HIF- 1α、CXCR4及VEGF在子宮內膜癌組織中的表達及意義

李海萍

(青海大學附屬醫(yī)院腫瘤婦科，青海 西寧 810001)

HIF- 1α、CXCR4及VEGF在子宮內膜癌組織中的表達及意義

李海萍

(青海大學附屬醫(yī)院腫瘤婦科，青海 西寧 810001)

目的 探究缺氧誘導因子(HIF)- 1α及其下游基因趨化因子受體(CXCR)4、血管內皮生長因子(VEGF)在子宮內膜癌組織與正常子宮內膜組織中的表達及其意義。方法 用逆轉錄- 聚合酶鏈反應(RT- PCR)及免疫組織化學技術檢測94例子宮內膜癌組織和30例正常子宮內膜組織中HIF- 1α、CXCR4、VEGF mRNA及蛋白的表達情況，并分析其與子宮內膜癌臨床病理特征的關系。結果 HIF- 1α、CXCR4、VEGF mRNA及蛋白在子宮內膜癌組織中存在高表達，而在正常子宮內膜組織中幾乎無表達。HIF- 1α、CXCR4蛋白表達在正常子宮內膜組織中的表達與子宮內膜癌組織比較差異有統計學意義(P<0.05)。HIF- 1α和CXCR4蛋白的表達水平與子宮內膜癌的脈管浸潤、臨床分期及患者術后生存時間相關。結論 HIF- 1α、CXCR4及VEGF在子宮內膜癌組織中表達水平增高,提示HIF- 1α可能通過調控CXCR4及VEGF蛋白的轉錄,進而促進腫瘤組織新生血管生成而促進子宮內膜癌的發(fā)展。

子宮內膜癌；缺氧誘導因子- 1α；超化因子受體- 4；血管內皮生長因子

子宮內膜癌是女性生殖系統最常發(fā)生的惡性腫瘤之一〔1〕。子宮內膜癌的轉移和侵襲能力是臨床分期的重要依據，與患者的預后情況密切相關〔2〕。子宮內膜癌屬于實體腫瘤，其發(fā)生及轉移過程中有兩個不可或缺的特點，一是腫瘤細胞對低氧條件具有的耐受性，另一個是腫瘤組織內新生血管的再生〔3〕。缺氧誘導因子(HIF)- 1α是哺乳動物在低氧狀態(tài)下存在于體內的一種異源二聚體轉錄因子，該因子可與缺氧反應元件的結合形成轉錄起始復合物，并啟動其調控基因如血管內皮生長因子(VEGF)和趨化因子受體(CXCR)4的轉錄，使得VEGF、CXCR4等受其調控的基因表達水平升高，從而參與組織新生血管生成、細胞無氧代謝和遷移等活動〔4〕。有報道指出，食管鱗狀細胞癌、結腸癌、口腔鱗癌、腎透明細胞癌、乳腺癌、惡性膠質瘤中同時存在HIF- 1α及CXCR4高表達〔5〕，而在子宮內膜癌惡性轉變過程中HIF- 1α及其下游靶基因的作用尚未明確。本研究通過采用逆轉錄- 聚合酶鏈反應(RT- PCR)和免疫組織化學技術分別測量HIF- 1α、CXCR4及VEGF在子宮內膜癌和正常子宮內膜組織中RNA和蛋白質的表達情況，并結合患者臨床病理參數及預后進行分析。

1 資料及方法

1.1 臨床資料 參照第8版《婦產科學》子宮內膜癌診斷標準，選擇2010年1月至2014年4月于青海大學附屬醫(yī)院婦科手術切除子宮內膜癌組織94例及同期因子宮肌瘤手術切取的正常子宮內膜組織36例(經組織病理檢查證實)。納入標準：病理診斷證實、隨訪資料完整、術前未行放化療。其中子宮內膜癌組織患者年齡30～72〔平均(58.6±4.9)〕歲，正常子宮內膜組織患者年齡36～70〔平均(51.7±3.4)〕歲。

