑菌效果(p<0.05),如圖6所示。與最優抑菌濃度的檸檬酸溶液和Nisin溶液比較,1 g/L檸檬酸溶液與10 μg/mL Nisin溶液復配溶液的抑菌效果相對較差,其他兩種的抑菌效果基本相同,貯存至第4 d,除空白和1 g/L檸檬酸溶液與10 μg/mL Nisin溶液復配溶液,沙門氏菌的菌落濃度均降低至檢出限以下,至第10 d,所有處理組的沙門氏菌菌落濃度降至檢出限以下。

圖6 不同濃度溶液處理15 min后沙門氏菌的菌落濃度Fig.6 Concentration of Salmonella in the treatment of different solutions with 15 minutes

3 結論

Nisin溶液和檸檬酸溶液對沙門氏菌都有很好的抑菌效果,二者復配后效果更加顯著。隨著溶液中Nisin和檸檬酸質量分數的增加,抑菌效果增強,當使用100 μg/mL Nisin溶液、5 g/L檸檬酸溶液、1 g/L檸檬酸溶液與50 μg/mL Nisin溶液復配溶液和3 g/L檸檬酸溶液與10 μg/mL Nisin溶液復配溶液清洗攪拌樣品15 min,四者的抑菌效果基本相似,當使用3 g/L檸檬酸溶液與50 μg/mL Nisin溶液復配溶液清洗攪拌樣品15 min,可以使沙門氏菌的菌落濃度降至檢測限以下,充分展現了除菌作用。隨著貯藏時間的增加,處理組與空白組中沙門氏菌的菌落總數含量表現一致,呈下降趨勢。使用1 g/L檸檬酸溶液與50 μg/mL Nisin溶液復配溶液和3 g/L檸檬酸溶液與10 μg/mL Nisin溶液復配溶液處理樣品,沙門氏菌菌落總數在第4 d即降至檢測限,使用單種抑菌劑處理的樣品,在第6 d亦無法檢出,而空白組中菌落總數在第8 d仍可以檢出,結果證明,貯存時間不影響Nisin溶液和檸檬酸溶液的抑菌性,其存在長期的良好的抑菌效果。

本實驗很好的驗證了H Liu[24]、李增利[25]等人對Nisin的抑菌機制,Nisin在某些情況下抑制外膜破裂的革蘭氏陰性菌,其在進入細胞后,有很好的抑菌效果;隋莎莎[26]的實驗表明,檸檬酸可以抑制孢子的萌發,同時,檸檬酸做為強有機酸,可以使部分微生物失去活性[27],且Nisin在酸性條件下抑菌性更穩定[28],二者復配后抑菌效果更加顯著。

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Inhibitory effects of Nisin and citric acid on Salmonella on sweet cherry

QIAN Hong-mei1,2,HU Wen-zhong2,*,LI Lin2,3,ZHAN Yang2,3,GUAN Yu-ge2,4

(1.College of Food Science,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.Key Laboratory of Biotechnology and Bioresources Utilization,Ministry of Education,Dalian 116600,China;3.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;4.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

In order to study the growth,reproduction and control of sweet cherry,different concentrations of Nisin solution,citric acid solution and mixed solutions were used to handle sweet cherry inoculated with Salmonella,to observe and analysis the inhibitory effect of Nisin and citric acid. The results showed that both Nisin solution and citric acid solution could achieve antibacterial effect,and with the increase of Nisin(10 μg/mL to 100 μg/mL)and citric acid(1 g/L to 5 g/L),the inhibitory effect increased significantly. At the same time,the results also showed that antibacterial effect of 100 μg/mL Nisin solution and 5 g/L citric acid solution,10 μg/mL Nisin and 3 g/L citric acid mixed solution and 50 μg/mL Nisin and 1 g/L citric acid mixed solution was basically the same,colony concentration can be reduced to 104cfu/mL after treatment for 5 min,when using 50 μg/mL Nisin and 3 g/L citric acid mixed solution for 15 min to handle samples,the concentration of Salmonella colonies decreased to below the detection limit,with the increase of storage time to tenth day,Nisin and citric acid remain antibacterial effects as usual,fully achieved the antibacterial sterilization effect.

sweet cherry;Salmonella;Nisin;citric acid;antibacterial

2017-01-19

錢紅玫(1991- )，女，在讀碩士，研究方向：食品質量與安全，E-mail：qhm171@qq.com。

*通訊作者:胡文忠(1959- )，男，博士，教授，研究方向：食品科學，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn。

國家重點研發計劃項目(2016YFD0400903)；國家自然科學基金(31471923，31172009)；國家“十二五”科技支撐計劃項目(2012BAD38B05)。

TS255.7

A

1002-0306(2017)15-0275-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.051