葉黃素酯/α環糊精包合研究

蔡浩鋒,薛 可,卜慧敏,陳 洋,李文玎,任 勇

(南京師范大學生命科學學院,江蘇省醫藥超分子材料及應用重點實驗室,江蘇南京 210046)

蔡浩鋒,薛 可,卜慧敏,陳 洋,李文玎,任 勇*

(南京師范大學生命科學學院,江蘇省醫藥超分子材料及應用重點實驗室,江蘇南京 210046)

目的:研究葉黃素酯與α-環糊精的包合性能。方法:紫外法測定包合行為并計算表觀包合常數;研磨法制備包合物;溶解度為指標確定包合比;DTA、DR-FTIR、UV-vis DRS驗證包合物;與β-環糊精和混合環糊精的包合作用比較,測定其溶解度、穩定性。結果:葉黃素酯與α-環糊精表觀包合常數Ka為127 L/mol;包合比1∶5時溶解度最佳;α-環糊精使葉黃素酯穩定性增強,溶解度提高為葉黃素酯原料的6倍以上。結論:α-環糊精應用于葉黃素酯性能優于β-環糊精和混合環糊精。

葉黃素酯,環糊精,包合物,溶解度,穩定性

葉黃素酯(Lutein esters),來源于萬壽菊花,經過脫水粉碎、溶劑提取、低分子量醇純化和真空濃縮等步驟生產而成,為深紅棕色細小顆粒,是葉黃素與脂肪酸形成的酯類化合物,2008年被衛生部批準為新資源食品(衛生部公告2008年第12號),并標定主成分為葉黃素二棕櫚酸酯(>55%)(圖1),分子式C72H116O4,分子量1045.71 Da,主要用于食品行業及醫藥領域[1-2]。研究表明,葉黃素酯與葉黃素具有同樣的生理功能[3-6],其生物利用度高于葉黃素單體[7-8]。然而其多個雙鍵共軛形成C40的長鏈分子,對光、熱、空氣敏感,水溶性極差,生物利用度仍偏低[9]。

環糊精(Cyclodextrin,簡稱CD),外形似“錐筒”,“內疏水、外親水”的獨特結構特性對難溶性藥物有包合和增溶作用[10],可防止藥物揮發、升華、氧化和見光分解的作用,提高藥物的生物利用度[11]。本實驗室曾研究β-環糊精(β-CD)和羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)所形成的混合環糊精(CDs)對葉黃素酯的增溶作用,表明CDs使葉黃素酯溶解度提高到0.3961 μg/mL,且提高了對光、熱、空氣的穩定性。但是CDs用量過大(葉黃素酯與CDs質量比1∶10)、輔料成本高、增溶效果不顯著[12]。α-環糊精(α-CD)溶解性和安全性均優于β-CD[11],且價格低于HP-β-CD,為此本文進一步探討了α-CD對葉黃素酯包合作用,并與β-CD和CDs的包合效果進行對比,以期改進葉黃素酯產品應用的效果。

漫反射光譜技術是漫反射光進入樣品內部后,經過多次反射、折射、衍射、吸收后返回表面,是分析光與樣品內部分子發生了相互作用后的光譜,負載了樣品結構和組分信息,是一種快速、無損的分析技術[13]。適用于固體粉末樣品的直接測定以及材料的表面分析,試樣處理簡單,無需壓片,并且不改變樣品原有形態,更能夠直觀的反應物質的真實信息[14]。傳統的驗證包合物方法如X-射線衍射法、電鏡掃描、紅外光譜等[15]需要將樣品進行一些前處理,如壓片等,很有可能導致樣品原有形態結構發生改變,因此采用漫反射傅立葉變換紅外光譜[16](DR-FTIR)和紫外/可見漫反射光譜(UV-vis DRS)驗證包合物更能夠真實的反應物質的結合狀態。

