響應面法優化乳酸菌發酵胡蘿卜原漿工藝及香氣成分變化分析

劉 瑩,焦夢悅,王麗霞,高 涵,田益玲

(河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000)

響應面法優化乳酸菌發酵胡蘿卜原漿工藝及香氣成分變化分析

劉 瑩,焦夢悅,王麗霞,高 涵,田益玲*

(河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000)

以胡蘿卜為原材料,以富含乳酸菌的發酵劑為菌種,利用響應面法對胡蘿卜原漿的發酵工藝條件(發酵時間、發酵劑加量、發酵溫度)進行優化。結果表明:經優化后,胡蘿卜原漿最佳發酵工藝條件為發酵27 h、發酵劑加量0.16 g、發酵溫度40 ℃,在該條件下測得胡蘿卜發酵漿的總酸為5.5335 g/L、pH為3.99、總糖為0.1287 g/L、還原糖為0.1198 g/L、乳酸菌菌落總數為8.72 lg(cfu/mL),與預測值相接近。胡蘿卜原液與發酵液分別檢測出34、33種香氣成分,其在發酵過程中變化明顯,發酵液掩蓋了胡蘿卜原有的藥腥味,因此可以作為一種新型健康的益生菌制品得到推廣。

胡蘿卜,發酵,優化,揮發性成分,變化

胡蘿卜,屬傘形科植物,于元朝引入中國,如今是一種家居廚房中的常見蔬菜,因其鮮艷的顏色,甘甜鮮脆的口感以及豐富的營養而深受人們喜愛。被譽為“小人參”的胡蘿卜富含諸多容易被人體消化吸收的維生素、礦物質等[1]。在過去我國對胡蘿卜的加工僅限于家庭餐桌上和動物的飼料中,但目前,對胡蘿卜的應用已逐步趨于廣泛化,如以罐頭為主的罐藏類食品、干制品、果脯、復合蔬菜汁、胡蘿卜復合奶粉以及酸奶[2]等。

胡蘿卜的營養價值雖然較高,但由于其含有較多的烯萜類物質而產生令人不愉快的藥腥味[3],故仍得不到部分群體的青睞。對胡蘿卜進行簡單地初步加工只會削弱藥腥味,而不會從源頭消除藥腥味[4]。然而胡蘿卜在經過發酵之后,在去除不愉快氣味的同時會產生許多芳香物質和營養物質[5-6],從而改善胡蘿卜本身的氣味。近些年來,雖然氣味分析技術得到了快速的發展、應用以及推廣,但是對發酵產物的氣味應用技術方面的報道少之又少。本實驗以市場上新鮮的胡蘿卜為實驗原料,利用直投式復合發酵劑制備乳酸菌發酵胡蘿卜原漿,采用單因素實驗,通過響應面優化得到最佳發酵工藝。采用頂空固相微萃取結合氣相質譜對胡蘿卜原漿以及發酵漿進行了定性分析確定化合物并得出結論。

表1 單因素實驗設計表Table 1 Single factor experiment design table

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胡蘿卜 當地蔬菜市場;發酵劑 均帶有植物乳桿菌的復合式發酵劑(復合式發酵劑:植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌) 廣東順德尚川生物科技有限公司;酚酞試劑、氫氧化鈉、葡萄糖(分析純)、氯化鈉 天津市天力化學試劑有限公司；MRS瓊脂培養基、MRS肉湯 北京奧博星生物科技有限責任公司；3,5-二硝基水楊酸 天津市風船化學試劑科技有限公司；丙三醇 天津市光大化學試劑有限公司。

榨汁機 美的集團;pHS--3C pH計 上海盛磁儀器有限公司;蒸汽滅菌鍋、SPX-150B-Z生化培養箱 上海博迅實業有限公司;SW-CJ-2D無菌操作臺 蘇州凈化設備有限公司;TU-1810DS紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;電子恒溫水浴鍋 富華儀器有限公司;Agilent 7890A-5975C GC/MS 氣相色譜質譜聯用儀、HP-INNOWax(60 m×250 μm×0.25 μm)色譜柱 安捷倫科技有限公司;50/30 μm(DVB/CAR/PDMS)、SPME 手動進樣手柄及萃取頭、15 mL頂空瓶 上海安普實驗科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 胡蘿卜汁的制備 將新鮮洗凈的胡蘿卜切成2～3 cm的薄片,與水1∶1等比例混合放入到榨汁機內打碎,巴氏殺菌后冷卻,灌裝入無菌的收集瓶中,備用。