1.2 方法

1.2.1 mRNA的檢測 石蠟標本總RNA使用Relia- PrepTM FFPE Miniprep Systems 試劑盒進行抽提。cDNA使用M- MLV逆轉錄酶合成。建立25 μl PCR反應體系，包含1 μl上游引物(10 pmol/μl)、2 μl cDNA模板、1 μl下游引物(10 pmol/μl)、8.5 μl去離子水和12.5 μl PCR Master Mix(2倍)，引物設計由廣州伯信生物科技有限公司完成，HIF- 1α上游引物:5′- CTACTTGCCATCCTTCA- 3′，下游引物:5′- GTGGTTTTGTGGCTCTTGGTA- 3′;CXCR4上游引物:5′- TTTTGTCACCAGTTCTCTTGGA- 3′,下游引物:5′- AGCCATTATTACACACGTTCC- 3′;VEGF：上游引物:5′- TTCACTATCACAGGAGGACAC- 3′,下游引物:5′- TCCACTGAGAGGGATGAGAACT- 3′。PCR反應條件及時間：采用ABI 2720型PCR儀，先經過10 min 95℃預變性及1 min 95℃變性處理，而后在退火溫度下退火1 min，再在72℃下延伸1 min，經過40個循環(huán)，最后在72℃下延伸10 min。

電泳方法(產物的定量測定)：將產物置于20 g/L的瓊脂糖(含50 g/L溴乙啶)中，電泳后對電泳帶進行密度掃描，記錄灰度值進行分析統計。

1.2.2 蛋白的檢測 采用購自美國Abcam公司的兔抗人HIF- 1α抗體(1∶500)、兔抗人VEGF抗體(即用型)及兔抗人CXCR4抗體(1∶250)檢測HIF- 1α、VEGF及CXCR4蛋白。抗兔抗鼠抗體(即用型)及顯色系統采用Dako 公司EnVisionTM +System 試劑盒。嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行實驗步驟，陰性對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替3種一抗，抗體有效性驗證參照已知的陽性組織進行。

閱片采用雙盲法。細胞質和細胞核均著色為HIF- 1α蛋白陽性的表達結果；細胞質著色為VEGF及CXCR4蛋白陽性的表達結果。觀察并將定位明確、背景清晰、有棕黃色顆粒狀染色的細胞設定為陽性。陽性細胞比例<10%組織面積為陰性(-)，10%～25%為弱陽性(+)，26%～50%為中度陽性()，>50%為強陽性()。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行秩和檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1 mRNA的表達 以GAPDH為內參照。HIF- 1α、VEGF及CXCR4 mRNA在子宮內膜癌組織中的表達率分別為82例(87.2%)、65例(69.1%)和73例(77.7%)，而在正常子宮內膜組織中分別為22例(73.3%)、5例(16.7%)、3例(10.0%)。電泳條帶顯示，VEGF、CXCR4 mRNA在子宮內膜癌組織中的表達水平顯著高于正常子宮內膜組織。見圖1。

圖1 HIF- 1α、VEGF及CXCR4 mRNA在不同組織中的表達

2.2 蛋白的表達 子宮內膜癌組織細胞的細胞質和細胞膜為VEGF及CXCR4蛋白的主要表達部位，正常子宮內膜組織中HIF- 1α、VEGF及CXCR4 蛋白幾乎不表達，見圖2。子宮內膜癌組織中HIF- 1α、VEGF及CXCR4 蛋白均有高表達，其中HIF- 1α及CXCR4 蛋白的陽性表達率與正常子宮內膜組織相比明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.3 臨床病理參數及預后與蛋白表達的關系 患者腫瘤的分化程度、組織學類型、年齡等參數與HIF- 1α和CXCR4蛋白的表達水平無明顯關系(P>0.05)，但與子宮內膜癌的脈管浸潤、臨床分期明顯相關(P<0.05)。見表2。

圖2 不同子宮內膜組織中HIF- 1α的表達(×200)

組織學類型nHIF-1α-+VEGF-+CXCR4-+子宮內膜癌9414(14.9)23(24.5)34(36.2)23(24.5)22(23.4)16(17.0)31(33.0)25(26.6)27(28.7)22(23.4)22(23.4)23(24.5)正常子宮內膜3027(90.0)2(6.7)1(3.3)0(0.0)12(40.0)10(33.3)5(16.7)3(10.0)25(83.3)2(6.7)2(6.7)1(3.3)Uc/P值6.760/0.0002.810/0.0054.868/0.000

表2 臨床病理參數與HIF- 1α、CXCR4、VEGF表達率的關系(n)

與Ⅲ～Ⅳ期比較：1)P<0.05；與有脈管浸潤比較：2)P<0.05

3 討 論

近年來，女性健康意識的提高以及宮腔鏡等技術的逐漸普及使早期子宮內膜癌及癌前病變得以及時發(fā)現并積極采取治療，有研究指出，早期子宮內膜癌患者5年總生存率為98%，5年無病生存率可達93%〔6〕。對于中晚期子宮內膜癌，尤其伴有淋巴結或遠處轉移者，其預后較差，盡管積極采取各種治療手段包括手術治療、放化療等，其治療效果仍不理想。

