食品中金黃色葡萄球菌生物被膜形成基因分析及影響因素研究

馬伊薩蘭,張 榮,王洪志,趙燕英,陳 娟,劉 驥,唐俊妮

(西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

食品中金黃色葡萄球菌生物被膜形成基因分析及影響因素研究

馬伊薩蘭,張 榮,王洪志,趙燕英,陳 娟,劉 驥,唐俊妮*

(西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

分析金黃色葡萄球菌食品分離菌株生物被膜形成相關基因,研究茶多酚和乳酸鏈球菌素(Nisin)對不同菌株生長及生物被膜形成的影響。以實驗室保存的16株金黃色葡萄球菌食品分離菌株為研究對象,采用聚合酶鏈式反應(PCR)檢測14種生物被膜形成相關基因;通過微孔板法研究不同濃度茶多酚和Nisin對不同菌株生長的抑制作用,確定最小抑菌濃度(MIC);在此基礎上進一步研究茶多酚和Nisin對生物被膜形成能力影響。結果表明:14種生物被膜形成相關基因中有10種被檢出,其中cna、ebpS、fib和icaAD基因檢出率為100%,sasC為87.5%、fnbA為68.75%、sasG為68.75%、clfB為68.75%、eno為62.5%,icaBC為56.25%;16株菌株中均不攜帶bbp、bap、clfA和fnbB基因。16株菌株均能形成生物被膜,但形成能力有差異,其中F23、F44、F58、F64、F71、F86、F107和F109等8株菌株為被膜強形成菌株,F7、F19、F40、F46、F60、F99、F101、F106等8株菌株為被膜弱形成菌株。茶多酚和Nisin對16株金黃色葡萄球菌食品分離菌株的MIC范圍分別為0.1～0.2 g/L和0.125～1 g/L,茶多酚和Nisin在1/2MIC和1/4MIC濃度下對生物被膜形成抑制作用明顯(p<0.05),且茶多酚抑制效果強于Nisin。本研究結果為食品中金黃色葡萄球菌生物被膜形成控制具有參考意義。

金黃色葡萄球菌,生物被膜形成相關基因,最小抑菌濃度,茶多酚,乳酸鏈球菌素

金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌之一,能形成保護自身在不利環境條件下生存的生物被膜。生物被膜是大量細菌細胞嵌入自我分泌的可附著于生物和非生物體表面且可阻礙抗生素或消殺劑滲透的胞外基質的聚合物[1],生物被膜可通過胞間粘附多糖和微生物表面成分識別粘附基質分子形成[2-4]。在金黃色葡萄球菌中,一些菌株依賴于細胞分泌的β-1,6-聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)或黏附多糖(PIA)形成生物被膜,PIA/PNAG由ica操縱子(icaABCD)編碼,細胞與非親水性表面相互作用通過PIA控制[5];還有一些菌株不依賴于PIA/PNAG進行粘附,這類金黃色葡萄球菌生物被膜的形成主要是通過粘附基質分子的共價結合而引起細胞相互聚集,如凝集因子ClfA和ClfB[6],纖連蛋白結合蛋白FnbA和FnbB[7],纖維蛋白原結合蛋白Fib、膠原結合蛋白Cna[8],層粘連蛋白結合蛋白Eno,彈力蛋白結合蛋白Ebp和骨唾液酸蛋白結合蛋白Bbp[9]。這些蛋白粘附基質分子在介導細菌粘附和生物被膜形成發展過程中發揮重要作用。粘附基質分子是引發骨與關節以及人工假體等感染的重要因素[10]。細菌生物被膜的形成幫助細菌粘附到生物或非生物材料表面并定植擴散,阻礙抗生素滲透,大大增加了細菌的存活率和食品污染率,增加了慢性或復發性的細菌感染嚴重程度并導致細菌對抗菌劑或抗生素的耐藥模式。基于生物被膜引起的慢性細菌性感染以及細菌耐藥性不斷增加的趨勢,在治療病原菌感染中探索新型治療策略也逐漸成為學者們的研究焦點。Nisin可以抑制細菌細胞壁的合成或嵌入膜形成孔隙,對大多數革蘭氏陽性菌甚至一些多重耐藥菌株具有較高的抗菌活性[11],可有效抑制耐藥菌株和浮游細胞的生長,也有學者發現Nisin對細菌生物被膜的形成也有一定抑制作用[12-14]。茶多酚已被證實對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有抑菌活性,可抑制細菌對口腔表面附著[15-16]。本文擬針對金黃色葡萄球菌食品分離菌株生物被膜形成相關基因、生物被膜形成能力以及茶多酚和Nisin對菌株生物被膜形成的影響進行研究,為食品中金黃色葡萄球菌生物被膜形成的控制策略提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

