雙效型酵母細胞壁提取物及其對黃曲霉毒素B1吸附特性研究

錢潘攀,李紅波,趙巖巖,周 威,莫海珍,胡梁斌

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

雙效型酵母細胞壁提取物及其對黃曲霉毒素B1吸附特性研究

錢潘攀,李紅波,趙巖巖,周 威,莫海珍,胡梁斌*

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

本研究旨在利用麝香草酚裂解酵母細胞,同時以酵母膜脂為載體,與細胞壁共同組成具備抑制黃曲霉孢子萌發和吸附毒素能力的雙效型細胞壁提取物。結果表明:通過流式細胞儀及熒光顯微鏡檢測發現麝香草酚可以殺死酵母細胞;當使用500 μg/mL麝香草酚制備其酵母細胞壁提取物,采用苯酚硫酸法分析發現制備物中β-葡聚糖的含量升高51.5%,而通過SDS-PAGE研究結果表明,胞內可溶性蛋白含量降低40%。這些結果表明麝香草酚可以誘導酵母細胞發生裂解,破壞其細胞膜的完整性,導致細胞壁上肽聚糖的結構發生變化、胞內內容物釋放,增強了對黃曲霉毒素B1的吸附能力。利用薄層層析(TLC)和液相色譜(HPLC)檢測酵母細胞壁提取物對黃曲霉毒素的吸附情況,結果表明制備的提取物對黃曲霉毒素的吸附能力達到2.5 μg/mg,對麝香草酚的載藥量達到41.5 μg/mg。本文可為糧食、飼料中控制黃曲霉毒素污染提供新的研究思路及理論依據。

麝香草酚,酵母細胞壁提取物,吸附,黃曲霉毒素B1

黃曲霉(Aspergillusflavus,AF)是一種分布極其廣泛的絲狀真菌,經常污染糧食作物和動物飼料,能產生毒性大、致癌性強的次級代謝產物黃曲霉毒素(aflatoxin,AFT)[1-3]。牲畜食用霉菌毒素污染的飼料會引發體重下降和免疫力降低等癥狀,隨后通過食物鏈進入人體造成機體損傷和增加患癌癥的風險[4-6]。目前,主要通過在飼料中添加吸附劑等方法對AFT進行吸附,使毒素不被動物所吸收,直接排出動物體外,也是公認最有效的脫毒措施[7-8]。常見的霉菌毒素吸附劑主要有水合鋁硅酸鹽類、酵母細胞壁提取物類、活性炭、交聯聚乙烯吡咯烷酮和復合吸附劑等[9]。劉媛婷等[10]研究了酵母細胞壁培養物、水合鋁硅酸鈉鈣鹽類等對黃曲霉毒素B1的吸附效果,經過體內外實驗和動物實驗復合吸附劑的吸附能力最強,對豬飼料霉菌毒素吸附脫毒效果最好。而酵母細胞壁提取物具有較好的吸附AFT的能力、添加量少和不污染環境等特點,是一種非常有前景的的霉菌毒素吸附劑產品。研究表明酵母細胞壁多糖是吸附AFT有效成分,對AFT的吸附率可達92%[11-12],通常通過酸、堿或酶處理制備細胞壁提取物與生物毒素的結合效果顯著[13-14],但方法繁瑣且會損失磷脂等營養成分。目前亟需尋找一種高效、操作簡單、成本低的方法處理酵母細胞,用于吸附飼料中的黃曲霉毒素。

麝香草酚(Thymol),別名百里香酚,是一種單萜酚,主要存在于唇形科百里香屬植物中,是百里香和牛至的香精油主要成份,具有宜人香氣和對病原微生物有很強的抗菌活性的作用[15-16]。研究表明麝香草酚對革蘭氏陽性菌、陰性菌都有很好的抗菌活性,主要是破壞其細胞膜的完整性、抑制細胞膜麥角甾醇的生物合成和質子轉運ATP酶系統[17-18]。有研究報道麝香草酚對黃曲霉的抗菌活性是通過NO(nitric oxide)和ROS(reactive oxygen species)介導使黃曲霉孢子裂解死亡[19]。麝香草酚作為一種植物源抑菌劑,安全性高,資源豐富,并且對細菌、霉菌、酵母都有較強的抑制作用[20]。

