酪蛋白酸鈉和阿拉伯膠相互作用的研究及納米粒的制備

劉春花,周愛梅,*,楊 苒,彭丹盈,劉 欣,曹 庸

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642; 2.廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 510642)

酪蛋白酸鈉和阿拉伯膠相互作用的研究及納米粒的制備

劉春花1,2,周愛梅1,2,*,楊 苒1,彭丹盈1,劉 欣1,2,曹 庸1,2

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642; 2.廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 510642)

酪蛋白酸鈉,阿拉伯膠,相互作用,納米粒,穩(wěn)定性,機(jī)制

功能性食品中具有生理功效的活性物質(zhì),如維生素、益生菌、活性多肽等,在進(jìn)入人體后能夠促進(jìn)健康,但其在體內(nèi)的生物利用度低[1]。納米技術(shù)(nanotechnology)的出現(xiàn)成為解決生物活性物低口服生物利用度問題的一種有效途徑[2]。納米粒制備是納米技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)的重要途徑之一。納米粒(nanoparticles)是直徑為10～1000 nm的一類聚合物膠體系統(tǒng),由于其微小體積和特殊結(jié)構(gòu),在胃腸道能成批地被轉(zhuǎn)運(yùn),因此除具備傳統(tǒng)活性物輸送體系所具有的諸如提高活性物的溶解度、增加活性物的穩(wěn)定性以及緩釋等優(yōu)點(diǎn)外,還可以大幅度地改變活性成分的組織分布和代謝,提高功能效果并降低毒副作用[3]。

構(gòu)建納米粒的載體材料要求具有良好的生物相容性和生物可降解性,并且是一般認(rèn)為安全(Generally recognized as safe,GRAS)級(jí)別。以往報(bào)道的一些納米粒的構(gòu)建涉及使用具有潛在毒性的溶劑或不可降解的材料,增加了口服利用的難度[4],因此需要一些更為安全的食品級(jí)大分子來應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)和多糖是食品體系中的兩類重要的大分子,它們通過相互作用形成的納米粒除能滿足上述要求外,還對(duì)包埋的活性物具有更為突出的承載效果和靶向傳遞效果,最終實(shí)現(xiàn)活性物的緩釋和控釋[5]。因此利用蛋白質(zhì)與多糖之間的相互作用構(gòu)建納米粒并作為活性物質(zhì)的輸送載體是近年來納米領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[6]。

酪蛋白酸鈉(SC)具有良好的表面活性、穩(wěn)定性、成膠性、親水性和自組裝特性[7],是良好的制備納米載體的材料[8]。同時(shí),阿拉伯膠(GA)具有良好的水溶性和穩(wěn)定性且無毒、生物相容性好、可生物降解,也是理想的載體材料[9]。但目前關(guān)于SC和GA相互作用及利用兩者相互作用制備納米粒的研究很少,且現(xiàn)有研究不深入、不系統(tǒng),仍有很多關(guān)鍵技術(shù)和科學(xué)問題需要解決[10-11]。因此本文以SC與GA復(fù)合體系作為研究對(duì)象,通過調(diào)控體系 pH、SC/GA濃度比、SC與GA總濃度和NaCl濃度,研究不同因素對(duì)SC和GA相互作用及納米粒形成的影響,探討SC和GA相互作用形成納米粒的機(jī)制,為利用SC與GA復(fù)合物制備納米遞送載體提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白酸鈉(純度98%)和阿拉伯膠(純度97%) 均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,其他試劑均為分析純 來自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

AL104萬分之一電子天平、FE20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司;JK-MSH-Pro-6B多頭獨(dú)立控溫磁力加熱攪拌器 上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司;PC950連續(xù)濁度比色計(jì) 美國(guó)安東帕(STH)公司;90 plus納米粒度及Zeta電位儀 美國(guó)布魯克海文儀器有限公司;JEM-2100F場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社;VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)BRUKER公司;RF-5301PC熒光分光光度計(jì) 島津制作所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SC和GA貯藏液的制備 將一定質(zhì)量的SC和GA溶于去離子水中,配制成濃度分別為10 mg/mL和10、100 mg/mL的SC和GA溶液,于600 r/min、室溫下攪拌3 h,然后置于4 ℃靜置過夜,得到SC和GA貯藏液。制備SC-GA復(fù)合物時(shí)將貯藏液按照對(duì)應(yīng)的配比加入到相應(yīng)濃度的NaCl體系中。實(shí)驗(yàn)中用到的所有試劑、溶液均用0.45μm濾膜過濾后使用。