菌株來源 實驗室保存的16株金黃色葡萄球菌食品分離菌株;胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)、Baird-Parker(BP)瓊脂基礎 青島海博生物技術有限公司;茶多酚、Nisin 上海源葉生物科技有限公司;草酸銨、甲醇、冰乙酸 分析純,成都市科龍化工試劑廠;結晶紫 Amresco公司。

Eppendorf 5804R型冷凍離心機 Eppendorf中國有限公司;Bio-Rad PTC-200 PCR儀 Bio-Rad公司;Elx808酶標儀 日本BIO-TEK公司;DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠;GHP-9270隔水式恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司;凝膠成像系統(補充相關信息)。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取 將保存的16株金黃色葡萄球菌各取50 μL分別接種于5 mL的TSB培養基中,37 ℃,轉速150 r/min培養18 h。取1 mL菌懸液4 ℃條件下12000 r/min離心2 min后,收集菌體,提取細菌DNA方法參考文獻[17]進行,提取得到的DNA樣本于-20 ℃保存,用于生物被膜形成相關基因檢測。

1.2.2 生物被膜形成相關基因的檢測 檢測14種生物被膜形成相關基因,引物和擴增條件參考文獻[18]。PCR產物采用瓊脂糖電泳和凝膠成像系統檢測。每一種基因的PCR陽性產物選取一管送至上海生工生物工程技術服務公司進行測序和比對驗證。

1.2.3 茶多酚和Nisin對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度的檢測 采用微量肉湯稀釋法測定茶多酚和Nisin對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC),將培養過夜的菌液按1∶100接種到分別接種于96孔培養板中,使終濃度達到105CFU/mL。根據《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》(GB2760-2014)規定的茶多酚和Nisin最大使用限量0.8 g/L以及0.5 g/L的要求,利用二倍稀釋法,茶多酚的終濃度分別設置為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 g/L及對照組(C),Nisin的終濃度分別設置為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 g/L及對照組(C)。每個濃度梯度3個平行,同時設置空白組。實驗組中加入160 μL的TSB、20 μL菌液及20 μL各稀釋濃度的茶多酚或Nisin,對照中用20 μL的無菌水代替茶多酚或Nisin,空白組中只加200 μL的TSB。37 ℃培養16 h,觀察能夠抑制金黃色葡萄球菌生長的茶多酚或Nisin的最低濃度作為各自的最小抑菌濃度MIC。針對Nisin未測出MIC值的5株菌株,提高Nisin濃度為1、0.5、0.25 g/L,重新按上述方法進行測定。

1.2.4 微孔板法檢測金黃色葡萄球菌菌株生物被膜形成能力 通過Baird-Parker瓊脂平板分別純化16株樣品菌株,挑取單菌落接種于TSB增菌液中,37 ℃,150 r/min過夜培養,作為原始接種菌液。微孔板法采用文獻[19]描述的步驟進行操作。其中,96孔板法中閾值(ODc)的定義為空白吸光值的2倍。判定標準是根據三次重復所測得的吸光值,將金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力分為不形成生物被膜菌株(OD≤ODc),生物被膜弱形成菌株(ODc≤OD≤2×ODc),以及生物被膜強形成菌株(2×ODc≤OD)。