本研究以酵母細胞為原材料,通過麝香草酚處理后,冷凍干燥后制備載有麝香草酚的雙效型酵母細胞壁提取物,并探究酵母細胞壁提取物對黃曲霉孢子的抑菌效果。旨在利用麝香草酚裂解酵母細胞,同時以酵母膜脂為載體,與細胞壁共同組成具備抑制黃曲霉和吸附毒素能力的雙效型酵母細胞壁提取物,為其在動物飼料添加劑、飼料脫毒等方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生型釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) By4741 Invitrogen公司;野生型黃曲霉菌CGMCC3.2890 中國普通微生物菌種保藏管理中心;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基 青島高科園海博生物技術有限公司,4 ℃保存。麝香草酚(Thymol,99%) Sigma公司;二甲基亞砜(DMSO) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;碘化丙啶(PI)熒光染料 上海碧云天生物技術有限公司;GF254硅膠板 購于青島海洋化工廠;氨基黑 上海索萊寶生物科技有限公司。其余試劑皆為分析純。

1260型高效液相色譜 美國Agilent公司;Multifuge X1R型高速冷凍離心機 Thermol公司;流式細胞儀 美國Beckman公司;熒光顯微鏡 Zeiss Series 120Q;Alphal-2LD型冷凍干燥機 德國Christ公司;DFCNW-5LB型氮吹儀 杭州德克爾實驗設備有限公司;-25 ℃低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限責任公司;JY-SCZ2+型迷你雙垂直電泳儀 北京君意東方設備有限公司;MSC-100型恒溫混勻儀 杭州奧盛儀器有限公司;TU-1810PC型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;ZWY-304型多功能脫色搖床 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑與培養基的制備 麝香草酚:稱取100 mg麝香草酚溶解于1 mL DMSO,放置于-25 ℃冰箱長期保存備用。磷酸鹽緩沖液(PBS):稱取NaCl 8.0 g,KCl 0.2 g,Na2HPO4·12H2O 3.58 g,KH2PO40.24 g,加蒸餾水至800 mL于磁力攪拌器上充分溶解,調pH7.4,定容至1000 mL,121 ℃高壓滅菌15 min,4 ℃條件下保存備用。

YPD培養基:稱取酵母提取物10.0 g,蛋白胨20.0 g,葡萄糖20.0 g,瓊脂15.0 g,加水至1000 mL于磁力攪拌器上充分溶解,自然pH,分裝三角瓶于121 ℃高壓滅菌20 min。沙氏培養基:稱取蛋白胨10.0 g,葡萄糖40.0 g,瓊脂15.0 g,加水至1000 mL于磁力攪拌器上充分溶解,自然pH,分裝三角瓶于121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2.2 菌株活化 將挑取野生型釀酒酵母單克隆于YPD液體培養基中,30 ℃,160 r/min 振蕩培養24 h,涂板獲得單克隆酵母菌株備用。

1.2.3 酵母細胞膜完整性的檢測 挑取已活化的單克隆酵母于液體YPD培養基中,30 ℃、160 r/min振蕩培養至OD600=2.0,分裝于50 mL的EP管中,加入麝香草酚使其終濃度分別為100、200、300、400、500 μg/mL,處理4 h后5000 r/min離心5 min,用PBS重懸,加入終濃度為1 μg/mL的PI避光靜置冰浴15 min,5000 r/min離心5 min,PBS重懸使酵母細胞均勻分散,300目尼龍濾網過濾,用于流式細胞儀及熒光顯微鏡的檢測[21]。