圖1 葉黃素二棕櫚酸酯化學結構圖Fig.1 Chemical structure of lutein esters

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葉黃素酯(含量12%) 青島同鑫天然產物有限公司,食品級;葉黃素 天津市尖峰天然產物研究開發有限公司(JF-NATURAL),HPLC純度90%;α-環糊精(α-CD) 武漢遠成共創科技有限公司;β-環糊精(β-CD) 安徽山河藥用輔料股份有限公司;純凈水 南京上上貿易實業有限公司;其他所用試劑均為分析純。

Explorer電子分析天平 Ohaus Corporation,USA;UV-2450型紫外可見分光光度計 日本島津公司;GXZ型智能、PGX型多段光照培養箱 寧波東南儀器有限公司;KQ-250DB數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;QHZ-123B組合式全溫度振蕩培養箱 太倉市華美生化儀器廠;DZX-1(6050B)真空干燥箱 上海福瑪實驗設備有限公司;NEXUS670傅立葉變換紅外光譜儀 美國尼高力公司;Cary5000紫外/可見/近紅外分光光譜儀 美國 VARIAN(瓦里安)公司。

1.2 葉黃素標準曲線的繪制

1.2.1 測定波長的確定 精密稱定葉黃素對照品0.0500 g,無水乙醇溶解并定容至100 mL,作為儲備液。精密吸取1.00 mL儲備液,用無水乙醇稀釋成質量濃度為20.00 μg/mL的樣品溶液;另取約0.1000 g的葉黃素酯原料,無水乙醇溶解并稀釋;配制CD(α-CD、β-CD、HP-β-CD)水溶液。分別在350～500 nm波長掃描。

1.2.2 標準曲線的繪制 儲備液分別用無水乙醇稀釋成0.0200～0.8000 μg/mL系列質量濃度的溶液,紫外光譜掃描,在446 nm處測定吸光度值。以葉黃素質量濃度C(μg/mL)為橫坐標,吸光度值A為縱坐標,繪制標準曲線。

1.3 包合常數的測定(光度法)

pH6.86磷酸鹽緩沖液配制葉黃素酯稀溶液(A液),稱取0.1000 g的CD,用A液溶解并定容至10 mL,此為B液。移取2.50 mL A液,在350～500 nm內紫外掃描得紫外吸收值A0,依次向A液中加入定量的B液,渦旋振蕩1 min后紫外掃描,得不同CD摩爾濃度體系的紫外吸收值A1～An,根據文獻[17-18]關系式:

式中：ΔA是加入CD后葉黃素酯紫外吸收值的變化,[CD]0是環糊精的總濃度,[G]0葉黃素酯的總濃度,Δε為葉黃素酯與CD形成包合物前后摩爾吸收系數之差。以1/ΔA對1/[CD]0作圖,得到一條直線,由所得的截距/斜率即可求得包合常數Ka值。

1.4 包合物的制備

將葉黃素酯與α-CD按照質量比例為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶10、1∶15分別投料,加入適量水,室溫避光研磨1 h呈糊狀,20 ℃真空干燥24 h,過80目篩,得包合物備用。同法制得質量比例為1∶5的葉黃素酯/β-CD包合物,并參照文獻[12]同法制得CDs包合物。

1.5 包合比例及溶解度的測定

取適量的上述包合物和葉黃素酯于50 mL的具塞棕色三角瓶中,分別加入25 mL純凈水,(37±1) ℃,200 r/min,恒溫振蕩24 h,形成過飽和溶液,濾紙過濾,濾液稀釋一定倍數后,在446 nm處測定吸光值,代入“1.2.2”標線得包合物中葉黃素酯的溶解度,平行測定三次,取平均值,其溶解度最大者即為制備包合物的比例。

1.6 包合物的鑒定

1.6.1 差示熱分析(DTA) 分別取適量葉黃素酯原料、α-CD、葉黃素酯與α-CD為1∶5的物理混合物(稱取對應比例的兩者裝于小自封袋中充分混合均勻)及包合物,差示熱分析檢測[19]:參比:Al2O3;測定氛圍:N2;樣品量:4～5 mg;升溫速率:10 ℃/min;升溫范圍:30～450 ℃。