1.2.5 茶多酚和Nisin對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響 研究茶多酚和Nisin在不同抑菌濃度下(1/2 MIC、1/4MIC、1/8MIC)對7株生物被膜強形成菌株生物被膜形成能力的影響。設置空白組、對照組、實驗組1和實驗組2,每組每個待測樣品做3個平行。實驗組每孔分別加入160 μL的TSB和20 μL菌液,對照組中加入20 μL無菌水,空白組為200 μL的TSB。實驗組1中加入20 μL不同濃度的茶多酚,實驗組2中加入20 μL不同濃度的Nisin,37 ℃培養48 h。培養結束后,用移液槍移除浮游菌體,吸取200 μL的PBS于96孔板中洗滌3次,去掉浮游菌和松散的菌體細胞,加入100 μL甲醇固定15 min,吸去殘液,放置晾干,再加入100 μL 2%的結晶紫溶液,室溫放置5 min后,用移液槍吸去殘余染液,自來水洗滌至無色水滴,甩盡殘余水珠,放置于培養箱中37 ℃,30 min晾干后,加入100 μL 33%的冰乙酸溶解吸附的細胞和結晶紫,用酶標儀測定其吸光度(630 nm)值。

表1 金黃色葡萄球菌食品分離菌株生物被膜形成相關基因檢測結果Table 1 The detection results of biofilm formation related genes in S. aureus food isolates

1.2.6 統計分析 使用SPSS 18.0軟件進行統計分析,組內計量比較采用單因素方差分析(analysis of Variance,ANOVA),Duncan方法比較組內差異性,以p<0.05為差異具有統計意義。

2 結果與分析

2.1 16株金黃色葡萄球菌被膜形成相關基因檢測結果

16株金黃色葡萄球菌食品分離菌株中14種生物被膜形成相關基因檢測結果詳見表1。基因cna、ebpS、fib和icaAD檢出率為100%,sasC檢出率為87.5%,fnbA、sasG和clfB的檢出率均為68.75%,eno,icaBC檢出率分別為62.5%和56.25%,16株菌株均不攜帶bbp、bap、clfA和fnbB基因。菌株F7,F23,F40,F44,F46,F99,F106和F109各攜帶10個生物被膜形成相關基因,F19攜帶9個生物被膜形成相關基因,F86和F107各攜帶7個生物被膜形成相關基因,F60和F101各攜帶6個生物被膜形成相關基因,F58,F64,F71各攜帶5個生物被膜形成相關基因。

2.2 茶多酚和Nisin對金黃色葡萄球菌的MIC測定結果

茶多酚和Nisin對金黃色葡萄球菌的MIC測定結果詳見表2。茶多酚和Nisin對16株菌株的MIC范圍分別為0.1～0.2 g/L和0.125～1 g/L。茶多酚對F44、F58、F101菌株的MIC為0.2 g/L,對其余13株菌株MIC均為0.1 g/L;Nisin對F7、F23、F40、F60、F64、F86,F101、F106和F109的MIC為0.5 g/L,對F46和F19的MIC分別為0.25和0.125 g/L,Nisin對F44、F58、F71、F99和F107菌株的MIC值為1 g/L。

表2 茶多酚和Nisin對金黃色葡萄球菌的MIC測定結果Table 2 The minimum inhibitory concentration(MIC)value of tea polyphenols and Nisin to S. aureus food isolates

2.3 金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力測定

金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力測定結果詳見圖1。16株測試菌株中,F23、F44、F58、F64、F71、F86、F107和F109等8株菌株為被膜強形成菌株,F7、F19、F40、F46、F60、F99、F101、F106等8株菌株為被膜弱形成菌株。

圖1 金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力測定結果Fig.1 The biofilm formation ability of S. aureus food isolates

2.4 茶多酚和Nisin對金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力的影響

茶多酚和Nisin在不同亞抑菌濃度下對金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力的影響詳見圖2。茶多酚在1/2MIC、1/4MIC和1/8MIC濃度下對7株菌株的生物被膜形成抑制效果均顯著(p<0.05)。Nisin對金黃色葡萄球菌的生物被膜形成也有較好抑制作用(p<0.05),但Nisin在1/4MIC濃度下對F71菌株的生物被膜形成影響不明顯(p>0.05),在1/8MIC濃度下對F71和F109生物被膜形成有促進作用(p<0.05)。可見,不同亞抑菌濃度下,相比于Nisin,茶多酚對金黃色葡萄球菌被膜形成抑制效果更明顯。