1.2.4 蛋白質相對含量的測定 麝香草酚處理酵母細胞4 h后5000 r/min離心5 min,加入200 μL PBS重懸,加入約20 mg玻璃珠,用高速珠磨法破碎酵母細胞壁。將破碎后的樣品蛋白提取液與5×上樣緩沖液混勻,100 ℃煮沸5 min后,取20 μL上樣,進行不連續雙垂直平板電泳。將凝膠置室溫搖床上55 r/min染色(0.1%氨基黑的7%醋酸溶液)1 h,在7%醋酸溶液中脫色。其中蛋白含量相對值通過光密度軟件Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics,Inc.)進行計算,并以柱狀圖表示。

1.2.5β-葡聚糖含量的測定 麝香草酚處理酵母細胞4 h,離心棄上清,用PBS洗滌兩次后冷凍干燥(-50 ℃ 0.37 mbr)。取10 mg冷凍干燥后的酵母細胞裂解物溶于2 mL 50%稀硫酸中水解30 min,用苯酚硫酸法測酵母細胞壁提取物β-葡聚糖的含量,測定其在490 nm波長內的紫外吸收光譜[22]。

1.2.6 黃曲霉毒素B1含量的測定 麝香草酚處理酵母細胞4 h,離心棄上清,用PBS洗滌兩次后冷凍干燥。取20 mg冷凍干燥后的酵母細胞壁提取物,加入濃度為50 μg/mL黃曲霉毒素溶液,利用微孔板恒溫振蕩器震蕩培養(37 ℃,1 h,1000 r/min),再10000×g離心10 min,取上清液進行薄層層析實驗,展開劑是丙酮∶氯仿=1∶9[23]。并配制3%氫氧化鈉溶液處理4 h酵母細胞,使用上述同樣的方法取上清進行薄層層析實驗進行對照,并在365 nm紫外燈下觀察、拍照。

把制備的酵母細胞壁提取物吸附黃曲霉毒素后的上清液加三倍體積氯仿萃取,在60 ℃條件下用氮吹儀將其吹干,然后再分別將其溶于甲醇中,過0.22 μm微孔濾膜,然后用HPLC測定黃曲霉毒素的含量[24]。色譜柱:COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ Packed Column(4.6 mm ID×250 mm)(上海島泉公司);柱溫:22 ℃;進樣量:10 μL;紫外檢測器檢測波長:365 nm;流動相:乙腈∶甲醇∶水(1∶1∶2,v/v/v);流速:1 mL/min。

1.2.7 酵母細胞壁提取物對麝香草酚載藥能力的測定 挑取已活化的酵母單克隆于液體YPD培養基中在30 ℃、160 r/min振蕩培養至OD600=2.0,分裝于50 mL的EP管中,5000 r/min離心5 min,以5 mL的PBS洗滌兩次,稱得質量均為650 mg。用3 mL濃度分別為300、500 μg/mL的麝香草酚處理30 s,5000 r/min離心5 min取上清,進行紫外全波長掃描觀察麝香草酚特征吸收峰,并用Origin 8.5峰面積大小進行計算。

1.2.8 酵母細胞裂解物抑菌效果測定 分別稱1.2 g 300 μg/mL和500 μg/mL麝香草酚處理獲得的酵母細胞壁提取物加入溫度為50 ℃ 12 mL沙氏固體培養基中,待培養基凝固后,取10 μL 1×105、1×104、1×103CFU/mL孢子懸浮液進行滴板,待無菌風吹干后,放入30 ℃的培養箱48 h后觀察、拍照。

1.2.9 數據分析 實驗數據均運用 SPSS 12.0 數據處理系統,采用Duncan’s新復極差法(DMRT)進行顯著性分析。文章圖表數據的結果均是三次實驗數據的平均值±SD。