1.2.2 胡蘿卜汁的發酵培養 處理好的胡蘿卜汁,置于無菌操作臺上,分別在已滅菌的500 mL三角瓶中加入300 mL的胡蘿卜汁,向每瓶中分別加入0.3 g的復合式發酵劑,置于37 ℃恒溫培養箱中,每隔12 h在無菌環境下取樣一次,分別檢驗其微生物指標和理化指標。每一瓶為1個實驗組,每組重復3次。

1.2.3 胡蘿卜發酵過程中各項指標的變化規律以及最終成分的檢測

1.2.3.1 總糖以及還原糖的測定 均采用DNS顯色法[7]。DNS溶液的配制:稱取6.3 g 3,5-二硝基水楊酸與262 mL的2 mol/L氫氧化鈉溶液,加入到含有182 g酒石酸鉀鈉的500 mL熱水中,再加入5 g苯酚,5 g亞硫酸鈉,攪拌至溶解,再用蒸餾水定容至1000 mL,棕瓶避光保存,一周后使用。

葡萄糖標準曲線的繪制:0.2 g葡萄糖標準品,用蒸餾水定容到100 mL,配制成濃度為2 g/L的葡萄糖標準溶液。分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的葡萄糖標準溶液于10 mL定容瓶內,定容。配制成濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的葡萄糖標準溶液,分別取1 mL的葡萄糖標準溶液與2 mL的DNS溶液,搖勻,于沸水浴中加熱顯色反應3 min后,測定其在540 nm波長下的吸光度。

以葡萄糖的質量濃度(g/L)為X軸,在540 nm波長下的吸光度為Y軸,繪制標準曲線并得出相應的回歸方程和系數。回歸方程以及系數為Y=1.915x-0.1073,R2=0.99933,線性范圍為0.1～0.5 g/L。

1.2.3.2 pH的測定 用pH計直接測量。

1.2.3.3 總滴定酸的測定 按照GB/T12293-90采用滴定法[8],總酸度以乳酸計。

1.2.3.4 乳酸菌菌落總數的測定 樣品經過梯度稀釋后采用MRS培養基培養并根據平板計數法計數[9]。

1.2.4 胡蘿卜汁發酵單因素實驗 以總糖、還原糖、總酸、pH、乳酸菌菌落總數為指標,以發酵時間、發酵劑加量、發酵溫度中某一個為單因素變量,另兩個為固定因素進行實驗,具體因素以及水平見表1。

1.2.5 發酵胡蘿卜汁發酵工藝的優化 在單因素實驗的基礎上,根據Box-Behnken的中心組合實驗原理,選擇發酵時間、發酵劑加量以及發酵溫度為自變量,以產品的總糖、還原糖、總酸、pH、菌落總數為響應值,采用響應面分析法,對發酵工藝進行分析,見表2。

表2 響應面實驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 發酵胡蘿卜香氣成分分析 分別取7.5 g的胡蘿卜原漿液以及發酵漿液于15 mL的頂空瓶內并加入0.4 g氯化鈉,旋緊瓶蓋后放置于加熱至40 ℃的電子恒溫水浴鍋中,后將活化(250 ℃,1 h)好的萃取頭插入頂空瓶,萃取頭距離樣品1～2 cm。平衡10 min后開始計時,在40 ℃下頂空吸附40 min,將萃取好的萃取頭手動進樣于GC-MS,進行香氣成分的分離鑒定[10-11]。

圖1 發酵時間對胡蘿卜汁發酵的影響Fig.1 Effect of time on fermented juice

氣相色譜升溫程序:40 ℃保持2 min,后以1 ℃/min升至100 ℃,再以4.5 ℃/min升溫至240 ℃,保持4 min。進樣口溫度240 ℃,檢測器溫度250 ℃;載氣為氦氣,流速1 mL/min,進樣量1 mL,不分流進樣。質譜條件:電子電離(electron ionization,EI)源,電子能量為70 eV,離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃。溶劑延遲1 min,質譜質量掃描范圍45～650 m/z[12-13]。