1.2.2 不同因素對(duì)SC與GA相互作用及納米粒形成的影響 參照Ye等[10]的方法并稍作改進(jìn):在轉(zhuǎn)速為400 r/min、25 ℃下攪拌條件下,加入一定濃度的NaCl(0、5、10、20、30、40、50、60、80、100 mmol/L,固定SC/GA濃度比為1∶2,SC與GA總濃度為3 mg/mL),調(diào)節(jié)pH至6.5附近,按照一定SC/GA濃度比(9∶1、5∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶5、1∶9,固定SC與GA總濃度為3 mg/mL,NaCl濃度為10 mmol/L)加入SC貯藏液,將GA貯藏液按照對(duì)應(yīng)的比例逐滴加至攪拌的SC溶液中,控制體系中SC和GA的總濃度(4、3、2、1.5、1.2、0.9、0.6、0.3 mg/mL,固定SC/GA濃度比為1∶2,NaCl濃度為10 mmol/L)為一定值,將體系pH從6.5調(diào)節(jié)到2.0左右,在調(diào)節(jié)到一定pH時(shí)取樣,靜置24 h,測(cè)定復(fù)合物的濁度,以pH為橫坐標(biāo)、濁度為縱坐標(biāo)繪制相變圖,同時(shí)表征復(fù)合物的粒徑和Zeta電位,以研究pH、SC/GA濃度比、SC與GA總濃度和NaCl濃度等因素對(duì)SC與GA相互作用及納米粒形成的影響。

1.2.3 濁度的測(cè)定 按上述方法制備SC-GA復(fù)合物,在25 ℃下用PC 950連續(xù)濁度比色計(jì)在420 nm波長(zhǎng)下對(duì)樣品的透光率進(jìn)行測(cè)定,再根據(jù)下式計(jì)算濁度(Turbidity,T)。每次測(cè)量前均用去離子水將透光率校準(zhǔn)到100%。

Turbidity(%)=100%-透光率

1.2.4 動(dòng)態(tài)光散射粒徑分析 取上述方法制備的SC-GA復(fù)合物溶液適量于樣品池中通過動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)測(cè)定納米粒復(fù)合物在水中的流體力學(xué)直徑Dh(Particle size)和多分散指數(shù)(Polydispersity index,PDI)。

1.2.5 Zeta電位分析 利用Zeta電位儀通過耙電極測(cè)定樣品通電后的電泳遷移率,計(jì)算納米粒復(fù)合物的Zeta電位。

1.2.6 微觀形貌分析 采用透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察SC-GA納米粒的表面形態(tài)及大小。將待測(cè)樣品滴在干凈的銅網(wǎng)表面,保持2 min,用濾紙擦凈多余的樣品溶液,然后用2%(w/v)的磷鎢酸溶液染色3 min,吸去多余的染液,在空氣中經(jīng)數(shù)分鐘風(fēng)干后進(jìn)行電鏡觀察,測(cè)試加速電壓為80 kV。

1.2.7 納米粒貯藏穩(wěn)定性研究 在SC/GA濃度比為1∶1,pH4.2,SC與GA總濃度3 mg/mL,10 mmol/L NaCl條件下制備納米粒,于4 ℃下分別貯藏7、15、30 d后進(jìn)行粒徑和Zeta電位的表征。

1.2.8 傅里葉紅外光譜(FTIR)分析 取少許SC、GA、兩者的混合物(按照質(zhì)量比1∶1研磨,混合均勻)和凍干的SC-GA納米粒樣品,分別按1∶100的比例與溴化鉀混合研磨,經(jīng)壓片機(jī)壓成透明的薄片,在4000～400 cm-1的范圍以4 cm-1的分辨率掃描32次,采集樣品圖譜,環(huán)境溫度為25 ℃。在與測(cè)試樣品相同的條件下采集背景。

1.2.9 熒光光譜分析 固定SC濃度為0.5 mg/mL,按照SC/GA(濃度比)為0∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶16、1∶20的比例制備SC-GA納米粒復(fù)合物,分別在25、35 ℃水浴中保溫3 h后進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定過程中固定激發(fā)波長(zhǎng)λex=280 nm,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別為5、3 nm。熒光掃描速度為1200 nm/min,掃描范圍分別為300～500 nm。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 9.0軟件作圖,SPSS Statistics 17.0.1 軟件進(jìn)行方差分析,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 SC與GA溶液的濁度、Zeta電位隨pH的變化