2 結果與分析

2.1 麝香草酚處理對酵母細胞膜完整性的影響

PI能夠與雙鏈核酸分子結合并發紅色熒光,但不能穿過完整的細胞膜,因此經常被用來鑒定細胞膜的完整性[21]。本研究發現經過300、400、500 μg/mL麝香草酚處理酵母細胞后,通過熒光顯微鏡觀察發出強烈紅色熒光(圖1);采用流式細胞儀分析,細胞主群峰發生了明顯的向右偏移,說明麝香草酚殺死了酵母細胞(圖2)。這就表明麝香草酚破壞酵母細胞膜的完整性,改變其細胞的通透性,PI進入酵母細胞并發出熒光。

圖1 熒光顯微鏡觀察的酵母細胞PI熒光強度分布Fig.1 The distribution of fluorescence intensity in the S.cerevisiae cells after PI dyeing by fluorescence microscopy

圖2 流式細胞儀統計的酵母細胞PI熒光強度分布Fig.2 The distribution of fluorescence intensity in the S.cerevisiae cells after PI dyeing by flow cytometer

2.2 酵母細胞壁提取物中β-葡聚糖和蛋白質的含量變化

酵母細胞壁提取物中的成分主要由多糖和少量的蛋白質、脂肪、礦物質等,其中β-葡聚糖是吸附毒素的主要成分[25-26]。本研究發現酵母細胞經不同濃度麝香草酚處理后,其提取物可溶性蛋白含量顯著降低(圖3),500 μg/mL麝香草酚處理后可溶性蛋白含量僅為對照的40.0%。β-葡聚糖的百分比顯著地增加(圖4),500 μg/mL麝香草酚處理后β-葡聚糖的百分比與對照組比增加了51.5%。有研究報道,麝香草酚通過損傷酵母細胞膜,破壞膜的完整性從而殺死酵母細胞[27-28]。因此,β-葡聚糖百分比的增加和蛋白質含量的減少表明麝香草酚誘導酵母細胞發生裂解而導致內容物釋放。

圖3 酵母細胞壁提取物蛋白SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE of proteins from yeast cell-wall extract注:1:未經麝香草酚處理的酵母細胞壁提取物;2～6:分別為100、200、300、400、500 μg/mL的麝香草酚處理的酵母細胞壁提取物。

圖4 酵母細胞壁提取物中可溶性蛋白與β-葡聚糖含量的變化Fig.4 The change of protein and β-glucan in yeast cell-wall extract treated with thymol

2.3 酵母細胞壁提取物對黃曲霉毒素B1的吸附作用

評價飼料AFT污染的主要指標即AFB1,也是飼料吸附劑的主要研究對象,所以實驗結果均以AFB1表示其黃曲霉毒素的含量。薄層層析和液相色譜實驗結果顯示利用麝香草酚制備的酵母細胞壁提取物吸附黃曲霉毒素的相對含量比堿處理效果顯著(圖5),其中500 μg/mL麝香草酚處理酵母細胞,其制備的酵母細胞壁提取物吸附AFB1,每毫克的酵母吸附黃曲霉毒素可達2.5 μg(圖6)。結果表明,酵母細胞經麝香草酚處理后,更有利于吸附黃曲霉毒素。

圖5 酵母細胞壁提取物吸附黃曲霉毒素B1上清液的薄層層析Fig.5 TLC of supernatant of adsorption of AFB1 by yeast cell-wall extract注:1:未經麝香草酚處理的酵母細胞壁提取物;2～6:分別為100、200、300、400、500 μg/mL的麝香草酚處理的酵母細胞壁提取物;7:3%的氫氧化鈉處理的酵母細胞壁提取物。

圖6 酵母細胞壁提取物吸附AFB1殘余量的變化Fig.6 The change of AFB1 residue in yeast cell-wall extract treated with thymol

2.4 酵母細胞壁提取物載藥情況

麝香草酚在273 nm處有最大吸收峰,其峰面積隨著麝香草酚處理酵母細胞的濃度增大而增大。當添加酵母細胞壁提取物后,殘余的麝香草酚在273 nm處吸收峰的峰面積顯著降低(圖7),采用Origin 8.5軟件對峰面積進行計算和處理,酵母細胞壁提取物可以吸附麝香草酚,添加酵母后的與未添加酵母峰面積之間的差值即為酵母細胞提取物對麝香草酚載藥能力的大小。經計算,當麝香草酚處理酵母細胞的工作濃度為500 μg/mL時,酵母細胞壁提取物對麝香草酚的載藥能力為41.5 μg/mg。