1.2.7 數據處理分析 利用統計分析軟件Design-Expert 8.0.6以及Origin8.6進行實驗設計和數據分析。

2 結果與分析

2.1 胡蘿卜汁發酵單因素實驗

2.1.1 發酵時間對胡蘿卜汁發酵效果的影響 結果如圖1所示,隨發酵時間的不斷延長,發酵液總糖以及還原糖的含量逐漸降低,當發酵時間達到24 h時,總糖和還原糖的含量達到拐點值,說明在0～24 h之間微生物最大程度的利用糖來促進其生長,在此之后,由于糖含量的減少,乳酸菌利用糖發酵的能力受到抑制,總糖以及還原糖的含量雖然亦在不斷降低但也趨于平穩狀態。而由于微生物利用糖來發酵產酸,故發酵液中的酸含量在不斷增加,在發酵前24 h的產酸量較大,24 h時為拐點,之后酸量雖然在不斷增加但是增加的幅度不如前24 h明顯。與酸相對應的發酵液pH一直在減小,在發酵前24 h,隨著發酵時間的延長,下降的幅度也較大,但在72 h后pH基本保持不變。在各種發酵需要的營養物質都相對于充足的前24 h,菌量的生長速率最快,在24 h達到最大值,由此表明此時間非常適合乳酸菌的生長。考慮實驗耗材以及操作簡便等各種因素,最終選取的發酵時間為24 h。

2.1.2 發酵劑加量對胡蘿卜汁發酵效果的影響 由圖2可以看出,當發酵劑的添加量為0.15 g時,乳酸菌菌落總數達到最大,并且在產酸的同時降糖。當發酵劑加量少時,由于菌體細胞少,故不能完全的利用營養物質和糖分進行發酵,當菌體細胞過量時,在具體的生長初期就已經把營養物質消耗殆盡,因而菌體得不到良好的生長,就可能提前進入生長末期。由此,確定最佳發酵劑加量為0.15 g。

圖2 發酵劑加量對胡蘿卜汁發酵的影響Fig.2 Effect of the adding quantity of starter on fermented juice

2.1.3 發酵溫度對胡蘿卜汁發酵效果的影響 發酵溫度的不同直接影響微生物的生長和代謝產物的生成,因此發酵溫度對各項指標都有不同程度的影響。由圖3可知,當發酵溫度過低時,微生物的代謝活動較弱,并且不能大量的生長繁殖,由此不能很好地利用營養成分進行發酵。在溫度達到恒溫42 ℃時,發酵胡蘿卜汁菌量達到最大值。在產酸方面,在42 ℃時,總酸的量達到最大,相應的pH降到最低。在產酸的同時降糖,由此總糖和還原糖的含量最低,說明微生物在最大程度上充分利用糖進行發酵。因此,確定最佳發酵溫度為42 ℃。

2.2 Box-Behnken中心組合設計實驗以及實驗參數優化

表3 響應面實驗設計與結果Table 3 Design and results of response surface analysis

2.2.1 Box-Behnken實驗設計方案以及實驗結果 在上述三個單因素的基礎上運用 Box-Behnken中心組合設計實驗原理,選擇發酵時間、發酵劑加量以及發酵溫度為自變量,以產品的總糖、還原糖、總酸、pH、菌落總數為響應值,設計三因素三水平實驗,實驗結果見表3。

圖3 發酵溫度對胡蘿卜汁發酵的的影響Fig.3 Effect of temperature on fermented juice

表4 回歸方程Table 4 Regression equation

2.2.2 模型的建立以及顯著性檢驗 分別對表3中的數據進行二次線性回歸擬合,得到的數學模型見表4。

上述所有方程是發酵后各項指標與發酵工藝各參數之間較為合適的數學模型,故可以分別利用回歸方程來確定最佳的發酵工藝參數。另分別對模型進行回歸分析。得到回歸統計分析表,見表5。

由表5可知,R1總酸、R2pH、R3總糖、R4還原糖、R5菌落總數的模型均顯著,由表6各因素對發酵工藝的影響顯著性排序為:pH>總酸>還原糖>總糖>菌落總數。結果顯示其中R1總酸、R2pH的模型達到極顯著水平,所有模型的失擬項均不顯著,說明方程的擬合程度較好。其中R1的A、C、A2,R2的A、A2,R3的C、A2等,均達到了極顯著水平[14-15]。

