老年宮頸癌組織中人類白細胞抗原- E蛋白的表達及與臨床病理特征的關系

江恩利 譚寒星 冉光偉 方 堃 付俊生

(貴州省人民醫(yī)院婦科，貴州 貴陽 550001)

老年宮頸癌組織中人類白細胞抗原- E蛋白的表達及與臨床病理特征的關系

江恩利 譚寒星 冉光偉 方 堃 付俊生

(貴州省人民醫(yī)院婦科，貴州 貴陽 550001)

目的 探討人類白細胞抗原(HLA)- E在老年宮頸癌組織的表達及與臨床病理的關系。方法 選取2014年1月至2016年6月國際婦產(chǎn)科協(xié)會(FIGO)分期為Ⅰ～Ⅱ期的原發(fā)性老年子宮頸癌組織標本92例，其中子宮頸鱗癌60例，宮頸腺癌32例。使用免疫組化方法檢測標本癌組織和癌旁組織中HLA- E的表達，并用平均光密度值(IOD)表示其在不同組織中的相對表達強度。分析HLA- E表達與臨床病理特征的關系。結果 HLA- E在宮頸鱗癌和宮頸腺癌中的表達明顯高于正常組織(P<0.01)，而宮頸鱗癌和宮頸腺癌中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。進一步分析顯示，宮頸鱗癌組織HLA- E的表達與FIGO分期及腫瘤直徑有關系(P<0.05)，宮頸腺癌組織HLA- E的表達與患者的FIGO分期及浸潤深度有關系(P<0.05)。結論 HLA- E在老年宮頸癌組織中高度表達，與患者FIGO分期的進展、腫瘤直徑和浸潤深度密切相關，提示可以作為臨床上診斷宮頸癌的標志物之一，同時為臨床上治療提供新的思路。

人類白細胞抗原- E；宮頸鱗癌；宮頸腺癌

根據(jù)組織病理類型，宮頸癌可分為宮頸鱗癌、宮頸腺癌、宮頸腺鱗癌；其中，宮頸鱗癌發(fā)病率最高，其次是宮頸腺癌和宮頸腺鱗癌〔1，2〕。目前，宮頸腺癌和宮頸腺鱗癌的發(fā)病率并未下降，反而升高〔3〕。在宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展過程中，人類白細胞抗原(HLA)發(fā)揮著重要作用，而HLA- E作為一種非經(jīng)典型主要組織相容性復合體I類分子(MHC- 1)，與經(jīng)典的HLA- (A,- B,- C)相比，HLA- E具有非多態(tài)性且在正常組織的細胞膜上很少表達，而在黑色素瘤、淋巴瘤及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤細胞表面則呈高表達狀態(tài)，通過與細胞個體活性及其表面受體(CD94/NKG2A)結合而抑制自然殺傷(NK)細胞和細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)的活性，從而使其逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊〔4〕。HLA- E在正常宮頸上皮中的表達較弱，而當正常宮頸組織感染病毒、轉(zhuǎn)化為癌前病變(CIN Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ級)和宮頸癌的過程中，HLA- E的表達逐漸增強〔4〕。本實驗研究HLA- E在老年宮頸腺癌和鱗癌組織表達的差異，并進一步分析其與兩者臨床與病理表現(xiàn)之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2016年6月因?qū)m頸癌于貴州省人民醫(yī)院行全子宮切除或廣泛全子宮切除+盆腔淋巴結清掃術的92例老年患者的癌組織和癌旁組織，其中子宮頸鱗癌組織60例，宮頸腺癌組織32例。納入標準：符合國際婦產(chǎn)科協(xié)會(FIGO)分期〔5〕為Ⅰ～Ⅱa期的患者；年齡≥60歲；術前未進行過放化療的患者；上述組織標本均能查閱到其所對應的患者的病例資料。排除標準：合并患有心、肝、腎以及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；合并其他較為嚴重的婦科疾病者。年齡60～79〔平均(66.14±3.29)〕歲。研究過程均取得患者及其家屬的同意，并符合醫(yī)學倫理委員會的相關規(guī)定。依據(jù)上述組織標本所對應的住院號，查閱相應患者相關的臨床病理資料，包括患者年齡、病理診斷、浸潤深度、腫瘤大小、FIGO分期等。

1.2 主要試劑和儀器 一抗鼠抗人HLA- E單克隆抗體由美國Abcam公司提供，山羊抗鼠二抗試劑盒和檸檬酸緩沖液(pH=6.0)由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，其他的試驗材料由本院藥理實驗室提供。石蠟切片機和Leica DM4000B顯微鏡由德國Leica公司提供；烤片機由湖北諾普電子科技有限責任公司提供。