1.6.2 UV-vis DRS 分別取適量葉黃素酯與α-CD為1∶5的物理混合物(同上)及包合物,紫外/可見漫反射實驗檢測:參比:BaSO4;波長范圍:200～800 nm;狹縫:1nm。

1.6.3 DR-FTIR 分別取適量葉黃素酯與α-CD為1∶5的物理混合物(同上)及包合物,紅外漫反射實驗檢測:參比:KBr;波長范圍:400～4000 cm-1;分辨率4 cm-1;掃描次數32次。

1.7 穩定性實驗

根據《中國藥典》(2015版)Ⅱ部藥物穩定性實驗指導原則,以葉黃素酯原料為對照,將原料與包合物密封于無色透明的西林瓶中,分別在高溫60 ℃、(4500±500) lx光照度的條件下放置10 d,于0、5、10 d取樣觀察并進行含量測定(按“1.2.2”標線計算),重復測定三次,取其平均值,結果分別與0 d樣品和原料比較。

1.8 含量測定方法

葉黃素酯含量測定按下式計算:

式中:A-測試液的吸光值;b-葉黃素標曲的截距;V-樣品提取液的體積,mL;f-樣品稀釋倍數;SLOPE-葉黃素標曲斜率;m-取樣量,g。

表1 不同比例包合物葉黃素酯溶解度(n=3)Table 1 Solubility of different proportions of lutein esters inclusion complex(n=3)

2 結果與分析

2.1 測定波長的選擇

圖2為葉黃素對照品與CD水溶液紫外掃描圖,葉黃素分別在422、446、475 nm處有吸收峰,446 nm為最強吸收。圖3為葉黃素酯與CD水溶液紫外掃描圖,葉黃素酯吸收峰與葉黃素基本相一致,其最大吸收波長均藍移1 nm,這可能跟葉黃素酯兩側的脂肪鏈產生共軛效應和空間位阻相關。另外兩種圖譜均顯示CD在此范圍內無紫外吸收,因此選定最強吸收446 nm處為葉黃素酯測定波長。

圖2 葉黃素對照品與CD紫外掃描圖譜Fig.2 UV scanning spectrum of lutein standard and CD注:a.葉黃素;b.CD,圖3同。

圖3 葉黃素酯原料與CD紫外掃描圖譜Fig.3 UV scanning spectrum of lutein esters and CD

2.2 標準曲線的繪制

葉黃素對照品在0.0200～0.8000 μg/mL的濃度范圍內,吸光度(A)與相應的質量濃度(C)之間的線性回歸方程為A=0.3002C+0.0031(R2=0.9997),表明在此范圍內線性關系良好。

2.3 包合常數(Ka)的測定

紫外測定結果發現,隨著CD濃度的增加,葉黃素酯吸光值呈規律性的增加,顯示葉黃素酯與CD發生了相互作用,有形成包合物的可能。根據實驗數據計算葉黃素酯與α-CD、β-CD的Ka分別為127、219 L/mol,表明葉黃素酯能夠與兩種CD形成穩定的包合物,但α-CD的Ka小于β-CD,揭示β-CD更容易與葉黃素酯形成包合物,這是因為β-CD比α-CD具有更大的空腔尺寸,更易于葉黃素酯進入其空腔中。

2.4 包合比例及溶解度的測定

不同比例的包合物對葉黃素酯的增溶效果(表1)存在明顯的差異,葉黃素酯的溶解度先隨著α-CD質量的增加而增加,質量比1∶5時出現最大值,隨后繼續增加α-CD的量,增溶幅度明顯下降,表明CD對客體的包合存在一個合適的包合比,并非呈正相關。因此,本文選擇葉黃素酯與α-CD的質量比1∶5作為制備包合物的比例。