濁度可以有效的表征兩種物質(zhì)復(fù)合凝聚的過程,它在一定程度上可以反映分散質(zhì)的大小,濁度越大,說明體系中大分子顆粒物的數(shù)量越多[12]。SC與GA溶液濁度隨pH變化的結(jié)果如圖1所示,隨著pH的降低,GA溶液的濁度沒有顯著性變化(p>0.05),說明GA溶液受pH影響小,穩(wěn)定性好。SC卻不同,開始階段,隨著pH的降低,濁度沒有顯著性變化(p>0.05),當(dāng) pH<6.0時(shí),濁度開始顯著地增大(p<0.01),這是因?yàn)榇藭r(shí)SC中的4種酪蛋白按照一定的順序(先κ,β，然后αs1，最后αs2)發(fā)生溶解,同時(shí)SC結(jié)構(gòu)中的膠體磷酸鈣從其膠粒中溶解出來,SC的膠束結(jié)構(gòu)傾向于聚集,所以濁度會(huì)顯著增大[13];直到pH達(dá)到5.1時(shí),濁度達(dá)到最大,之后繼續(xù)降低pH,濁度顯著地降低(p<0.01),這是因?yàn)镾C結(jié)構(gòu)中的膠體磷酸鈣完全溶解,膠體所帶電荷下降導(dǎo)致膠粒間的靜電排斥作用減弱,發(fā)生自聚集形成大顆粒的絮狀沉淀物,此時(shí)發(fā)生相分離[14];當(dāng)pH達(dá)到4.6時(shí),濁度最小,這是因?yàn)轶w系此時(shí)達(dá)到SC的等電點(diǎn),SC的溶解度最低,沉淀量達(dá)到最大,沉降到底部;繼續(xù)降低pH,濁度開始增大(p<0.01),這是因?yàn)镾C鏈上所帶的正電荷越來越多,靜電斥力逐漸增大致使聚集的沉淀物開始發(fā)生部分解離[15];當(dāng)pH達(dá)到3.5時(shí),濁度達(dá)到第二個(gè)極值點(diǎn),說明此時(shí)沉淀發(fā)生完全解離;之后降低pH,濁度逐漸降低,這是因?yàn)殡S著pH的進(jìn)一步降低,SC分子鏈上帶有更多的正電荷,SC的溶解度增加從而導(dǎo)致體系濁度降低[16]。

圖1 SC與GA濁度隨pH的變化 Fig.1 Change of turbidity of pH of SC and GA under different pH注:SC、GA濃度均為1 mg/mL,NaCl 濃度:0 mmol/L。

對(duì)SC和GA在不同pH下的Zeta電位進(jìn)行表征,結(jié)果如圖2所示。圖2顯示SC等電點(diǎn)約為4.6,GA的pKa約為2.4,這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[17-18]。

圖2 SC和GA Zeta電位隨pH的變化Fig.2 Change of Zeta potential of SC and GA under differnt pH

2.2 pH對(duì)SC和GA相互作用及納米粒形成的影響

pH對(duì)SC和GA相互作用的影響見圖3,從圖3可以看出pH大于5.6時(shí)(圖中的區(qū)間Ⅰ),濁度比較低且無顯著性變化(p>0.05),溶液基本上呈無色,說明此時(shí)體系中SC與GA均帶負(fù)電荷,兩者在溶液中呈現(xiàn)共溶狀態(tài)分散于溶液中;pH小于5.6(此pH稱為pHc,為兩者開始發(fā)生結(jié)合生成可溶性復(fù)合物的pH[19])時(shí),隨著pH的繼續(xù)減小,濁度突然開始快速增長(zhǎng)(p<0.01),表明SC開始與GA發(fā)生復(fù)合,此階段雖然沒有到達(dá)SC的等電點(diǎn),但其帶正電的支鏈片段已經(jīng)開始與GA帶負(fù)電的片段結(jié)合[20];pH降至5.2后,繼續(xù)降低pH,濁度緩慢增大(p>0.05),當(dāng)pH為3.6(此pH稱為pHφ1,為可溶性復(fù)合物生成量達(dá)到最大的pH[21])時(shí),濁度達(dá)到第一個(gè)極值點(diǎn),此階段濁度變化小;當(dāng)pH小于3.6時(shí),濁度又開始迅速增大(p<0.01),當(dāng)pH達(dá)到3.3(此pH稱為pHopt,表示SC、GA兩者復(fù)合物達(dá)到靜電平衡、體系發(fā)生相變的pH[22])時(shí),濁度達(dá)到最大值,此時(shí)有沉淀顆粒出現(xiàn),這是二者解離出的相反電荷數(shù)值相等達(dá)到靜電平衡的結(jié)果,說明此時(shí)體系發(fā)生了相變,可溶性納米復(fù)合物聚集形成不溶性沉淀[23],因此pHc-pHopt階段(圖中的區(qū)間Ⅱ)二者形成了可溶性的穩(wěn)定納米粒復(fù)合物;繼續(xù)降低pH,濁度急劇降低(p<0.01),這是沉淀沉降分層所導(dǎo)致,之后濁度開始增大(p<0.01),表明不溶性沉淀復(fù)合物沉淀開始部分解離,到pH2.3時(shí)(此pH稱為pHφ2,為不溶性復(fù)合物沉淀完全解離的對(duì)四個(gè)關(guān)鍵pH點(diǎn)進(jìn)行粒徑和Zeta電位的表征,結(jié)果見表1。分析表1,可以得到濁度隨pH的減小先升后降(p<0.05),在pH3.3時(shí)達(dá)到峰值;粒徑和多分散指數(shù)(PDI)也呈先升后降的趨勢(shì),其中pH5.6和pH3.6粒徑較小(均小于150 nm),二者之間沒有顯著性差異(p>0.05),PDI在pH5.6和pH3.6時(shí)具有顯著性差異(p<0.05),而Zeta電位的絕對(duì)值卻是先降后升,其中pH5.6和pH3.6時(shí)體系Zeta電位較大(均大于15 mV),且二者之間沒有顯著性差異(p>0.05)。pH5.6到pH3.6階段粒徑的增加是因?yàn)楫?dāng)pH小于4.8后,SC及GA在體系中帶有相反的電荷,隨著pH的減小,SC所解離出的正電荷電量逐漸增加,有更多的SC能與之通過靜電吸引發(fā)生自組裝而從溶液狀態(tài)向乳液轉(zhuǎn)變,即有一定尺度的粒子形成,表現(xiàn)為粒徑增加[27]。當(dāng)pH降低到3.3時(shí),粒徑達(dá)到最大,此時(shí)體系發(fā)生相變,形成不溶性沉淀物,Zeta電位的絕對(duì)值達(dá)到最小,這是體系正負(fù)電荷達(dá)到靜電平衡的結(jié)果,而此時(shí)粒徑達(dá)到最大值則主要是因?yàn)榱Ｗ颖砻娴膸щ娏坎蛔阋援a(chǎn)生足夠大排斥力,導(dǎo)致粒子之間發(fā)生聚集產(chǎn)生大顆粒沉淀。同時(shí)此時(shí)PDI值超過0.5,說明體系中有多種尺寸的聚集物,溶液中的復(fù)合物不均一。比較四個(gè)關(guān)鍵pH點(diǎn),最佳制備納米粒的pH點(diǎn)為pHφ1。