2.2.3 響應面分析以及優化 從響應面分析圖上可以很形象地看出最佳參數以及各參數之間的相互作用[16-17]。根據各自的回歸方程得出不同因子的響應面分析圖以及相應的等高線圖見圖4～圖8。由上述圖可以較為直觀地看出各因素交互作用對胡蘿卜發酵各參數的影響,其曲線走勢的坡度越陡,則說明該因素對各因素的影響越顯著;坡度較平滑,影響越小[18-19]。圖4、圖5以及圖8中的三組曲面圖皆為開口向下的凸形曲面,由此說明響應值在實驗因素變化范圍內存在著極高值。各自比較得出圖4中發酵時間的坡度較陡,圖5中,發酵溫度相對于發酵劑加量和發酵時間的曲線較為陡峭;圖9中,發酵劑加量的曲線走勢較陡,故其對各自的響應值的影響較為顯著。再比較圖中的等高線圖;在圖4和圖8中,發酵時間和發酵溫度對發酵中總酸的交互影響較為顯著;圖5中,發酵時間和發酵劑加量對發酵pH的交互影響最為顯著,表現皆為等高線最為密集。圖6、圖7是兩組開口向上的凹形曲面圖,由此說明響應值在實驗因素變化范圍內存在著最小值。圖6和圖7中,發酵溫度的曲線走勢坡度較陡,說明此因素對于響應值的影響較大,發酵時間和發酵溫度交互作用對于總糖的影響較為顯著,而發酵劑加量以及發酵溫度對于還原糖來說影響更為顯著,等高線最為密集,這與方差分析結果一致。

表5 回歸模型方差分析表Table 5 Variance analysis of regression equation

續表

表6 各因素影響的主效應分析Table 6 The main analysis of various factors

圖4 各因素對總酸含量影響的3D響應面圖Fig.4 3D response surface diagram of the influence of various factors on the total acid content

圖5 各因素對pH影響的3D響應面圖Fig.5 3D response surface diagram of the influence of various factors on pH

圖6 各因素對總糖含量影響的3D響應面圖Fig.6 3D response surface diagram of the influence of various factors on the total sugar content

圖7 各因素對還原糖含量影響的3D響應面圖Fig.7 3D response surface diagram of the influence of various factors on the reducing sugar content

圖8 各因素對菌落總數影響的3D響應面圖Fig.8 3D response surface diagram of the influence of various factors on the total number of colonies

2.2.4 驗證實驗 為了確定最佳點的值,對實驗模型進行分析,以得到最佳發酵工藝條件,經分析得出最佳工藝條件為:發酵時間26.95 h、發酵劑加量0.16 g、發酵溫度39.55 ℃,在模型預測的最佳工藝條件下:總酸為5.5850 g/L、pH為4.01、總糖為0.1273 g/L、還原糖為0.1189 g/L、乳酸菌菌落總數為8.63 lg(cfu/mL)。為檢驗實驗的可靠性,采用上述最優工藝條件進行實驗,同時考慮到實際操作的便利,最佳條件修正為發酵時間27 h、發酵劑加量0.16 g、發酵溫度40 ℃,實際測得胡蘿卜發酵漿的總酸為5.5335 g/L、pH為3.99、總糖為0.1287 g/L、還原糖為0.1198 g/L、乳酸菌菌落總數為8.72 lg(cfu/mL),與預測值比較可知,驗證實驗與預測值相接近,說明在本實驗范圍內建立的二次線性回歸模型準確有效,對實驗擬合程度較好,具有一定的實用價值。

2.3 胡蘿卜香氣成分分析

發酵原液以及發酵液檢出各類成分變化見圖9,結果顯示發酵原漿以及發酵液分別檢測出香氣成分34種和33種。其中在發酵原漿中檢測出主要呈香的萜烯類物質23種,占總物質的68%,酮類、醇類各3種,均占總物質的9%;在發酵液中檢測出萜烯類物質16 種,占48%,除此之外,與發酵原液相比,發酵液中還檢測出了酯類物質、酸類物質、呋喃類、吲哚類等物質。綜上胡蘿卜原漿在發酵前后的風味物質有很明顯的變化,在發酵前,風味物質以萜烯類物質居多,除此之外還含有少量的醇類物質;經過微生物發酵作用,部分物質消失,尤其是萜烯類物質,并產生新的物質[20-21]。

圖9 胡蘿卜汁發酵過程中主要揮發性香氣成分變化Fig.9 Changes of main volatile aroma components in carrot fermentation process