1.3 標本采集與處理 選取上述研究病例的宮頸組織標本，使用中性甲醛和10%酒精固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋。將每個組織標本制作6張連續(xù)切片，將上述石蠟切片依次進行脫蠟和水化處理后，使用高壓鍋進行抗原修復；檸檬酸鹽緩沖液中冷卻2 h，依次用蒸餾水洗兩遍，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗一遍。使用含1%胎牛血清的PBS稀釋的一抗(1∶50)對切片先在室溫下孵育60 min，后于4℃冰箱繼續(xù)過夜孵育。(鼠抗人HLA- E抗體由EXBIO公司提供，產(chǎn)品克隆號為MEM- E/02，規(guī)格為0.1 mg)。次日，將上述過夜孵育的切片用PBS洗滌5 min×3次，于室溫下用辣根過氧化物酶標記的抗小鼠二抗孵育30 min。使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進行顯色，10 min后使用去離子水沖洗以終止反應，再用蘇木素復染后封片觀察。每組切片制作和觀察過程中均使用PBS緩沖液代替一抗設立3個陰性對照，并將各切片中的血管內(nèi)皮細胞設立為陽性對照。

1.4 結果判定標準 陽性反應：若陰性對照無特異性著色，而被檢測標本細胞膜和細胞質(zhì)出現(xiàn)棕色顆粒狀物則為HLA- E蛋白表達陽性。使用顯微鏡對上述切片在隨機選擇的6個高倍鏡視野下進行觀察并記錄染色結果，使用軟件Image- Pro Plus 5.0測定每個視野下的累積光密度值(IOD)，將每個切片在6個視野下測定的平均IOD值(IOD/area)作為該切片HLA- E蛋白的相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 HLA- E表達水平的比較 免疫組織化學檢測結果顯示，免疫染色主要集中在宮頸腺癌和鱗癌細胞、淋巴細胞以及血管內(nèi)皮細胞的細胞質(zhì)及細胞膜中，在細胞核內(nèi)的表達則幾乎未見。而正常鱗狀上皮和柱狀上皮染色很淺，間質(zhì)及肌層內(nèi)幾乎未染色。HLA- E在宮頸鱗癌中的表達主要出現(xiàn)在癌細胞和血管內(nèi)皮細胞的胞膜和胞質(zhì)中；HLA- E在宮頸腺癌組織中的表達同樣主要集中于癌細胞的胞膜和胞質(zhì)，且表達強度較鱗癌組織更強；HLA- E在正常宮頸組織中的表達較弱。宮頸鱗癌、宮頸腺癌、癌旁組織的平均IOD值分別為(0.111±0.012)、(0.115±0.023)和(0.023±0.061)，宮頸鱗癌、宮頸腺癌分別與癌旁組織比較差異均有統(tǒng)計學意義(t=1.843，6.532，P<0.01)；宮頸鱗癌與宮頸腺癌比較差異有統(tǒng)計學意義(t=0.354，P>0.05)。見圖1。

2.2 HLA- E的表達與患者臨床病理資料的關系 見表1。

圖1 HLA- E在宮頸鱗癌、腺癌及正常宮頸組織中的表達(DAB，×200)

病理特征n宮頸鱗癌(n=60)t值P值n宮頸腺癌(n=32)t值P值分化程度中高分化350.121±0.012-1.9810.052180.118±0.026-0.6800.501低分化250.109±0.033140.112±0.023FIGO分期Ⅰ期330.097±0.0216.7010.000170.123±0.033-2.2160.034Ⅱ期270.132±0.019150.102±0.027腫瘤直徑(cm)≥4230.146±0.039-9.8820.000200.114±0.0670.0710.944<4370.079±0.011120.116±0.091浸潤深度(mm)≤15310.110±0.0280.3810.705180.120±0.026-2.4960.018>15290.113±0.033140.101±0.013淋巴轉(zhuǎn)移是240.109±0.0190.2520.802120.116±0.052-0.1240.902否360.112±0.056200.114±0.039

頸鱗癌組織HLA- E的表達與患者的FIGO分期及腫瘤直徑有關系(P<0.05)，而其他因素之間無顯著差異(P>0.05)；宮頸腺癌組織HLA- E的表達與患者的FIGO分期及浸潤深度有關系(P<0.05)，而除此之外的其他因素之間無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

宮頸癌威脅全球女性惡性腫瘤患者的生命安全，并且該病全球每年約有52萬新增病例，每年死于該病的人數(shù)約27萬〔5〕。其中，每年約有30%的新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生于我國。與宮頸鱗癌相比，宮頸腺癌和宮頸腺鱗癌的預后更差，存活率更低，而復發(fā)率則更高，對相似的治療方法的療效也不一致〔6〕，因此尋求有效的治療和診斷方案勢在必行。HLA- E在病毒感染、器官移植、腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及自身免疫性疾病中均發(fā)揮著重要的作用〔7〕。首次對于HLA- E功能較大規(guī)模的研究集中在妊娠過程中母胎交互作用，該研究顯示，HLA- E能在胎盤組織中表達，并能使母體的免疫系統(tǒng)接納胎兒，否則胎兒將會被視為異物而被排斥，從而在妊娠過程中發(fā)揮著重大的作用〔8〕。在生理情況下，HLA- E與抑制型受體CD94/NKG2A的親和力較其與激活型受體CD94/NKG2C之間的親和力明顯增加，從而有助于使靶細胞免除NK細胞的殺傷作用〔9〕。而HLA- E在非正常組織的細胞膜表面表達并被CTLs和NKs識別后，可引起細胞活性激活或抑制，至于會引起何種反應，則取決于與之結合的受體的具體類型〔10〕，比如，與CD94/NKG2A受體結合會引起細胞活性抑制反應，而與CD94/NKG2C受體結合則會引起細胞激活反應，因此推斷宮頸癌中HLA- E蛋白的表達與臨床病理特征存在密切聯(lián)系〔11〕。