圖7 麝香草酚處理酵母細胞后殘余麝香草酚的特征吸收峰Fig.7 Characteristic absorption peak of residual thymol by yeast cell treated with thymol

2.5 酵母細胞壁提取物的抑菌作用

當使用工作濃度為0、300、500 μg/mL的麝香草酚處理酵母細胞獲得細胞壁提取物,結果顯示:其中500 μg/mL的麝香草酚處理酵母細胞得到的制備物,黃曲霉孢子在含有其制備物的沙氏平板上黃曲霉孢子的萌發和菌絲的生長受到顯著的抑制作用,表明麝香草酚處理后獲得的酵母細胞壁提取物有抑制黃曲霉的功效(圖8)。

圖8 麝香草酚處理酵母細胞后酵母細胞壁提取物的抑菌效果Fig.8 Antimicrobial effect by yeast cell-wall extract by yeast cell treated with thymol

3 結論

麝香草酚能夠破壞酵母細胞膜改變細胞的通透性;麝香草酚誘導酵母細胞發生裂解而導致內容物釋放,當500 μg/mL的麝香草酚處理時,細胞壁提取物中蛋白質的含量僅為對照組的40%,β-葡聚糖的含量增加了51.5%;制備的雙效型酵母細胞壁提取物對黃曲霉毒素的吸附能力為2.5 μg/mg,對麝香草酚的載藥量可達41.5 μg/mg,并對黃曲霉菌絲的生長有顯著的抑制作用。麝香草酚作為一種植物源抑菌劑,制備這種雙效型細胞壁提取物添加到糧食和飼料中,不會造成二次污染和藥物殘留,且這種細胞壁提取物制備方便簡潔,并適合大量的工業化生產[29-30]。這一研究結果有望為我國食品和飼料中黃曲霉毒素污染問題提供理論基礎。

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Double function yeast cell-wall extract and its capability of adsorbing aflatoxin B1

QIAN Pan-pan,LI Hong-bo,ZHAO Yan-yan,ZHOU Wei,MO Hai-zhen,HU Liang-bin*

(Department of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

In this study,we managed to produce a type of cell-wall extract with double functions i.e. spore inhibition and toxins adsorption by using thymol to anchor the phospholipid of yeast cells and lyse them. It was showed that thymol led to the yeast cell death with the observation by using the flow cytometry and fluorescence microscope. When yeast cell-wall extract by yeast cell was treated with 500 μg/mL thymol,the content ofβ-glucan was increased by 51.5% in the cell-wall extracts by phenol-sulfuric,and soluble protein in cells was decreased by 40% by SDS-PAGE. This indicated that thymol gave rise to the lysis of yeast cell and destroyed the integrity of the cell membrane,the structural of peptidoglycan on the cell wall changed,yeast cell released their contentand and the adsorption capacity of AFB1 increased .The capability of cell-wall extract adsorbing AFB1 was 2.5 μg/mg by thin layer chromatography(TLC)and high performance liquid chromatography(HPLC). And its thymol-loading capacity was 41.5 μg/mg. This study provided new ideas and theoretical basis for the control of aflatoxin contamination in food and feed.

thymol;yeast cell-wall extract;adsorption;aflatoxin B1

2017-01-16

錢潘攀(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：黃曲霉毒素代謝與污染控制，E-mail:qianpp292@163.com。

*通訊作者:胡梁斌(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：食源性病原物控制，E-mail:hulb973@163.com。

國家自然科學基金項目(31671952)；河南省科技攻關計劃項目(152102110086，162102110065)。

TS201.6

A

1002-0306(2017)15-0025-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.006