3 結論

香花等研究了牛蒡乳酸菌飲料發酵工藝,并進行了參數優化[22];王春輝報道了直投式乳酸菌發酵復合果蔬汁飲料的工藝研究[23];李俊芳對桑葚發酵飲料的發酵工藝進行優化[24];丁宏武等以紅蘿卜為原材料進行發酵研究,但是以胡蘿卜為原材料進行發酵研究的報道甚少[25]。由此可得,目前報道的果蔬乳酸菌發酵的研究主要集中于果蔬汁上,而對于乳酸菌發酵果蔬原漿的報道較少。

發酵原漿以及發酵液分別檢測出香氣成分34、33種,主要以烯萜類物質為主,經過不間斷的發酵微生物大量生長代謝并產生大量的乳酸,同時伴隨著不同程度的氧化聚合反應,酯化反應以及醇化反應等一系列的反應,產生了新的物質如酯類、酸類、呋喃以及吲哚等。由于多種香氣物之間的協同作用而致使胡蘿卜原有的藥腥味、土腥味減弱,經過發酵產生了可被大眾接受的獨特發酵風味。

熊濤以及馬曉娟等人通過植物乳桿菌NCU166對胡蘿卜進行發酵,對得到的發酵胡蘿卜漿以及未發酵的原漿進行揮發性風味物質比對分析,發現發酵后胡蘿卜漿的風味物質中,烯萜類物質明顯減少,醇酯類物質明顯增加,此結果與本文的結果一致[26]。李瑜經過實驗證實經過加工后的胡蘿卜混汁與新鮮胡蘿卜汁在風味上存在著顯著差異。新鮮胡蘿卜汁中萜烯類化合物的含量很高,而經過加工的混汁芳香族、羰基和萜烯類化合物含量較高,加工有效改善了令人不愉快的胡蘿卜的藥腥味[27]。除了加工方式,不同的滅菌方式對風味也存在著不同程度的影響。

發酵胡蘿卜的香氣物質來源于物質與物質之間的相互作用而非某一種或一類化合物單獨形成的,這些獨有的風味物質是胡蘿卜在發酵過程中,經過一系列的生化反應以及微生物的發酵作用而形成的。在整個發酵過程中主要以乳酸發酵為主,同時伴隨著不同程度的氧化還原反應、降解反應、焦糖化反應、美拉德反應、醇化反應以及酯化反應等,正是由于發酵過程中的各種反應以及微生物的代謝而使胡蘿卜中的部分物質消失,產生新的物質,組成新的香氣成分,這些風味物質的協同作用使胡蘿卜本身的藥腥味減弱并散發出果蔬發酵漿獨有的風味。

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Optimization of lactic acid bacteria fermentation carrot protoplasmic technology using the response surface method and the analysis of main volatile components

LIU Ying,JIAO Meng-yue,WANG Li-xia,GAO Han,TIAN Yi-ling*

(College of Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China)

The carrot was used as raw material fermented by starter cultures rich in lactic acid bacteria. The fermentation conditions(fermentation time,fermentation agent dosage and temperature)of carrot puree were optimized by response surface method. The results showed that the optimal fermentation conditions of carrot puree were as follows,fermentation for 27 h with fermentation agent dosage of 0.16 g at 40 ℃. Under this condition,the total acid,pH,total sugar,reducing sugar and total number of colonies of the fermentation carrot pulp were 5.5335,3.99,0.1287,0.1198 g/L and 8.72lg cfu/mL,respectively,which was close to the predictive value. 34 and 33 volatile components were detected in carrot solution and fermentation broth,where obvious changes of volatile components were shown in the fermentation process. Fermentation broth of the carrots covered up for the original unpleasant carrot smell,which is a kind of new probiotic products that benefit health,so it should be promoted and extended.

carrot;fermentation;optimization;volatile components;changes

2016-12-27

劉瑩(1993-),女,在讀研究生,研究方向:食品加工與食品安全,E-mail:liuying19930116@sina.cn。

*通訊作者:田益玲(1974-),女,碩士,副教授,研究方向:糧食、油脂及蛋白質工程,E-mail:ty-69@163.com。

河北省科技計劃項目(16227109D);河北省食品科學與工程學科“雙一流”建設投資金項目(2016SPGCA18)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)15-0085-09

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.017