圖2 茶多酚和Nisin在不同亞抑菌濃度下對金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力影響Fig.2 The effect of tea polyphenols and Nisin on S. aureus biofilm formation at different sub-inhibitory concentration注:A為茶多酚;B為Nisin。

3 結論與討論

本研究發現cna、ebpS、fib和icaAD基因在所有檢測菌株中都存在,檢測率為100%,其次是sasC(87.5%)、fnbA(68.75%)、sasG(68.75%)、clfB(68.75%)、eno(62.5%)和icaBC(56.25%),16株菌株均不攜帶bbp、bap、clfA和fnbB基因,這與Ghasemian[20]等對從醫院患者分離出的金黃色葡萄球菌生物被膜相關基因檢測結果不同,推測主要原因可能是菌株來源不同,其次是研究樣本數量的差異。現有的研究認為金黃色葡萄球菌分泌的β-1,6-聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)或黏附多糖(PIA)被認為是葡萄球菌生物被膜形成的關鍵因子,需要icaADBC基因編碼的產物才能夠合成,因此,icaADBC被認為是細胞間粘附的重要因子[5,21]。本研究中16株菌株icaAD基因檢出率為100%,icaBC基因檢出率為56.25%,與其他研究中icaAD基因高檢出率的結果相似[22-24],進一步證實icaAD基因高檢出率與生物被膜形成之間的關系。說明PIA/PNAG在金黃色葡萄球菌食品分離株被膜形成中起主要作用。另外,生物被膜形成還可通過粘附基質分子的共價結合而引起細胞相互聚集[9]。其中,彈性蛋白結合蛋白EbpS通過與宿主胞外基質粘附引起宿主感染,在金黃色葡萄球菌感染宿主的過程中起著至關重要的作用[25]。fib編碼的胞外纖維蛋白原結合蛋白Fib有助于金黃色葡萄球菌在血管和內皮細胞上定植[22]。16株菌株ebpS和fib基因檢出率均為100%。結合16株菌株生物被膜的形成情況,推測fib、icaAD和ebpS基因可能與實驗菌株形成被膜能力聯系密切。表面蛋白SasG在生物被膜累積階段形成,是典型的細胞壁結合蛋白[26-27],SasG促使細胞聚集,在金黃色葡萄球菌感染中促進細菌對宿主細胞粘附[28]。Schroeder等[29]表明SasC不僅可以促進細胞間聚集,而且可提高細胞對高分子材料的粘附力。16株菌株sasC和sasG攜帶率分別為87.5%和68.75%,說明sasC和sasG基因在金黃色葡萄球菌被膜形成中也起到了重要作用。FnbA和FnbB是金黃色葡萄球菌重要粘附蛋白,研究表明由fnb基因編碼的金黃色葡萄球菌更容易引發侵襲性疾病[30]。還有學者認為FnbA和FnbB蛋白分子可促使耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物被膜形成和聚集[31]。凝集因子ClfB是金黃色葡萄球菌在鼻腔中定植的重要因子[32]。本研究中fnbA檢出率為68.75%,clfB檢出率為68.75%,fnbB未檢出,推測fnbA和clfB與食品分離菌株生物被膜形成存在一定相關性。在16株金黃色葡萄球菌中,8株菌株為被膜強形成能力菌株,所檢出的被膜相關基因數量為5～10不等。其中,F58、F64和F71產被膜能力最強,但三株菌株均只檢出5個基因,并且三株菌均攜帶了cna、ebpS、fib和icaAD基因。推測在金黃色葡萄球菌食品分離菌株的被膜形成中,cna、ebpS、fib和icaAD可能起著主導作用。雖然F7、F40、F46、F99和F106均攜帶了10個基因,但這些菌株都是弱被膜形成菌株,可以看出,并不是攜帶被膜基因個數越多,被膜形成能力就越強。基因的表達還受環境條件等其他因素的影響[33]。