圖3 SC和GA復(fù)合物濁度隨pH的變化Fig.3 Turbidity of SC-GA complexes under different pH

表1 體系不同pH下的SC-GA復(fù)合物的表征Table 1 Characterization of SC-GA complexes at different pH values

注：不同的字母表示不同組之間具有顯著性差異(p<0.05),表2～表5同。pH[24])濁度達(dá)到第三個(gè)極值點(diǎn),說明此時(shí)沉淀完全解離消失,所以pHopt-pHφ2階段(圖中的區(qū)間Ⅲ)二者形成了不溶性沉淀;隨著pH的繼續(xù)降低(小于pHφ2,圖中的區(qū)間Ⅳ),濁度迅速減小(p<0.01),這是因?yàn)榇藭r(shí)GA(pKa約為2.4)與SC都帶正電,二者產(chǎn)生的靜電斥力使其再次處于溶脹狀態(tài)。以上變化說明SC與GA之間的相互作用以及是否可形成納米粒極大的受到pH的影響,證明SC與GA的復(fù)合作用主要是靜電相互作用[25],這與其他蛋白和多糖通過靜電相互作用結(jié)合形成納米粒復(fù)合物的現(xiàn)象一致[16,18,23,26]。

在pHc至pHopt之間取樣對(duì)復(fù)合物進(jìn)行粒徑、Zeta電位表征,結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出,隨著pH的減小,粒徑先增大后減小然后再增大,且pH5.2時(shí)粒徑最小,而pHφ1(3.6)復(fù)合物粒徑與最小值具有顯著性差異(p<0.05);PDI隨著pH的減小先減小后增大,在pH3.6時(shí)達(dá)到最小;復(fù)合物Zeta電位的絕對(duì)值隨pH的減小先緩慢減小,到pH小于3.6時(shí)急劇減小,表明復(fù)合物逐漸趨于不穩(wěn)定的狀態(tài),而pH3.6時(shí)復(fù)合物Zeta電位的絕對(duì)值為18.61 mV,大于15 mV,且與最大值(pH5.2)不具有顯著性差異(p>0.05);濁度隨pH的降低逐漸增大,而復(fù)合物濁度的大小可以反映體系中顆粒物的多少,在保證體系中大分子不發(fā)生聚集的前提下可以適當(dāng)降低pH以提高體系濁度[27],圖4反應(yīng)pH3.4時(shí)濁度達(dá)到最大,但此時(shí)粒徑達(dá)到最大且超過300 nm,PDI達(dá)到最大值0.2,Zeta電位絕對(duì)值達(dá)到最小(小于15 mV),此時(shí)體系更趨向于不穩(wěn)定的狀態(tài)。綜上,pH3.6時(shí)粒徑小于200 nm,Zeta電位絕對(duì)值大于15 mV,PDI最小,體系分布均勻,濁度接近90%,納米顆粒多,體系穩(wěn)定,因此pHφ1是比較適宜制備穩(wěn)定納米粒的pH點(diǎn),這與Ye[10]等的研究結(jié)果一致。

圖4 pH對(duì)SC和GA復(fù)合物粒徑、PDI(a),濁度、Zeta電位(b)的影響Fig.4 Effects of pH on particle size,PDI,turbidity and zeta potential of SC and GA complexes

2.3 SC/GA濃度比對(duì)SC和GA相互作用及納米粒形成的影響

從圖5和圖6可知,當(dāng)SC、GA兩者濃度比小于1時(shí),隨著SC濃度的增加,pHc變化不大(p>0.05),pHφ1顯著增大(p<0.05),pHopt增大(p<0.05),pHφ2基本保持不變(p>0.05);兩者比例大于1時(shí),隨著SC濃度的增加,pHc變化不大(p>0.05),pHφ1增大(p<0.05),pHopt增大(p<0.05),pHφ2增大(p<0.05)。但比例大于1時(shí),每個(gè)GA多糖鏈通過靜電相互作用結(jié)合SC的能力達(dá)到飽和,剩余的SC在酸化過程中大量聚集產(chǎn)生沉淀,體系穩(wěn)定性下降,所以形成穩(wěn)定復(fù)合物的比例應(yīng)小于2,林柳風(fēng)[5]在研究溶菌酶與果膠相互作用的時(shí)候也得到類似的結(jié)論。

