海洋金屬蛋白酶MP仿生親和材料純化條件的優化

楊 娟,李尚勇,馬子賓,劉均忠,郝建華,王躍軍,孫 謐,*

(1.中國水產科學研究院黃海水產研究所,海洋國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室,山東青島 266071;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

海洋金屬蛋白酶MP仿生親和材料純化條件的優化

楊 娟1,2,李尚勇1,馬子賓1,劉均忠1,郝建華1,王躍軍1,孫 謐1,*

(1.中國水產科學研究院黃海水產研究所,海洋國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室,山東青島 266071;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

目的:建立一種高效的海洋金屬蛋白酶MP仿生親和純化方法。方法:采用硼酸仿生親和材料,利用單因素實驗,Plackett-Burman實驗設計、Box-Behnken實驗等響應面優化法,對純化條件進行優化,利用SDS-PAGE及HPLC分析純化后樣品純度。結果:利用單因素法和響應面法對純化條件進行優化和分析,獲得硼酸瓊脂糖凝膠親和柱的最佳純化條件為:粗酶液濃度在100 mg/mL,上樣緩沖液為pH8.6的甘氨酸-氫氧化鈉,上樣速度1 mL/min,洗脫緩沖液為pH5.2的磷酸氫二鈉-檸檬酸,洗脫速度2 mL/min,洗脫緩沖液加入75 mmol/L的甘露醇時純化效果最好,純化效率提高了11倍,純化后的樣品純度達到98.8%。

金屬蛋白酶MP,親和層析,純化

蛋白酶是一類可催化蛋白質或肽類的肽鍵水解的酶類,廣泛存在于動物內臟、植物莖葉、果實和微生物中。蛋白酶是繼淀粉酶之后成為新一種在全世界廣泛應用的酶制劑,全球蛋白酶銷售額可占到整個酶工業總產值的60%以上[1]。蛋白酶與人類密切相關,涉及到生活的各個方面。可用于洗滌劑、制革、毛皮、蛋白水解物、釀酒、醬油,以及紡織、化妝品等的生產和生物材料的提取[2]。蛋白酶在生物體的生理過程中發揮著至關重要的作用,它們的非正常活動會影響許多疾病的發展,如纖維化、關節炎、癌癥、心血管疾病、腎炎和中樞神經系統障礙。高純度的蛋白酶制劑可以應用到醫藥行業,目前,美國食品藥品監督管理局(FDA)已經批準了12種蛋白酶制劑用于心腦血管疾病、敗血癥等的治療,目前,還有超過50種新的蛋白酶制劑處于不同階段的臨床研究[3]。

根據催化活性位點類型蛋白酶可分為以下四類:絲氨酸蛋白酶類,活性中心有絲氨酸參與催化反應的酶;半胱氨酸蛋白酶類,活性中心有半胱氨酸參與催化反應的酶;天冬氨酸蛋白酶類,活性中心有2個天冬氨酸參與催化反應的酶;金屬蛋白酶類,有金屬離子,通常是Zn2+參與催化反應的酶[4-5]。在這四類蛋白酶中,只有未標記的絲氨酸蛋白酶能夠通過對氨基苯甲脒仿生親和柱一步純化,這一親和純化方法極大的擴展了絲氨酸蛋白酶在醫藥生物領域的應用[6]。但是,金屬蛋白酶的研究起步較晚,國際上還沒有針對金屬蛋白酶的仿生親和純化方法。傳統的金屬蛋白酶純化需要經過鹽析、離子交換層析等多個步驟,較為復雜且純度較低[7]。

海洋金屬蛋白酶MP是本實驗室從海洋細菌YS-80-122中分離出的一種新型適冷堿性酶,分子量為48 kD。該酶是典型的含Zn2+的金屬蛋白酶,已經被廣泛應用到洗滌劑、添加劑等方面[7]。金屬蛋白酶MP晶體結構(PDB:3U1R)分析表明親和配體與活性中心結合可純化該蛋白酶[8]。通過初步的虛擬篩選和實驗驗證,硼酸衍生物(BADS)可以抑制金屬蛋白酶MP的活性[8]。苯基硼酸可與任何分子形成含1,2-順-乙二醇基團的臨時共價鍵,且已廣泛應用于含1,2-順-乙二醇的生物分子的親和純化,如糖蛋白、糖肽、核苷和核酸等[9-10]。本文以金屬蛋白酶MP為研究對象,經前期實驗篩選,選用硼酸瓊脂糖凝膠作為親和材料填制的親和層析柱,考察了樣品濃度、上樣及洗脫流速、緩沖液種類及pH,洗脫競爭劑等對純化的影響,建立了一種高效的金屬蛋白酶MP仿生親和方法,純化后的樣品純度達到98.8%,為其高值化應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金屬蛋白酶MP 由黃海水產研究所海洋酶工程課題組自行制備;硼酸瓊脂糖凝膠柱(25 mm×16 mm) 北京韋氏博慧色譜有限公司;TSK3000SW柱 日本Tosoh公司;醋酸、醋酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、甘氨酸、氫氧化鈉、氯化鈉、Tris、山梨醇、甘露醇等試劑 均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