兒茶素作為茶多酚的有效成分,可以結合細菌的膜脂質雙分子層破壞細胞膜[34]。有學者發現兒茶素也可通過抑制特定還原酶抑制細菌脂質分子的形成[35]。另外,還發現兒茶素可以干擾DNA的復制能力,從而抑制DNA促旋酶的功能[36]。Reygaert等[38]的研究表明茶多酚可以抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌青霉素結合蛋白2a(PBP2a)的合成。本研究也證實茶多酚對金黃色葡萄球菌具有好的抑制效果。茶多酚在亞抑菌濃度下的抑菌效果強于Nisin。16株金黃色葡萄球菌中,茶多酚的MIC除了F44、F58和F101為0.2 g/L外,其余均為0.1 g/L,而Nisin的MIC范圍從1～0.125 g/L不等。茶多酚和Nisin在1/2MIC濃度下對各菌株被膜形成具有較好抑制作用,并有劑量依賴性。Okuda等[14]的研究中也有類似發現。但是Nisin在1/8MIC濃度時出現對F71和F109被膜形成的促進作用,具體原因還未知,在以后的研究中我們將進一步關注此現象。針對金黃色葡萄球菌被膜形成相關基因在被膜形成中的作用以及食品添加劑對被膜形成抑制機理還有待進一步深入研究。

綜上,通過本文研究發現,金黃色葡萄球菌食品分離菌株攜帶被膜基因數量多少與被膜形成能力強弱之間聯系不緊密,cna、ebpS、fib和icaAD基因可能起著主導作用。茶多酚和Nisin在亞抑菌濃度下對金黃色葡萄球菌的生長和被膜形成均具有抑制作用。本結果為食品中產被膜金黃色葡萄球菌的預防和控制提供參考。

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Analysis of biofilm formation related genes and its influence factors forStaphylococcusauresfood isolates

MA Yisalan,ZHANG Rong,WANG Hong-zhi,ZHAO Yan-ying,CHEN Juan,LIU Ji,TANG Jun-ni*

(College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

The present study investigated 14 biofilm formation related genes involved inStaphylococcusaureusfood isolates and further evaluated the effect of tea polyphenols and Nisin on the growth and biofilm formation of these strains. All the 16S.aureusstrains were collected from food source. 14 adhesin genes were detected by polymerase chain reaction(PCR)using specific primer. The antibacterial activity and minimal inhibitory concentration(MIC)of tea polyphenols and Nisin were tested using the microtiter-plate method. The effects of tea polyphenols and Nisin on the biofilm formation were also executed using microtiter-plate method. The results showed that 10/14 adhesin genes were detected. The detection rates ofcna,ebpS,fibandicaADgenes were 100%,followed bysasC(87.5%),fnbA(68.75%),sasG(68.75%),clfB(68.75%),eno(62.5%)andicaBC(56.25%),respectively. However,thebbp,bap,clfAandfnbBgenes were not present in any strains detected. All the tested strains were found to have the ability to form and accumulate biofilm. F23、F44、F58、F64、F71、F86、F107 and F109 were strong biofilm producers,and F7、F19、F40、F46、F60、F99、F101、F106 were weak biofilm producers. The MIC values of tea polyphenols and Nisin to 16 strains ranged from 0.1 to 0.2 g/L and 0.125 to 1 g/L,respectively. 1/2 MIC and 1/4MIC of tea polyphenols and Nisin had very significant inhibitory effect on the biofilm formation to the tested strains(p<0.05),and tea polyphenols had better antibacterial activity toS.aureusstrains than Nisin. The results of this study would play a valued role to theS.aureusfood isolates biofilm formation and control strategy.

Staphylococcusaureus;biofilm formation related genes;minimal inhibitory concentration;tea polyphenol;Nisin

2017-02-21

馬伊薩蘭(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：畜產品加工與安全，E-mail:403884179@qq.com。

*通訊作者:唐俊妮(1971-)，女，博士，教授，研究方向：食品安全與食品微生物,E-mail：junneytang@aliyun.com。

國家自然科學基金(31371781)；四川省應用基礎項目(2014JY0253)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)15-0129-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.025