肝硬化患者血清miR- 122的表達及與Child- Pugh分級的關系

周 鵬

(濟源市人民醫院肝膽外科，河南 濟源 454650)

肝硬化患者血清miR- 122的表達及與Child- Pugh分級的關系

周 鵬

(濟源市人民醫院肝膽外科，河南 濟源 454650)

目的 探討肝硬化患者血清MicroRNA(miR)- 122的表達水平與肝硬化Child- Pugh分級及并發癥的關系。方法 肝硬化患者87例，采用PCR實時熒光定量法測定患者血清miR- 122水平，根據Child- Pugh分級對肝硬化患者進行分級，分析血清miR- 122與肝硬化分級的關系。結果 并發肝硬化腹水、消化道出血、自發性細菌性腹膜炎及失代償期患者血清miR- 122表達水平均高于未發生患者(P<0.05)；不同肝硬化 Child- Pugh分級血清中 miR- 122水平有統計學差異(P<0.05)，A級與B 級肝硬化患者血清miR- 122水平無顯著差異(P>0.05)，A級和B級患者水平均顯著低于C級(P<0.05)。多變量線性相關性顯示，血清miR- 122與丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、γ- 谷氨酰轉移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)呈正相關(P<0.05)；與國際標準化比值(INR)及肌酐(Cr)水平呈負相關(P<0.05)。結論 血清miR- 122 水平上升提示肝硬化已經失代償，并與腹水、消化道出血、肝腎衰竭有關。因此，血清 miR- 122可作為評價肝硬化患者肝臟功能及預后的潛在生物學指標。

肝硬化；miR- 122；Child- Pugh分級

我國慢性肝炎病毒感染是導致原發性肝癌或肝硬化的主要病因。MicroRNA(miR)是內源性非編碼單鏈RNA，能夠選擇性與mRNA結合，抑制mRNA翻譯，并促進其降解，抑制靶基因表達〔1〕。研究發現〔2〕，miR在機體細胞分化、增殖、凋亡及組織器官發育等過程均具有重要的調控作用，其在多種疾病發生過程中均具有一定的作用。由于miRNA結構較小且相對穩定，因此被廣泛應用于疾病分型、診斷、預后及個性化診療〔3〕。目前，miR與肝炎病毒感染后疾病進展的關系尚未完全明確，動物模型顯示〔4〕，感染肝炎病毒后動物體內血清miR的水平會明顯升高。有研究提出miRNA與肝炎病毒復制、肝硬化、慢性肝病及肝癌的發生、發展均具有密切關系〔5〕。本研究旨在探究肝硬化患者血清miR- 122的表達水平與肝硬化分級及并發癥的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年6月至2016年3月濟源市人民醫院收治的87例肝硬化患者。納入標準：①診斷標準結合患者病史、臨床標準、肝活檢及影像學進行綜合診斷確診〔6〕；②行病理學檢查；③研究前1個月均未服用保肝類藥物治療。排除標準：①合并免疫系統疾病、惡性腫瘤等嚴重疾病者；②不配合及中途退出者。其中男66例，女21例；年齡41～74〔平均(56.32±6.93)〕歲。采用Child- Pugh對肝硬化患者進行分級〔7〕，Child- Pugh得分5～6分為A級，7～9分為B級，≥10分為C級；其中A級33例，B級31例，C級23例。

1.2 儀器和試劑 熒光定量ViiATM7、PCR儀與TC- 48/T/H PCR擴增儀均購于Applied Biosustems公司；美國Invitrogen公司提供患者總RNA提取的試劑盒。Taq Man Universal PC Rmastermix，反轉錄試劑盒Taq Manmi RNA，特異探針miR- 122均購于美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 肝腎功能指標檢測 患者于首次入院后第1天在清晨空腹采集靜脈血3 ml，2 h 內分離血清，由本院檢驗中心DXC- 800全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、γ- 谷氨酰轉移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、國際標準化比值(INR)及肌酐(Cr)水平、血清總蛋白(TP)及膽紅素。

1.3.2 血清miRNA提取 87例患者首次入院后第2天采集3 ml清晨空腹靜脈血，于20℃～25℃放置30 min左右，以4 000 r/min離心10 min，吸取上清于EP管保存分裝，最后將分裝后的EP管保存至-20℃的冰箱以備提取。按照MiRcute試劑提取試劑盒說明書提取血清miRNA。測定提取的RNA OD260/280的比值，比值介于1.8～2.0即可進行后續試驗。

1.3.3 逆轉錄反應 (1)逆轉錄反應體系的配制：0.1 μl dNTPmix(100 mmol/L)，3 μl 5×反轉錄酶緩沖液，1.0 μl 50 U/μl MultiScribeTM反轉錄酶，1.8 μl MgCl2及4.1 μl無核酸酶的水。(2)將反應體系混合溶液短暫離心，分裝9 μl/管，再依次加入5 μl RNA模板，3 μl primer，混勻、離心。miR- 122 PCR 正向引物序列為：5′- TGCGGATCAACAGACATTAATT- 3′。(3)設置反應條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。于預先設定好條件的PCR擴增儀上進行擴增。(4)反應完成后將cDNA溶液置于-20℃低溫冰箱中保存，以備用于實時熒光定量PCR。