圖5 不同濃度比的復(fù)合物體系濁度隨pH的變化Fig.5 Change of turbidity with pH under different concentration ratio of SC to GA注:(a)濃度比(SC/GA)≤1(b)濃度比(SC/GA)≥1。

圖6 復(fù)合物體系關(guān)鍵pH點(diǎn)隨SC和GA濃度比的變化Fig.6 Change of critical pH under different concentration ratios of SC to GA

制備復(fù)合物過程中觀察體系狀態(tài)的變化結(jié)合相變圖得到各個(gè)比例下的pHφ1,在該pH下制備納米粒復(fù)合物,對(duì)復(fù)合物的粒徑、Zeta電位表征結(jié)果見表2。由表2可知,隨著SC濃度的增加,納米粒在pHφ1處的粒徑、PDI均呈先減小后增大之后又減小的趨勢(shì),Zeta電位的絕對(duì)值先增大后減小之后又增大,濁度逐漸增大;濃度比大于2時(shí),pHφ1超過5,高于SC的等電點(diǎn),SC和GA的結(jié)合程度不高,此外體系在高pH區(qū)域即產(chǎn)生沉淀,體系趨于不穩(wěn)定的狀態(tài);比例1∶1和1∶2在pHφ1處形成的納米粒粒徑均小于150 nm,二者沒有顯著性差異(p>0.05),PDI均小于0.2,且1∶1時(shí)小于0.1,二者具有顯著性差異(p<0.05),Zeta電位的絕對(duì)值均大于15 mV且具有顯著性差異(p<0.05),濁度在1∶1時(shí)大于1∶2且具有顯著性差異(p<0.05),復(fù)合物濁度的大小可以反映體系中顆粒物的多少,在保證體系中大分子不發(fā)生聚集的前提下濁度越大說明體系中納米顆粒的數(shù)量越多。綜上,體系1∶2～1∶1范圍在pHφ1形成的粒子粒度分布均一、帶電量大,綜合考慮PDI、Zeta電位和濁度,其中1∶1時(shí)形成的粒子粒度分布更均勻,帶電量更大,更穩(wěn)定。

表2 不同濃度比的SC和GA在pHφ1形成的納米粒的的表征Table 2 Characterization of nanoparticles formed at pHφ1 with different concentration ratios of SC and GA

2.4 SC與GA總濃度對(duì)SC和GA相互作用及納米粒形成的影響

結(jié)合圖7、圖8可知,體系聚合物總濃度≤3 mg/mL時(shí),pHc、pHφ1、pHopt和pHφ2基本不變(p>0.05),且隨著體系聚合物總濃度的增大,各拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)的 T增大(p<0.05);體系聚合物濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí),pHφ1急劇增大(p<0.01),pHc、pHopt和pHφ2基本不變(p>0.05)。過了pHc點(diǎn),隨著pH的降低,濁度迅速增大(p<0.05),這是因?yàn)榇藭r(shí)體系發(fā)生相分離,穩(wěn)定性下降。有研究表明蛋白質(zhì)和多糖混合體系中相分離的發(fā)生出現(xiàn)在二者濃度高于某一臨界濃度的情況下[28],所以SC和GA復(fù)合體系的臨界濃度為4.0 mg/mL,因此形成穩(wěn)定納米復(fù)合物的體系聚合物濃度應(yīng)小于臨界濃度4.0 mg/mL。

表3 不同SC與GA總濃度體系在pHφ1下形成的納米粒的表征Table 3 Characterization of nanoparticles formed at pHφ1 with different biopolymer concentrations of SC and GA

圖7 不同SC與GA總濃度復(fù)合物體系濁度隨pH的變化Fig.7 Change of turbidity with pH under different biopolymer concentration

圖8 關(guān)鍵pH點(diǎn)隨SC與GA總濃度的變化 Fig.8 Change of critical pH under different biopolymer concentrations of SC and GA

制備復(fù)合物過程中觀察體系狀態(tài)的變化結(jié)合相變圖得到各個(gè)濃度下的pHφ1,在該pH下制備納米粒復(fù)合物,對(duì)復(fù)合物的粒徑、Zeta電位表征結(jié)果見表3。由表3可知,隨著SC與GA總濃度的降低,復(fù)合物在pHφ1形成的納米粒粒徑逐漸減小,在3.0 mg/mL濃度以下時(shí)粒度小于200 nm,PDI先減小后增大,且在3.0 mg/mL時(shí)達(dá)到最小,Zeta電位絕對(duì)值先增大后減小,且在2.0 mg/mL時(shí)達(dá)到最大,但3.0 mg/mL時(shí)Zeta電位的絕對(duì)值與2.0 mg/mL時(shí)均超過18 mV且二者沒有顯著性差異(p>0.05),濁度逐漸減小。綜合以上各指標(biāo),得到形成納米粒的SC與GA總濃度范圍為1.2～3.0 mg/mL,考慮到形成納米粒的數(shù)量,最佳濃度為3.0 mg/mL。

