外源性骨形態發生蛋白9轉入肺鱗癌細胞對其活性的影響及作用機制

崔 丹

(白城醫學高等專科學校，吉林 白城 137000)

外源性骨形態發生蛋白9轉入肺鱗癌細胞對其活性的影響及作用機制

崔 丹

(白城醫學高等專科學校，吉林 白城 137000)

目的 觀察骨形態發生蛋白(BMP)9對人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90遷移和侵襲能力的影響及其作用機制。方法 RT- PCR和Western印跡法檢測YTMLC- 90細胞和正常人支氣管上皮細胞(NHBE)中BMP9 mRNA和蛋白表達水平；以轉染重組腺病毒Ad- BMP9的YTMLC- 90細胞為研究組，轉染Ad- GFP為陰性對照組，未轉染為空白對照組；采用劃痕愈合實驗檢測3組細胞遷移能力，Transwell實驗檢測遷移和侵襲能力，同時檢測遷移相關因子基質金屬蛋白酶(MMP)2 mRNA和蛋白表達情況；Western印跡法檢測3組細胞BMP- Smad信號通路中Smad 1/5磷酸化水平。結果 YTMLC- 90細胞中BMP9 mRNA和蛋白表達量均明顯低于NHBE細胞(P<0.05)。Ad- BMP9轉染YTMLC- 90細胞后胞內BMP9蛋白表達量明顯高于陰性對照組(P<0.01)。空白對照組48 h的細胞劃痕愈合率與陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；研究組細胞劃痕愈合率明顯低于陰性對照組和空白對照組，穿過小室膜和基質膠的YTMLC- 90細胞數均明顯少于陰性對照組和空白對照組，MMP2表達量明顯低于陰性對照組，MMP2 mRNA和蛋白表達量均明顯低于陰性對照組(均P<0.05)。YTMLC- 90細胞高表達BMP9后其p- Smad 1/5表達量明顯高于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)。結論 外源性BMP9轉入人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90可有效抑制其遷移和侵襲能力，激活BMP- Smad信號通路是該抑制作用的機制之一。

骨形態發性蛋白；肺鱗癌細胞；BMP- Smad通路

肺癌多發于中老年人，其中非小細胞肺癌(包括肺鱗癌、腺癌)約占肺癌總數的80%〔1〕。我國近5年肺鱗癌發病率成倍增長，而轉移和侵襲是導致非小細胞肺癌患者不良預后和死亡的主要原因〔2〕。骨形態發生蛋白(BMP)對體內組織臟器間平衡狀態的維持具有重要的生物學作用，關于BMPs家族與腫瘤發生關系的研究近年來逐漸增多，其中以BMP2～7 最常見〔3〕。BMP9發現較晚且研究較少，其在肺癌中的調控作用還鮮有研究報道。本研究使用重組腺病毒Ad- BMP9轉染過表達的BMP9，分析BMP9對人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90遷移和侵襲能力的影響及其生物學機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90、人胚腎細胞株 ATCC、正常人支氣管上皮細胞(NHBE)、重組腺病毒均購于通派(上海)生物科技有限公司；DMEM培養基、RPMI- 1640培養基、胎牛血清購于上海碧云天生物技術有限公司；Trizol、逆轉錄試劑盒購于美國Invitrogen公司；Transwell小室購于北京樂博生物科技有限公司；抗BMP9抗體、抗基質金屬蛋白酶(MMP)2抗體購于上海恒斐生物科技有限公司；抗Smad1/5/8抗體、抗p- Smad1/5抗體購于上海遠慕生物科技有限公司；羊抗兔IgG/HRP標記的二抗、羊抗鼠IgG/HRP標記的二抗購于北京基尼亞生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及病毒感染 將重組腺病毒(Ad- GFP、Ad- BMP9)分別接種于人胚腎細胞株 ATCC，用含10%胎牛血清的DMEM培養基常規培養。用含10%胎牛血清的RPMI- 1640培養基常規培養人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90，用擴增的腺病毒感染YTMLC- 90細胞，置于CO2細胞培養箱中孵育，其中轉染Ad- BMP9的為研究組，轉染Ad- GFP的為陰性對照組，未轉染重組腺病毒的為空白對照組。