1.3.4 PCR反應 采用TaqmanHT7900熒光定量PCR儀進行PCR擴增，反應條件為95℃ 10 min；94℃ 10 s，60℃ 1 min，45個循環，反應體系為10 μl反應體系(Master Mix 5 μl，正反向引物各 0.2 μl，cDNA 1 μl，水3.60 μl)，每個樣品進行3個反應。

1.4 統計學方法 應用SPSS20.0軟件進行方差分析、t檢驗及多變量線性相關性分析。

2 結 果

2.1 不同肝硬化并發癥中血清miR- 122的表達水平 并發肝硬化腹水、消化道出血、自發性細菌性腹膜炎及失代償期患者血清miR- 122表達水平(38.1±3.3，37.2±4.5，38.5±4.3，36.2±3.1)均高于未發生患者(25.3±4.3，26.2±3.7，27.4±3.5，25.1±4.3；t=10.041，8.972，9.191，8.183；P=0.001，0.002，0.002，0.003)。

2.2 不同肝硬化分級患者血清miR- 122及肝功能指標比較 不同肝硬化Child- Pugh分級血清中miR- 122水平有統計學差異(P<0.05)，兩兩比較發現A級與B 級肝硬化患者表達無統計學差異(t=1.217；P=0.199)，A級和B級顯著低于C級(t=4.597，P=0.001；t=4.125，P=0.002)；不同肝硬化分級患者ALT、AST、GGT、ALP、INR及Cr水平差異均有統計學意義(P<0.05)，而血清TP及膽紅素無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 不同肝硬化分級患者血清miR- 122及肝功能指標比較

與C級比較：1)P<0.05

2.3 血清miR- 122水平與肝腎功能指標的關系 血清miR- 122表達水平與ALT、AST、GGT、ALP 呈正相關(r=0.514、0.672、0.578、0.711、P<0.05)，與INR及Cr水平呈負相關(r=-0.612、-0.417，P<0.05)，而與TP及膽紅素關系不明顯。

3 討 論

近年來，研究發現miR- 122主要表達于肝臟細胞，參與肝臟細胞的分化生長，對于肝臟發揮正常的生理功能具有重要作用，因此可以作為肝細胞損傷的一個重要潛在生物學指標〔8〕。Child- Pugh分級是評價肝臟分解合成功能的重要評分指標，其通過凝血酶原時間、膽紅素、白蛋白以及肝性腦病和腹水等評價指標全面綜合反映肝臟的整個病變程度，可以作為肝臟預后的綜合評價指標。

本研究結果提示患者血清miR- 122表達上升可能與并發肝硬化腹水、消化道出血、自發性細菌性腹膜炎有關，或正處于失代償期，其原因可能與患者發生腹水導致血清 miR- 122進入其他淋巴通道等第三間隙增多引起〔9〕。因此，對于肝硬化合并并發癥患者的評價來講，高表達的血清miR- 122表明預后恢復情況可能會越差。本研究結果提示血清中 miR- 122 的水平可作為肝硬化患者的預后評價指標，另外Child- Pugh分級對于肝臟功能評價具有重要意義。在肝硬化患者中，血清中 miR- 122水平與各種轉氨酶的水平均呈正相關，這表明肝臟細胞的損傷及壞死伴隨著血清中 miR- 122的水平增高，這可能由于壞死的肝細胞釋放部分miR- 122，同時由于細胞壞死導致肝細胞不能正常降解miR- 122〔10〕。肝硬化患者中血清 miR- 122 水平和INR呈現負相關關系也說明了這一點。上述證據均顯示血清miR- 122水平可反映肝功能的損傷程度。本研究中低水平的血清miR- 122提示存在更高水平的Cr，表明腎功能的損害以及肝細胞增生能力的降低，這可能由于肝衰竭同時合并腎衰竭導致整個循環紊亂〔11〕。同時研究發現腎衰竭時部分miR的表達降低。此外，在本研究中血清miR- 122與其他代表腎功能損害的膽紅素以及血紅蛋白等并不相關，這可能由于肝硬化病人的腸道營養、藥物運用導致這些指標水平的相應變化導致。血清miR- 122 水平上升提示肝硬化已經失代償，并與腹水、消化道出血、肝腎衰竭有關。因此，血清 miR- 122可作為評價肝硬化患者肝臟功能及預后的潛在生物學指標。

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〔2017- 02- 18修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

周 鵬(1982- )，男，主治醫師，主要從事肝膽外科研究。

R657.3+1

A

1005- 9202(2017)15- 3802- 02；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.071