AKTA快速蛋白液相色譜(FPLC) Amersham公司;FA1004型電子天平 上海精科天平;SHIMADZU UV-2550島津分光光度計 日本島津公司;LKB2219恒溫水浴鍋 瑞典BROMMA公司;Bio-Rad Mini III 蛋白電泳儀 美國伯樂公司;高效液相色譜(HPLC) 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶比活力的測定 酶活測定參考國家標準GB/T 23527-2009,具體如下:1 mL稀釋后的酶液與1 mL 1%的酪素混合,20 ℃水浴10 min。加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸(TCA)終止反應,靜置10 min后濾紙過濾。空白對照加樣順序為酶液-TCA-酪素。取上清液1 mL加0.4 mol/L碳酸鈉溶液5 mL、福林試劑1 mL,置于40±0.2 ℃水浴中顯色20 min取出,于680 nm波長下測定其吸光度。每毫升液體酶在20 ℃、pH10.5條件下水解酪蛋白,每分鐘釋放1 μg酪氨酸所需的酶量定義為一個酶活單位。

蛋白含量的測定采用Bradford法,以牛血清蛋白(BSA)為標準蛋白。

1.2.2 親和純化條件優化

1.2.2.1 樣品不同濃度對純化效果的影響 利用快速蛋白液相色譜(FPLC)對金屬蛋白酶MP進行硼酸親和純化。具體方法如下:配制25、50、75、100、125、150 mg/mL六種不同濃度的酶溶液,A液為50 mmol/L pH9.0甘氨酸-氫氧化鈉,B液為0.2 mol/L pH4.0醋酸-醋酸鈉,上樣流速1 mL/min,洗脫條件2 mL/min,100% B洗脫。上樣1 mL,收集洗脫峰測其酶比活力,考察樣品不同濃度對純化效果的影響。

1.2.2.2 不同流速對純化效果的影響 分別以0.5、1、1.5、2.0、2.5 mL/min的流速上樣、洗脫,上樣濃度為100 mg/mL,其他條件不變,利用快速蛋白液相色譜(FPLC)對金屬蛋白酶MP進行純化。測洗脫峰樣品的酶比活力,分析上樣、洗脫流速對純化效果的影響。

1.2.2.3 不同pH的甘氨酸-氫氧化鈉上樣緩沖液對純化的影響 經過預實驗,得出甘氨酸-氫氧化鈉作為上樣緩沖液時硼酸瓊脂糖凝膠柱對金屬蛋白酶MP的吸附效果較好。金屬蛋白酶MP的最適pH范圍是8.0～11.0[8],硼酸瓊脂糖凝膠柱上樣緩沖液的最適pH范圍是8.5～10。根據兩者最適pH范圍,配制pH8.6、pH9.0、pH9.4、pH9.8、pH10.2五個不同pH的甘氨酸-氫氧化鈉上樣緩沖液,利用快速蛋白液相色譜(FPLC)對金屬蛋白酶MP進行純化。測洗脫峰樣品的酶比活力,分析不同pH的甘氨酸-氫氧化鈉上樣緩沖液對純化效果的影響。

1.2.2.4 不同的洗脫緩沖液對純化的影響 硼酸瓊脂糖凝膠柱洗脫緩沖液的最適pH范圍是4～6,選取能達到pH4.0的三種常見酸性緩沖液,醋酸-醋酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉-檸檬酸,每種緩沖液配制pH4.0、pH4.4、pH4.8、pH5.2、pH5.6、pH6.0六個不同的pH,利用快速蛋白液相色譜(FPLC)對金屬蛋白酶MP進行純化。測洗脫峰樣品的酶比活力,分析每種緩沖液在不同pH條件下對純化效果的影響,確定最適的洗脫緩沖液及其pH。