2.5 NaCl濃度對(duì)SC和GA相互作用及納米粒形成的影響

總之，在水利工程建設(shè)階段，結(jié)合施工合同的各項(xiàng)條款，加強(qiáng)對(duì)各種風(fēng)險(xiǎn)的分析，制定切實(shí)可行的控制措施，保證施工進(jìn)度，才有利于確保工程建設(shè)的順利開展及社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益的提升。

結(jié)合圖9、圖10可知,與不加NaCl相比,低濃度的鹽(5,10 mmol/L)的加入使得未達(dá)到pHφ1之前各點(diǎn)的T減小(p<0.05);NaCl濃度大于10 mmol/L時(shí),pHφ1和pHφ2對(duì)應(yīng)的T增大(p<0.05);NaCl濃度達(dá)到50 mmol/L時(shí),相變圖形狀發(fā)生改變,與單獨(dú)SC存在時(shí)的相變圖類似,這是因?yàn)楦啕}產(chǎn)生靜電屏蔽作用,對(duì)大分子的自組裝聚合行為有抑制作用[29];隨著NaCl濃度的增加,pHc減小(p<0.05),體系形成可溶性復(fù)合物的起點(diǎn)發(fā)生左移。這是由于 NaCl 溶解后會(huì)在體系中釋放出 Na+和 Cl-離子,兩種帶電離子在電荷相互作用下結(jié)合到SC、GA分子上帶相反電荷的區(qū)域上,引起對(duì)大分子靜電作用的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng),減少了蛋白質(zhì)和多糖體系中可以發(fā)生作用的電荷的數(shù)目,從而降低SC-GA復(fù)合物形成能力[30],所以表現(xiàn)為pHc向更小的pH移動(dòng)。pHφ1在NaCl濃度≤10 mmol/L時(shí)緩慢增大(p>0.05),當(dāng)NaCl濃度由10 mmol/L增大到20 mmol/L時(shí),pHφ1急劇增大(p<0.01),此后又緩慢增大(p>0.05),pHopt在NaCl濃度≤20 mmol/L時(shí)緩慢增大(p>0.05),當(dāng)NaCl濃度由20 mmol/L增大到30 mmol/L時(shí),pHopt迅速增大(p<0.01),此后又緩慢增大(p>0.05);pHφ2在這個(gè)過程中略有增大(p>0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)由于氯化鈉的存在,增加了體系離子強(qiáng)度,對(duì)復(fù)合物的形成起靜電屏蔽作用,進(jìn)一步說明SC與GA復(fù)合作用主要是靜電相互作用[31]。

圖9 不同NaCl濃度的復(fù)合物體系濁度隨pH的變化Fig.9 Change of turbidity with pH under different NaCl concentration注:(a)NaCl濃度<50 mmol/L(b)NaCl濃度≥50 mmol/L。

圖10 關(guān)鍵點(diǎn)pH隨NaCl濃度的變化Fig.10 Change of critical pH under different NaCl concentrations

制備復(fù)合物過程中觀察體系狀態(tài)的變化結(jié)合相變圖得到不同NaCl濃度下的pHφ1,在該pH下制備納米粒復(fù)合物,對(duì)復(fù)合物的表征結(jié)果見表4。從表4可以看出,隨著NaCl濃度的增加,納米粒復(fù)合物的粒徑呈先減小、后增大的趨勢(shì),且在NaCl濃度為10 mmol/L粒徑最小且分布最均勻,Zeta電位的絕對(duì)值先增大后減小,且在NaCl濃度為10 mmol/L時(shí)達(dá)到最大(超過15 mV),濁度逐漸增大,但在0～10 mmol/L范圍內(nèi)沒有顯著性差異(p>0.05)。說明與不加NaCl相比,低濃度的鹽(5,10 mmol/L)的加入使體系趨于更穩(wěn)定的狀態(tài)。這是因?yàn)楹x子的聚合物(SC)成鹽后,離子強(qiáng)度增加使得復(fù)合物形成更加緊密堆積的聚集態(tài),顆粒粒徑減小,所以此時(shí)粒徑下降[32],而高濃度的鹽(大于40 mmol/L)的加入使體系使兩者的靜電相互作用逐漸被抑制,體系粒徑逐漸增大,Zeta絕對(duì)值減小,體系穩(wěn)定性下降。此外體系NaCl濃度在大于20 mmol/L時(shí)Zeta電位絕對(duì)值小于15 mV,所以形成穩(wěn)定納米粒的鹽濃度不宜太高(小于20 mmol/L)。綜合比較各個(gè)指標(biāo),體系在NaCl濃度為10 mmol/L時(shí),粒徑與PDI達(dá)到最小,Zeta電位絕對(duì)值達(dá)到最大,且與其他組具有顯著性差異,同時(shí)濁度較大,生成的納米粒數(shù)量多,所以確定的最佳鹽濃度為10 mmol/L。