研究發(fā)現，HIF- 1α可通過啟動其調控基因如VEGF和CXCR4的轉錄,進而參與組織新生血管生成、細胞無氧代謝和細胞增殖遷移分化等多種病理生理過程〔6～9〕。HIF- 1α在缺氧狀態(tài)下通過增強VEGF mRNA的轉錄活性及穩(wěn)定性，參與腫瘤組織血管的構建〔10〕，隨著研究的深入，HIF- 1α及其下游基因CXCR4、VEGF在腫瘤發(fā)展及惡化過程中的作用越來受到關注。 Fu等〔11〕發(fā)現了腫瘤內微血管密度與HIF- 1α表達水平呈正相關，提示腫瘤生長過程中血管的形成與HIF- 1α有密切關系。邵薇薇〔12〕研究發(fā)現相比于正常宮頸組織，宮頸癌組織中CXCR4蛋白的表達水平明顯升高，提示CXCR4蛋白的表達水平與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展有著密切關系。另外，食管鱗狀細胞癌、結腸癌、口腔鱗癌、腎透明細胞癌、乳腺癌、惡性膠質瘤中存在HIF- 1α及CXCR4高表達也同樣得到證實。

本研究結果提示缺氧可導致組織細胞中HIF- 1α表達水平升高，繼而通過調控VEGF及CXCR4等基因的轉錄參與子宮內膜癌組織血管的生成、癌細胞的無氧代謝及遷移等過程，參與子宮內膜癌的發(fā)生、惡化和轉移。通過利用調控組織細胞缺氧條件選擇性抑制子宮內膜癌的發(fā)展和轉移是一個新的研究方向，降低HIF- 1α表達水平可以作為治療子宮內膜癌的方法之一。

1 周儉珊,葉 紅.HIF- 1α、VEGF及HIF- 1α/VEGF軸在子宮內膜癌中的表達研究進展〔J〕.海南醫(yī)學,2015;26(16):2413- 6.

2 石 婷,孫立新.宮頸腺癌早期診斷及預后研究進展〔J〕.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2015;9(10):154- 8.

3 Yoshida T,Hashimura M,Mastumoto T,etal.Transcriptional upregulation of HIF- 1α by NF- κB/p65 and its associations with β- catenin/p300 complexes in endometrial carcinoma cells〔J〕.Lab Invest,2013;93(11):1184- 93.

4 Feng Z,Gan H,Cai Z,etal.Aberrant expression of hypoxia- inducible factor 1α,TWIST and E- cadherin is associated with aggressive tumor phenotypes in endometrioid endometrial carcinoma〔J〕.Jpn J Clin Oncol,2013;43(4):396- 403.

5 廖 蕓.缺氧誘導因子- 1α在子宮內膜癌中的研究進展〔J〕.現代婦產科進展,2014;23(2):141- 3.

6 劉 驥,黃明莉,王寶菊,等.子宮內膜癌血管生成相關因子的研究進展〔J〕.現代生物醫(yī)學進展,2014;14(9):1790- 2.

7 Saarelainen SK,Staff S,Peltonen N,etal.Endoglin,VEGF,and its receptors in predicting metastases in endometrial carcinoma〔J〕.Tumour Biol,2014;35(5):4651- 7.

8 Coenegrachts L,Schrauwen S,van Bree R,etal.Increased expression of placental growth factor in high- grade endometrial carcinoma〔J〕.Oncol Rep,2013;29(2):413- 8.

9 魏文婷,李 冰,賈曄然,等.慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中缺氧誘導因子1α的表達變化〔J〕.中國病理生理雜志,2013;29(9):1700- 3.

10 Maschio LB,Madallozo BB,Capellasso BA,etal.Immunohistochemical investigation of the angiogenic proteins VEGF,HIF- 1α and CD34 in invasive ductal carcinoma of the breast〔J〕.Acta Histochem,2014;116(1):148- 57.

11 Fu S,Bai R,Zhao Z,etal.Overexpression of hypoxia- inducible factor- 1α and vascular endothelial growth factor in sacral giant cell tumors and the correlation with tumor microvessel density〔J〕.Exp Ther Med,2014;8(5):1453- 8.

12 邵薇薇.CXCR4和CCR7趨化因子受體在宮頸癌中的表達〔J〕.中國婦幼保健,2012;27(5):728- 31.

〔2017- 04- 11修回〕

(編輯 袁左鳴)

李海萍(1972- )，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤研究。

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A

1005- 9202(2017)15- 3782- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.062