1.2.2.5 競爭洗脫劑及競爭洗脫劑濃度的影響 在洗脫緩沖液中分別加入Tris、甘露醇、山梨醇三種競爭洗脫劑,利用快速蛋白液相色譜(FPLC)對金屬蛋白酶MP進行純化。與不加競爭洗脫劑的洗脫緩沖液對比純化效果。分別在洗脫緩沖液中加入25、50、75、100、125 mmol/L的甘露醇,收集洗脫峰并測其酶比活力。

1.2.2.6 高效液相色譜法(HPLC)純度分析 利用高效液相色譜法對純化后的樣品進行純度分析。利用TSK3000SW凝膠過濾柱在波長280 nm處檢測。流動相為100 mmol/L PBS,100 mmol/L Na2SO4,0.05% NaN3,流速為0.6 mL/min。

2 結果與討論

2.1 親和純化條件單因素優化

2.1.1 不同上樣濃度對純化效果的影響 硼酸凝膠柱的柱高、柱容積一定,其載樣量是一定的。從圖1可以看出,隨著樣品濃度的增加,洗脫峰的酶比活力不斷增加;在樣品濃度達到100 mg/mL時,洗脫峰的酶比活力達到最高,金屬蛋白酶MP的吸附量達到飽和。因此,上樣濃度宜取100 mg/mL。

圖1 樣品濃度對純化的影響Fig.1 Effect of sample concentration on purification

2.1.2 不同流速對純化效果的影響 由圖2可以看出,上樣速度為1 mL/min時,洗脫峰的酶比活力最高,純化效果最好。硼酸親和配體與活性中心結合純化金屬蛋白酶MP,如果上樣速度快,會影響蛋白酶與配基的充分結合,使金屬蛋白酶MP的吸附效率降低;如果上樣速度慢,則配基與蛋白結合力過強,影響洗脫效果。因此,上樣速度以1 mL/min較好。

圖2 上樣速度對純化的影響Fig.2 Effect of sample rate on purification protocol

如圖3結果顯示,并不是洗脫速度越快,純化效果越好。洗脫速度過快可能會造成洗脫不完全,純化效率降低;洗脫速度過慢則會造成操作效率低,并且使洗脫峰型較寬,洗脫液的酶活濃度降低。因此,洗脫速度以2.0 mL/min較好。

圖3 洗脫速度對純化的影響Fig.3 Effect of elution rate on purification protocol

2.1.3 不同pH的甘氨酸-氫氧化鈉上樣緩沖液對純化的影響 生物大分子與親和配體結合時具有專一性,與其特殊的空間構型有關,兩者之間的結合力主要是疏水作用、范德華力、靜電作用、氫鍵作用[11]。所以改變pH可能會改變金屬蛋白酶MP與硼酸瓊脂糖凝膠柱的結合力。從圖4可以看出隨著pH的不斷升高,洗脫峰中的酶比活力逐漸降低,在pH8.6時酶比活力最高為2337 U/mg。因此,確定上樣緩沖液甘氨酸-氫氧化鈉的pH為8.6。

圖4 不同pH的甘氨酸-氫氧化鈉對純化的影響Fig.4 Effect of Gly-NaOH buffer with different pH on purification protocol

2.1.4 不同的洗脫緩沖液對純化的影響 洗脫是通過改變條件解離親和絡合物,使目的物從親和材料上脫落下來并回收的過程[11]。洗脫緩沖液種類是影響純化效果的重要因素,并且親和層析洗脫峰的大小除了與洗脫緩沖液的種類密切相關之外,還與緩沖液的pH有關。圖5中可以看出,醋酸-醋酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉兩種緩沖液對金屬蛋白酶MP的洗脫效果不佳,而磷酸氫二鈉-檸檬酸作為洗脫緩沖液時洗脫峰的酶比活力較高,且在pH5.2時酶比活力最高,達到2942 U/mg,純化效果最好。因此選擇pH5.2的磷酸氫二鈉-檸檬酸作為洗脫緩沖液。

圖5 不同洗脫緩沖液不同pH對純化的影響Fig.5 Effect of different elution buffer with different pH on purification protocol

2.1.5 不同競爭洗脫劑及競爭洗脫劑濃度的影響 生物大分子與親和配基結合后,洗脫緩沖液中不同的競爭洗脫劑與蛋白酶形成競爭線性洗脫[12]。硼酸瓊脂糖凝膠柱純化金屬蛋白酶MP時在洗脫緩沖液加入甘露醇、山梨醇、Tris進行競爭洗脫[12-13]。選取這三種競爭洗脫劑加入洗脫緩沖液中考察對純化效果的影響。從圖6可以看出,洗脫緩沖液中加入甘露醇后洗脫峰的酶比活力高于不加任何競爭洗脫劑洗脫緩沖液的洗脫峰的酶比活力,說明甘露醇與金屬蛋白酶MP競爭硼酸配基使其洗脫效率提高。