表4 不同NaCl濃度體系在pHφ1下形成的納米粒的表征Table 4 Characterization of nanoparticles formed at pHφ1 with different NaCl concentrations

2.6 微觀形貌分析

在SC∶GA=1∶1(濃度比),總濃度3 mg/mL,10 mmol/L NaCl,pH4.2條件下制備SC-GA納米粒,并通過透射電鏡觀測(cè)SC-GA納米粒在干態(tài)的形貌,如圖11所示。由圖11可以看出,干態(tài)納米粒子呈球形,分散均勻,透射電鏡表征得到的納米粒粒徑分布在150 nm左右,與用激光粒度儀測(cè)得平均粒徑(約142 nm)接近。

圖11 SC-GA納米粒的透射電鏡圖Fig.11 Transmission electron micrographs of SC-GA nanoparticles

2.7 納米粒貯藏穩(wěn)定性

納米粒貯藏穩(wěn)定性結(jié)果如表5所示,在貯藏7 d時(shí)粒徑和Zeta電位與原樣相比無顯著性差異(p>0.05),貯藏30 d時(shí)粒徑增大(p<0.05),Zeta電位絕對(duì)值降低(p<0.05),但在為期7、15、30 d的貯藏時(shí)間內(nèi)納米粒粒徑皆小于200 nm,粒度分散指數(shù)小于0.2,Zeta電位絕對(duì)值大于15 mV,處于穩(wěn)定的范圍,說明制備的SC-GA納米顆粒在溶液中可以保持良好的穩(wěn)定性,不易解離與聚集。

表5 納米粒粒徑、Zeta電位隨貯藏時(shí)間變化Table 5 Changes of particle size and zeta potential with storage time

圖12 不同樣品的紅外光譜圖Fig.12 FTIR spectra of different samples注:(a)SC,(b)GA,(c)SC與GA混合物,(d)SC-GA納米粒。

2.8.2 熒光光譜分析 蛋白質(zhì)是熒光體,其內(nèi)源性熒光主要來自于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)等氨基酸殘基[34]。SC的熒光主要來自于Trp,且在 280 nm波長(zhǎng)附近激發(fā)[35]。因此應(yīng)用主要來源于色氨酸的SC自身熒光的猝滅可以研究水溶液中GA與SC分子間的相互作用的過程。圖13顯示了激發(fā)波長(zhǎng)280 nm時(shí),不同溫度、不同濃度GA對(duì)SC溶液的熒光發(fā)射光譜的影響。從中可以看出SC中的色氨酸在發(fā)射波長(zhǎng)364 nm左右出現(xiàn)峰值且SC與GA的相互作用并沒有使色氨酸的熒光發(fā)射光譜發(fā)生位移,表明SC與GA之間的相互作用并沒有改變色氨酸周圍環(huán)境的極性,所以GA與SC之間的相互作用并沒有使SC的構(gòu)象發(fā)生改變[36]。相同溫度,隨著GA濃度的增加,色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度降低;相同GA濃度,隨著溫度的升高,色氨酸殘基的內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低,表明GA與SC的相互作用使SC內(nèi)源熒光規(guī)律性猝滅。

圖13 GA濃度對(duì)SC熒光光譜的影響 Fig.13 Fluorescence quenching of SC affected by the concentration of GA注:a:25 ℃,b:35 ℃;SC濃度為0.5 mg/mL,1～10:GA濃度分別為0,0.5,1,2,3,4,5,6,8,10 mg/mL。

熒光猝滅類型有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅,猝滅類型可根據(jù) Stern-Volmer 方程進(jìn)行判斷[37]。

F0/F=Ksv[Q]+1=Kqτ0[Q]+1

式(1)

其中,F0和F分別表示加入和不加入猝滅劑時(shí)體系的熒光強(qiáng)度;[Q]為猝滅劑濃度(mol/L),Ksv為 Stern-Volmer 猝滅常數(shù)(L/mol),Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)(L·mol-1·s-1),各類熒光猝滅劑對(duì)生物大分子的最大猝滅常數(shù)約為2.0×1010L·mol-1·s-1,τ0為不存在猝滅劑時(shí)熒光大分子的平均壽命,一般約為10-8s[38]。

根據(jù)Stern-Volmer方程,以[Q]為自變量,F0/F為因變量,通過線性擬合得圖14,由圖中直線的斜率和τ0可得到不同溫度條件下GA與SC相互作用的Ksv和Kq,結(jié)果見表6。由圖14和表6可知,不同溫度下,GA對(duì)SC熒光發(fā)射光譜的Stern-Volmer曲線都呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系,且隨著溫度的升高,曲線斜率即Ksv減小,表明GA對(duì)SC的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅[39]。同時(shí),猝滅劑對(duì)生物大分子的最大猝滅速率常數(shù)為2×1010L·mol-1·s-1[40],而不同溫度下GA對(duì)SC的熒光猝滅速率常數(shù)Kq均大于此值,進(jìn)一步說明GA對(duì)SC的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅。Wang等[41]研究毛木耳多糖和人血清白蛋白(HSA)相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)多糖對(duì)HAS的的熒光猝滅也為靜態(tài)猝滅。