α-CD包合物使葉黃素酯的溶解度最高達0.9627 μg/mL,β-CD和CDs包合物溶解度分別為0.2149 μg/mL和0.4298 μg/mL。另根據前期工作[12]可知,CDs使葉黃素酯溶解度達0.3961 μg/mL,基本與實驗結果一致。由此可見,α-CD對葉黃素酯的增溶效果更為明顯,優于β-CD和CDs(90%β-CD),這可能與α-CD的空腔尺寸和溶解度有關,由于α-CD的空腔尺寸小于β-CD,與葉黃素酯進行包合時很可能包裹尺寸相對較小的疏水性基團,出現多分子α-CD包合一分子的葉黃素酯情況,而其溶解度又明顯優于β-CD,進而能夠明顯提高葉黃素酯的溶解度。

2.5 包合物的鑒定

2.5.1 差示熱分析(DTA) DTA圖4表明,原料在56.35 ℃顯吸熱脫水峰,隨后體系緩慢放熱,230.11、294.64、399.49 ℃分別有寬的吸熱峰,為原料的特征吸收峰,399.49 ℃后迅速放熱分解。α-CD在48.66 ℃和80.73 ℃有典型的脫水吸熱峰,分別脫去自由水和結合水,141.75 ℃為特征相變峰,317.24 ℃后快速放熱分解。物理混合物有α-CD的脫水峰、相變峰和原料230.11 ℃的特征峰,基本是兩種物質的簡單疊加。而包合物中上述特征峰均消失不見,熔融分解峰較物混后移到316.82 ℃,均不同于一般的物理混合物,表明已經形成了新的結構體系,包合物已經形成。

圖4 樣品差示熱分析(DTA)圖譜Fig. 4 Differential thermal analysis(DTA)diagram注:a.原料;b.α-CD;c.物理混合物;d.包合物。

表3 葉黃素酯原料與包合物的穩定性實驗(n=3)Table 3 Stability experiment of extract and inclusion compounds(n=3)

2.5.2 UV-vis DRS譜 樣品的UV-vis DRS圖譜(圖5)顯示,物理混合物出現了葉黃素酯的452 nm和483 nm特征吸收峰。包合物的譜圖顯示其吸光值明顯增強,且葉黃素酯特征吸收產生紅移,當葉黃素酯進入環糊精疏水性空腔時,α-CD富電子云的空腔增強了葉黃素酯的電子云密度,使電子從n-π*,π-π*的躍遷變得更加容易,由此躍遷所需的能量減小,幾率增大,表現為吸光值增強,最大吸收波長紅移[20],說明α-CD和葉黃素酯通過研磨形成了不同的物相(包合物)。

圖5 樣品UV-vis DRS圖譜Fig. 5 UV-vis diffuse reflection spectrum注:a.包合物;b.物理混合物。

圖6 樣品紅外漫反射(DR-FTIR)圖譜Fig.6 Infrared diffuse reflection spectrum注:a.包合物;b.物理混合物;c.α-CD。

2.6 穩定性實驗

樣品穩定性實驗結果見表3。數據表明三種包合物的穩定性均明顯優于原料,CD與葉黃素酯進行包合后,避免了其直接暴露于光、熱、空氣中,因而提高了穩定性;高溫實驗中α-CD包合物優于β-CD包合物,表明α-CD在改善葉黃素酯穩定性方面比β-CD具有優勢,這可能與兩種CD的包合方式不同有關,α-CD尺寸較小,更易于與尺寸相對較小的脂肪側鏈進行包合,存在多分子的α-CD包合葉黃素酯,β-CD尺寸相對較大,可能僅兩分子β-CD對葉黃素酯兩端的側鏈進行包裹;α-CD與CDs包合物在穩定性方面相差不大,這跟CDs中HP-β-CD的引入有關,打破了β-CD自身分子內氫鍵,增加了與葉黃素酯分子間的氫鍵效應,提高了穩定性。此外,光照、高溫10 d后,包合物中葉黃素酯含量下降比較明顯,表明在生產、運輸和保存過程中需避光以及避免高溫。

3 討論與結論

以葉黃素來標定葉黃素酯含量是現有文獻[23]常采用的方法,但缺乏實驗依據和說明,本文對比分析發現兩者有相似的紫外吸收光譜特性,最大吸收波長以及峰形相同,表明葉黃素的酯化作用并不影響光譜吸收特征,以葉黃素制作標曲并標定葉黃素酯具有可行性。