1.2.2 劃痕愈合實驗 以5×105/孔的密度將YTMLC- 90細胞接種于6孔板，當細胞愈合率≥80%時，加入凝聚胺和重組腺病毒，4 h后用無菌牙簽在細胞愈合表面輕劃一條直線劃痕，磷酸 鹽緩沖液(PBS)洗凈后加入空白RPMI- 1640培養基，顯微鏡下觀察和拍照，記為0 h；在CO2細胞培養箱中繼續孵育48 h后在觀察劃痕處細胞愈合情況并拍照，計算每組細胞的劃痕愈合率。

1.2.3 Transwell細胞遷移和侵襲實驗 將腺病毒感染48 h的YTMLC- 90細胞用無血清培養基重懸，在上室(基質膠與無血清的RPMI- 1640培養基按1∶3比例，鋪100 μl)中加入200 μl含5×108個細胞的懸液，在下室中加入500 μl含10%胎牛血清的RPMI- 1640培養基，孵育24 h后用無菌棉簽擦去上室中的基質膠和殘余細胞，結晶紫染色后在光學顯微鏡下選取5個視野計數并拍照。

1.2.4 RT- PCR檢測 取腺病毒感染48 h的YTMLC- 90細胞和未感染的細胞，用Trizol試劑盒提取每組細胞總RNA，兩步法逆轉錄得到cDNA并進行PCR擴增，反應體系為20 μl，引物由上海卓康生物科技有限公司合成。常規反應條件下進行40個循環。用Quantity one軟件檢測結果的灰度值，計算BMP9、MMP2、Noggin的相對表達量。

1.2.5 Western印跡檢測 取腺病毒感染48 h的YTMLC- 90細胞并提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取100 μg蛋白樣本用SDS- 聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白、濕法轉膜，BSA封閉后加一抗(稀釋比例為BMP9：1/500，Smad1/5/8：1/1 000，p- Smad1/5∶1/1 000)，4℃孵育過夜，洗膜后加二抗(1/5 000)，37℃孵育60 min后ECL顯影，用Quantity one軟件檢測電泳條帶的灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 BMP9在人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90和NHBE中的表達 人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90中BMP9 mRNA表達量(0.51±0.19)明顯低于NHBE(0.69±0.05)(P<0.05)；肺鱗癌細胞株YTMLC- 90中BMP9 蛋白表達量(1.38±0.20)明顯低于NHBE(2.06±0.31)(P<0.05)。見圖1。

圖1 YTMLC- 90和NHBE中BMP9 蛋白表達

2.2 重組腺病毒轉染YTMLC- 90細胞對BMP9表達的影響 分別用重組腺病毒Ad- GFP、Ad- BMP9轉染YTMLC- 90細胞，常規培養48 h后感染率≥80%。Ad- BMP9轉染YTMLC- 90細胞后，胞內BMP9蛋白表達量(5.91±1.30)明顯高于陰性對照組(2.05±0.61，P<0.01)，提示BMP9在YTMLC- 90細胞中成功高表達。

2.3 高表達BMP9對YTMLC- 90細胞活性和MMP2表達水平的影響 空白對照組48 h的細胞劃痕愈合率為(65.19±5.56)%，與陰性對照組〔(60.12±4.47)%〕比較差異無統計學意義(P>0.05)；研究組細胞劃痕愈合率〔(24.38±3.51)%〕明顯低于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)，見圖2。研究組穿過小室膜的YTMLC- 90細胞數明顯少于陰性對照組和空白對照組，穿過基質膠的YTMLC- 90細胞數明顯少于陰性對照組和空白對照組，見圖3、圖4。研究組MMP2 mRNA表達量(0.48±0.13)明顯低于陰性對照組(0.65±0.18)(P<0.05)，MMP2蛋白表達量(0.63±0.11)明顯低于陰性對照組(0.85±0.21，P<0.05)。