研究結果顯示，HLA- E蛋白在宮頸鱗癌和宮頸腺癌組織中高度表達，明顯高于癌旁正常組織，提示HLA- E蛋白參與了宮頸癌的發(fā)生于發(fā)展階段，HLA- E的作用機制可能是通過啟動CD8+T細胞下游信號來抑制相應的免疫細胞的活化，腫瘤細胞躲避免疫系統(tǒng)的攻擊〔12〕。另外，在對HLA- E蛋白與臨床病理資料之間的聯(lián)系研究時發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中HLA- E的表達水平隨著患者的FIGO分期的發(fā)展而升高，同時隨著腫瘤直徑和浸潤深度的增加，HLA- E的表達水平升高，說明HLA- E的表達水平可以在一定程度上反映宮頸癌患者病情的發(fā)展狀態(tài)，用于臨床上監(jiān)測宮頸癌的標志物。推測HLA- E在不同的臨床參數(shù)之間出現(xiàn)的差異原因可能是不同的HLA- E單克隆抗體，檢測的敏感性和特異性不同，或者是由于樣本量有限，導致其出現(xiàn)差異，此外，還可能是由于不同類型腫瘤的生物學行為不同〔13〕。

本研究結果提示，HLA- E在老年宮頸癌組織中高度表達，尤其是宮頸腺癌組織中，并且與宮頸癌的FIGO分期、腫瘤直徑和浸潤深度之間存在密切聯(lián)系，提示其可以作為臨床上診斷宮頸癌的標志物之一。

1 劉伏香,譚志琴,龍 丹,等.青年婦女患宮頸癌的臨床特點及預后分析〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2014;14(9):1676- 9.

2 Rossi P,Borghi L,Ferro R,etal.A population of 1136 HPV DNA- HR positive women:expression of p16(INK4a)/Ki67 dual- stain cytology and cytological diagnosis.Histological correlations and cytological follow up〔J〕.Pathologica,2015;107(3- 4):185- 91.

3 Galic V,Herzog TJ,Lewin SN,etal.Prognostic significance of adenocarcinoma histology in women with cervical cancer〔J〕.Gynecol Oncol,2012;125(2):287- 91.

4 Rizzo R,Gentili V,Rotola A,etal.Implication of HLA- C and KIR alleles in human papillomavirus infection and associated cervical lesions〔J〕.Viral Immunol,2014;27(9):468- 70.

5 Koh WJ,Greer BE,Aburustum NR,etal.Cervical cancer,version 2.2015〔J〕.J Natl Compr Cancer Netw,2015;13(4):395- 404.

6 Haie- Meder C,Morice P,Castiglione M,etal.Cervical cancer:ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis,treatment and follow- up〔J〕.Ann Oncol,2012;21(5):37- 40.

7 Samuels S,Spaans VM,Osse M,etal.Human leukocyte antigen- DR expression is significantly related to an increased disease- free and disease- specific survival in patients with cervical adenocarcinoma〔J〕.Int J Gynecol Cancer,2016;26(8):1503- 9.

8 Iwaszko M,Bogunia- Kubik K.Clinical Significance of the HLA- E and CD94/NKG2 Interaction〔J〕.Arch Immunol Ther Exp(Warsz),2011;59(5):353- 67.

9 Talebian Yazdi M,van Riet S,van Schadewijk A,etal.The positive prognostic effect of stromal CD8+ tumor- infiltrating T cells is restrained by the expression of HLA- E in non- small cell lung carcinoma〔J〕.Oncotarget,2015;7(3):3477- 88.

10 Ishibashi K,Kumai T,Ohkuri T,etal.Epigenetic modification augments the immunogenicity of human leukocyte antigen G serving as a tumor antigen for T cell- based immunotherapy〔J〕.Oncoimmunology,2016;5(6):e1169356.

11 Zeestraten EC,Reimers MS,Saadatmand S,etal.Combined analysis of HLA class I,HLA- E and HLA- G predicts prognosis in colon cancer patients〔J〕.Br J Cancer,2014;110(2):459- 68.

12 Matsumoto K,Maeda H,Oki A,etal.Human leukocyte antigen class Ⅱ DRB1*1302 allele protects against cervical cancer:at which step of multistage carcinogenesis〔J〕?Cancer Sci,2015;106(10):1448- 54.

13 Nilsson LL,Djurisic S,Andersen AM,etal.Distribution of HLA- G extended haplotypes and one HLA- E polymorphism in a large- scale study of mother- child dyads with and without severe preeclampsia and eclampsia〔J〕.HLA,2016;88(4):172- 86.

〔2017- 04- 09修回〕

(編輯 袁左鳴)

付俊生(1966- )，男，主任醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤研究。

江恩利(1980- )，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3779- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.061