表6 不同溫度下GA與SC相互作用的Stern-Volmer方程常數(shù)和曲線擬合方程Table 6 Stern-Volmer quenching constants and curves fitted equation of interaction between GA and SC at different temperature

表7 不同溫度下GA與SC相互作用的結(jié)合常數(shù)和曲線擬合方程Table 7 Binding constants and curves fitted equation of interaction between GA and SC at different temperature

圖14 不同溫度條件下GA對(duì)SC熒光猝滅的Stern-Volmer曲線Fig.14 Stern-Volmer plots of SC quenched by GA at different temperatures

靜態(tài)猝滅過程中,分子之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可根據(jù)以下雙對(duì)數(shù)方程[42]得到:

lg [(F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q]

式(2)

其中,F0和F分別表示加入和不加入GA時(shí)體系的熒光強(qiáng)度;[Q]為GA濃度(mol/L);Ka為表觀結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù);[Q]為猝滅劑的濃度(mol/L)。

根據(jù)方程式(2),以lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]作線性擬合得圖15,計(jì)算得到不同溫度條件下GA與SC相互作用的表觀結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n如表7所示。圖15結(jié)合表7可知,GA與SC在25 ℃和35 ℃時(shí)均形成了結(jié)合位點(diǎn)數(shù)接近于1的復(fù)合物,且結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)接近,均無顯著差異(p>0.05),說明在常溫下的水相體系中,適當(dāng)升高溫度對(duì)SC和GA相互作用的影響較小,而濁度-pH相圖表明體系pH和離子強(qiáng)度極大地影響了復(fù)合物的形成,因此進(jìn)一步印證了SC與GA之間形成納米粒復(fù)合物的主要作用力為靜電相互作用[5]。與此同時(shí),兩個(gè)溫度下的水相體系中,二者的結(jié)合常數(shù)均在104～105L·mol-1之間,說明與配體-蛋白質(zhì)特異性比較,SC與GA之間的靜電相互作用屬于親和性比較低的[43]。Hu等[44]研究酪蛋白磷酸肽(CPP)和殼聚糖(CS)靜電相互作用形成納米粒時(shí)發(fā)現(xiàn)CS和CPP之間的結(jié)合也屬于低親和性的。

圖15 不同溫度條件下GA對(duì)SC熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)曲線Fig.15 Double logarithmic curves of SC quenched by GA at different temperature

3 結(jié)論

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Studies on the interaction of sodium caseinate and gum arabic and preparation of nanoparticles

LIU Chun-hua1,2,ZHOU Ai-mei1,2,*,YANG Ran1,PENG Dan-ying1,LIU Xin1,2,CAO Yong1,2

(1.College of Food Science of South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 2.Guangdong Province Engineering Research Center for Bioactive Natural Products,Guangzhou 510642,China)

In this paper,the effects of pH,the concentration ratio of sodium caseinate(SC)to gum arabic(GA),the total concentration of SC and GA and the ionic strength(the concentration of NaCl)on the interaction between SC and GA and the formation of nanoparticles were investigated by the characterization of turbidity,particle size and zeta potential. The morphological attributes of the nanoparticles were characterized by transmission electron microscopy(TEM)and the storage stability of nanoparticles was studied. Furthermore,the mechanism of the formation of nanoparticles formed by interaction between SC and GA was researched by infrared spectroscopy(FTIR)and fluorescence spectroscopy. The results revealed that pH and ionic strength greatly influenced the interaction between SC and GA and the formation of nanoparticles,indicating that the main force to form nanoparticles between SC and GA was electrostatic interaction. Meanwhile,the formation of stable nanoparticles was achieved under the following conditions:the concentration ratio of SC to GA was 1∶1,pH was 4.2,the total concentration of SC and GA was 3.0 mg/mL and the concentration of NaCl was 10 mmol/L. The particle size of resulted nanoparticles was about 142 nm and zeta potential was about-21.43 mV. Moreover,the nanoparticles remained stable after storage of one month at 4 ℃. TEM results showed that the nanoparticles were spherical in shape. FTIR results confirmed that electrostatic interaction occured in positively charged amino of SC and negatively charged carboxyl of GA. The fluorescence spectra results demonstrated that the combination between SC and GA to form nanoparticles by electrostatic interaction was low affinity.

sodium caseinate;gum arabic;interaction;nanoparticle;stability;mechanism

2017-03-06

劉春花(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)，E-mail：liuch0805@126.com。

*通訊作者:周愛梅(1971-)，女，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品及農(nóng)產(chǎn)品深加工研究，E-mail:zhouam@scau.edu.cn。

TS201.2

A

1002-0306(2017)15-0068-011

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.015