表2 PB實驗篩選主要影響因素的實驗設計及實驗結果Table 2 Design and results in PB

圖6 不同競爭洗脫劑對純化的影響Fig.6 Effect of different competitive eluent on purification protocol

從圖7可以看出,甘露醇含量達到75 mmol/L時,酶比活力達到最高3491 U/mg。當甘露醇濃度超過75 mmol/L時洗脫峰的酶比活力急劇下降,可能是甘露醇濃度過高導致總酶活降低。因此,在磷酸氫二鈉-檸檬酸中加入75 mmol/L的甘露醇。

圖7 甘露醇含量對純化的影響Fig.7 Effect of mannitol concentration on purification protocol

2.2 響應面法優化純化條件

2.2.1 Plackett-Burman實驗篩選主要因子 從單因素實驗中選取六個因素:洗脫緩沖液pH、上樣緩沖液pH、競爭洗脫劑濃度、樣品濃度、上樣速度、洗脫速度,通過PB實驗為響應面優化純化條件篩選出主要影響因子。

表1 Plackett-Burman設計因子水平Table 1 The level of factor in Plackett-Burman

從表3中可以看出樣品濃度是最顯著的影響因子,洗脫緩沖液pH、上樣緩沖液pH的p值均<0.05,且三者的貢獻值之和達89.04%。因此,三者為純化條件中的主要影響因子。

2.2.2 響應面Box-Behnken確定顯著因素的最優水平 根據PB實驗確定的主要影響因子,借助Design Expert.V8.0.6軟件,采用Box-Behnken的原理設計三因素三水平的響應面分析實驗,進一步探討洗脫緩沖液pH、上樣緩沖液pH、樣品濃度對金屬蛋白酶MP純化的影響。

表3 實驗設計分析Table 3 The analysis of the PB

表4 響應面因子及水平Table 4 Factors and levels of RSM

表5 Box-Behnken設計及結果Table 5 Design of Box-Behnken and results

表6 響應面模型方差分析Table 6 Analysis of variance for the response surface model

由表6可以看出模型的p值小于0.0001,說明該模型是顯著的;失擬項p=0.0726>0.05,表明該模型失擬度不顯著。其中B、C、AC、A2、B2、C2的p值均小于0.05,是其顯著模型項。二次多項回歸方程為:

Y=+3504.40-91.75A+145.63B+145.88C+35.25AB-171.48AC-111.00BC-522.70A2-510.95B2-712.95C2

利用Design Expert.V8.0.6軟件分析數據得到三因素交互作用如圖8所示,可明顯看出各因素之間的交互作用對響應值酶比活力的影響。從圖中可以看出,AC的曲面較為明顯,交互作用較大;而AB、BC的曲面圖相對較平緩,表明交互作用不顯著。

圖8 響應面三維圖和對應的等高線圖Fig.8 Three-dimensional and corresponding contour plot of response surface

2.2.3 驗證實驗 對回歸方程求導可得到該模型極值點,當樣品濃度為102.09 mg/mL,甘氨酸-氫氧化鈉pH為8.57,磷酸氫二鈉-檸檬酸pH為5.25時,酶比活力達到最大響應值,理論最高酶比活力為3523.24 U/mg。

為方便操作,將實驗條件設定為:樣品濃度為100 mg/mL,甘氨酸-氫氧化鈉pH為8.6,磷酸氫二鈉-檸檬酸pH為5.2。在該條件下利用快速蛋白液相色譜(FPLC)對金屬蛋白酶MP進行純化,實際酶比活力為3508 U/mg,與理論值接近。該結果證明此模型是可靠的,可有效的優化金屬蛋白酶MP的純化條件。

2.3 純化后樣品純度分析

將驗證實驗的硼酸瓊脂糖凝膠柱洗脫峰進行SDS-PAGE蛋白電泳,通過SDS-PAGE電泳圖9可以看出,硼酸瓊脂糖凝膠柱的洗脫峰有明顯的目的蛋白條帶(條帶2,分子量48 kD),且蛋白條帶單一,純度較高。