Ka值測定對了解包合物的性質及包合物制備有重要意義,Ka的大小反映了CD與客體形成包合物的難易程度[24]。葉黃素酯與α-CD的Ka為127 L/mol,表明葉黃素酯能夠與α-CD形成穩定的包合物。

葉黃素酯為天然混合物,無法準確測定摩爾數,因此難以采用等摩爾系列法[25-26]測定其包合摩爾比。本文采用包合質量比-溶解度實驗確定包合比,最終葉黃素酯與α-CD質量比1∶5時溶解度最大,并以該比例制備包合物,研磨法制備中除少量水外無任何有機溶劑、工藝簡單且安全無污染,產品無異味、性質佳、便于后期制劑,技術可行性強,適合大規模的工業生產。溶解度實驗中α-CD使葉黃素酯的溶解度最高達0.9627 μg/mL,明顯優于β-CD和CDs,可能與α-CD和葉黃素酯發生了其他形式的相互作用有關,如表面活性劑樣膠束作用、α-CD分子之間或者包合物之間的自聚合作用等[17]共同促進了溶解度的提高,這對提高葉黃素酯的生物利用度具有重要意義。

DR-FTIR和UV-vis DRS驗證包合物,能直觀反映被測物質的真實信息,此法驗證薏苡仁油包合物可獲得滿意的結果[27]。漫反射光譜試樣處理簡單、無需壓片、不破壞樣品結構,因此能夠更好的驗證包合物的形成。本文通過此法驗證葉黃素酯包合物得到較全面的表征信息,為進一步的分析提供了技術支持。

本文在前期工作基礎上,制得CD用量更少(本文為1∶5,文獻[12]為1∶10),葉黃素酯增溶效果更好的包合物,這對增加安全性以及提高生物利用度具重要意義。另根據市場價格(HP-β-CD>α-CD>β-CD,相差數倍甚至十數倍)計算得α-CD包合物輔料成本低于CDs,且制備體系更加簡化,實用性更強,取得了比前期更好的效果。因此本文的研究結果,為葉黃素酯的開發利用拓寬了渠道,在工業生產中有重要的實用價值和良好的應用前景。

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Evaluation ofα-cyclodextrin inclusion compound of lutein esters

CAI Hao-feng,XUE Ke,BU Hui-min,CHEN Yang,LI Wen-ding,REN Yong*

(College of Life Sciences,Nanjing Normal University,Jiangsu Key Laboratory For Supramolecular Medicinal Materials & Applications,Nanjing 210046,China)

Object:To study properties ofα-cyclodextrin inclusion compound of lutein esters. Methods:Inclusion process was evaluated by UV spectroscopy and then binding constants was calculated,inclusion compound was prepared by trituration method,lutein solubility was used as the index to determine the appropriate inclusion ratio,inclusion compound was confirmed by differential thermal analysis,infrared diffuse reflection spectrum and UV-vis diffuse reflection spectrum,the solubility and the stability ofα-cyclodextrin,β-cyclodextrin and mixed cyclodextrins inclusion compounds of lutein esters were compared. Results:inclusion constants of lutein esters/α-cyclodextrin was 127 L/mol,optimum inclusion mass ratio of lutein esters andα-cyclodextrin was 1∶5,the solubility ofα-cyclodextrin inclusion compound was improved by more 6 times that of lutein esters,the stability of inclusion compound was enhanced. Conclusions:α-cyclodextrin is superior toβ-cyclodextrin and mixed cyclodextrins in preparation of lutein esters inclusion complex.

lutein esters;cyclodextrins;inclusion compound;solubility;stability

2016-12-29

蔡浩鋒(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：藥物超分子技術，E-mail：f949711833@163.com。

*通訊作者:任勇(1959-)，男，博士，副教授，研究方向：藥物化學與超分子藥學研究，E-mail：renyongphd@126.com。

TS201.2

A

1002-0306(2017)15-0102-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.020