2.4 高表達BMP9對YTMLC- 90細胞中BMP- Smad信號通路的影響 YTMLC- 90細胞高表達BMP9后，p- Smad 1/5的表達量(0.96±0.14)明顯高于陰性對照組(0.44±0.03)和空白對照組(0.41±0.08，P<0.01)。見圖5。

圖2 3組細胞劃痕愈合實驗結果(×100)

圖3 Transwell實驗穿過小室膜的細胞數量(×100)

圖4 Transwell侵襲實驗穿過基質膠的細胞數量(×100)

圖5 各組p- Smad1/5的表達情況

3 討 論

相關研究發現，早期肺癌發生與多種基因的表達相關，而BMPs家族在腫瘤病情進展中發揮重要作用〔4〕；動物實驗顯示，BMP2表達量增加會提升肺癌的發生率和死亡率，可刺激肺癌細胞體外遷移和侵襲〔5〕。此外，BMP6和BMP3在肺癌組織中蛋白表達水平明顯高于正常組織〔6〕。BMP9在不同類型腫瘤中作用存在差異，在前列腺癌組織和細胞中檢出BMP9低表達，調高BMP9表達水平后可明顯抑制前列腺癌細胞增殖和侵襲力〔7〕；但在肝癌組織中存在BMP9高表達，使用病毒載體抑制其表達后可明顯減弱肝癌細胞的遷移和侵襲能力〔8〕；說明BMP9在前列腺癌中發揮抑癌基因的作用而在肝癌中是促進癌細胞病變的因子。

本次研究顯示，BMP9在人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90中的表達水平明顯低于正常支氣管上皮細胞。使用重組腺病毒Ad- BMP9轉染YTMLC- 90細胞后胞內過表達BMP9，細胞的遷移能力和侵襲能力均明顯降低。BMP- Smad信號通路是BMPs家族發揮調控作用的經典通路，高表達BMP9的YTMLC- 90細胞中BMP- Smad信號通路中Smad1/5磷酸化明顯增強，提示BMP9通過BMP- Smad信號通路調控肺癌細胞增殖、轉移等生物學活性。

綜上所述，高表達BMP9可有效抑制人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90的遷移、侵襲能力，主要通過激活BMP- Smad信號通路發揮調控作用，因此BMP9有望成為治療肺癌的一個新靶點。對于BMP9是否能通過激活Erk、P38 Mark 等其他信號通路來調控肺癌細胞增殖和遷移仍需進一步研究。

1 余 虹,邱昕光.老年綜合評價體系對老年非小細胞肺癌患者個體化治療的指導意義〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(2):387- 9.

2 徐維國.CXCL12- G801A基因多態性與我國漢族人群非小細胞肺癌發病風險的相關性研究〔D〕.廣州：南方醫科大學,2015.

3 Choi YJ,Kim ST,Park KH，etal.The serum bone morphogenetic protein- 2 level in non- small- cell lung cancer patients〔J〕.Med Oncol,2012;29(2):582- 8.

4 鄭宏瑜.非小細胞肺癌組織中BMP- 2與CD105的表達和意義〔D〕.南昌：南昌大學,2011.

5 Owens P,Pickup MW,Novitskiy SV,etal.Inhibition of BMP signaling suppresses metastasis in mammary cancer〔J〕.Oncogene,2015;34(19):2437- 49.

6 Yeh LC.In vitro and in vivo studies on the effects of bone morphogenetic protein- 7 on human kidney and lung tumor cells〔J〕.Int J Biomed Sci,2010;6(3):176- 81.

7 Lee KB,Murray SS,Duarte MEetal.Effects of the bone morphogenetic protein binding protein spp24(secreted phosphoprotein 24 kD) on the growth of human lung cancer cells〔J〕.J Orthop Res,2011；29(11):1712- 8.

8 Ye L,Mason MD,Jiang WG,etal.Bone morphogenetic protein and bone metastasis,implication and therapeutic potential〔J〕.Front Biosci(Landmark Ed),2011;16:865- 97.

〔2016- 10- 18修回〕

(編輯 滕欣航)

崔 丹(1978- )，女，講師，主要從事生理學研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3691- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.021