圖9 SDS-PAGE蛋白電泳圖Fig.9 SDS-PAGE analysis of the protein 注:M:Marker,1:粗酶樣品,2:純化樣品。

對優化后的仿生親和方法進行蛋白質純度檢測。在1.2.2.6色譜條件下,取驗證實驗洗脫峰樣品溶液進樣20 μL,保存色譜峰圖[14]。根據峰面積歸一法,計算金屬蛋白酶MP的純度。金屬蛋白酶MP經過高效液相色譜法檢測后的純度結果如圖10。由此圖可以看出,金屬蛋白酶MP表現為單一的色譜峰,峰型較為對稱,分離純度較好。經過峰面積歸一法計算,其純度高達98.8%。

圖10 高效液相色譜法檢測金屬蛋白酶MP的純度Fig.10 HPLC for the determination of the purity of MP

3 結論與討論

采用硼酸瓊脂糖凝膠柱(25 mm×16 mm),通過單因素實驗得出硼酸瓊脂糖凝膠柱的最佳純化條件:酶液濃度在100 mg/mL,上樣緩沖液為pH8.6的甘氨酸-氫氧化鈉,上樣速度1 mL/min,洗脫緩沖液為pH5.2的磷酸氫二鈉-檸檬酸,洗脫速度2 mL/min,洗脫緩沖液加入75 mmol/L的甘露醇。

通過Plackett-Burman實驗對影響硼酸瓊脂糖凝膠柱純化金屬蛋白酶MP的6個單因素進行篩選,得出甘氨酸-氫氧化鈉上樣緩沖液的pH、磷酸氫二鈉-檸檬酸洗脫緩沖液pH、樣品濃度三個主要影響因素。利用這三個因素,設計Box-Behnken響應面分析實驗并建立多項回歸方程。通過回歸方程擬合各因素與響應值的關系,最終確定金屬蛋白酶MP純化采用pH為8.57的甘氨酸-氫氧化鈉上樣緩沖液,pH為5.25的磷酸氫二鈉-檸檬酸洗脫緩沖液,上樣的樣品濃度為102.09 mg/mL時,酶比活力得到最大響應值為3523.24 U/mg,經實驗驗證實際酶比活力為3508 U/mg,與理論響應值基本符合,說明該響應面模型可靠。純化后樣品純度達到98.8%,純化倍數提高11倍。

傳統的蛋白酶MP純化需要經過鹽析、離子交換層析和凝膠過濾層析等多個步驟,純化工藝周期長、成本高、且純度低,不適合生產高端酶制劑[7,15]。親和層析和經典柱層析相比,具有吸附洗脫速率快、色譜柱壓較低、生產規模容易按比例放大等多項優點[16-17]。因此,建立海洋金屬蛋白酶MP的高效親和純化技術,將為高純度蛋白酶制劑在醫藥、食品工業等方面的廣泛應用奠定基礎。

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Optimization of purification protocol of biomimetic affinity material for marine metalloprotease MP

YANG Juan1,2,LI Shang-yong1,MA Zi-bin1,LIU Jun-zhong1,HAO Jian-hua1,WANG Yue-jun1,SUN Mi1,*

(1.Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts of Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Qingdao 266071,China; 2. College of Food Sciences&Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Objective:To establish an efficient method for biomimetic affinity purification of marine metalloprotease MP. Methods:Using the biomimetic affinity materials to optimize the purification conditions by response surface optimization method,such as the single factor experiment,Plackett-Burman experiment design,Box-Behnken experiment. And the purity of purified samples by SDS-PAGE and HPLC was analyzed. Results:The purification conditions were optimized by single factor experiment and the response surface design. The study indicated that the best purification conditions of the boronic acid gel were:When enzyme concentration was 100 mg/mL,the optimal loading buffer was glycine-sodium hydroxide of pH8.6 and the sample rate was 1 mL/min. The elution buffer was disodium hydrogen phosphate-citric acid of pH5.2,and elution rate was 2 mL/min,the elution buffer added to mannitol of 75 mmol/L,the purification efficiency was enhanced 11 times and the purity above 98.8%.

Metalloproteinase MP;affinity chromatography;purification

2017-02-21

楊娟(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學與工程，E-mail：18766219745@163.com。

*通訊作者:孫謐(1962-)，女，博士，研究員，研究方向：海洋產物與酶資源，E-mail:sunmi@ysfri.ac.cn。

NSFC-山東聯合資助海洋研究中心項目(U1406402-5)；國際科技合作與交流專項 (2014DFG30890)；國家實驗室-鰲山科技計劃(2015ASKJ02-06)；國家自然科學基金(41376175)；國家863計劃(2014AA093516)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)13-0146-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.028