Ⅱ型膠原蛋白與弗氏佐劑誘導關節炎小鼠模型的建立

周夏娟 應旭旻

(浙江中醫藥大學附屬第一醫院，浙江 杭州 310006)

Ⅱ型膠原蛋白與弗氏佐劑誘導關節炎小鼠模型的建立

周夏娟 應旭旻1

(浙江中醫藥大學附屬第一醫院，浙江 杭州 310006)

目的 探討成功建立膠原誘導關節炎(CIA)小鼠模型及如何提高建模成功率。方法 選擇8周齡的雄性DBA/1J小鼠20只，隨機分為正常組(n=10),CIA實驗組(n=10)，100 μg牛Ⅱ型膠原蛋白溶于完全弗氏佐劑，在尾根部皮下注射，第21天再次注射50～100 μg。免疫后觀察小鼠的關節改變，按小鼠關節疾病嚴重程度評分。結果 正常組均未發病，實驗組約4 w后開始第一個足趾出現腫脹，第7周發病率為50%，平均關節炎指數(MAI)為2.1，10 w后CIA小鼠模型的發病率為90%，MAI為7.1。結論 選擇近交系雄性的DBA/1J小鼠，且選擇小鼠尾根部皮下注射Ⅱ型膠原蛋白與弗氏佐劑相對發病率較高。

DBA/1J ；關節炎；Ⅱ型膠原蛋白

膠原誘導關節炎(CIA)模型是一種由膠原誘導的免疫炎癥模型,為多發性關節炎,在動物模型中表現的紅腫熱痛的病理表現和發病機制與人類風濕關節炎(RA)類似。1980年Courtenay等〔1〕建立了小鼠CIA 模型,極大地推進了RA發病機制和治療的研究。目前對RA的研究熱點在于免疫抑制方面發病過程中免疫細胞的相互作用和明確各個細胞分子或酶類在各個免疫環節中的精確作用。因此選擇具備合適易感性的品系、建立穩定的CIA模型對研究RA的研究具有重要意義，本實驗選用H- 2q單倍型的易感性最高的DBA/1J小鼠，應用Ⅱ型膠原與弗氏佐劑混合誘導的方法，探討建立高效穩定CIA小鼠模型的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 近交系DBA/1J小鼠20只，雄性,8周齡，由上海斯萊克實驗動物中心提供，浙江中醫藥大學動物中心SPF級別飼養。隨機分配為正常組和實驗組各10例。

1.2 主要試劑與器材 牛Ⅱ型膠原蛋白、完全弗氏佐劑購自美國Chondrex公司；冰醋酸(杭州紅十字會醫院中心實驗室提供)；制冰機，5 ml空針；橡皮管。

1.3 方法

1.3.1 模型建立方法 牛Ⅱ型膠原蛋白溶于冰醋酸中，濃度為2 mg/ml，放置4℃冰箱中隔夜，等體積與完全弗氏佐劑混合。將2個5 ml的空針拔掉枕頭，兩針管間用橡皮管連接，將混合液在2個空針間反復來回推動充分乳化。將乳化好的試劑在2 h以內免疫小鼠，在尾根部皮下注射膠原100 μg/只。第21天后再次注射免疫50～100 μg/只，避免重復第一次注射部位。

1.3.2 觀察指標 適應性飼養后，每兩天觀察并記錄各小鼠足趾情況及體重變化，每周匯總并分析，持續14 w，其中12 w后實驗組小鼠死亡1只，實驗結束時，實驗組9只，正常組10只。

1.3.3 疾病發病和關節病變的評分 關節炎分數(AS)：為每只小鼠所有病變關節分數的總和,最高分為16 分。各劑量組所有小鼠AS總和除以該組小鼠的只數,即為該組平均關節炎指數(MAI)。

1.4 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

正常組為無發病小鼠。實驗組誘導4 w后開始首只小鼠足趾出現紅腫，第69天到達高峰。其腫脹多在趾間關節開始，隨后腫脹至足墊，踝關節，腫脹后可發展為關節僵硬、畸形，前后趾發病前后不一，前趾的發病率為70%，后趾的發病率為80%。小鼠足趾腫脹程度見圖1。第7周實驗組發病率為50%，MAI為2.1；10 w后實驗組發病率為90%，MAI為7.1。實驗組小鼠免疫10 w腫脹程度達峰值，且10 w后腫脹程度稍有減少，但仍維持在較高水平。免疫100 d后，實驗組小鼠體重均值〔(24.36±1.37)g〕,明顯低于正常組〔(27.25±1.38)g，t=4.701，P<0.05〕，表明膠原免疫致病對小鼠的體重變化有影響。

圖1 DBA/1J小鼠關節病變

3 討 論

根據文獻報道目前常用的RA動物模型有佐劑性關節炎(AA)模型、CIA模型和人鼠嵌合模型〔2，3〕，但人鼠嵌合模型雖然在機制方面有明顯優勢，但受倫理、法制等約束故臨床不常用，故本研究選擇更接近RA發病機制的CIA模型。本文結果顯示牛Ⅱ型膠原蛋白免疫的DBA/1J小鼠發病率高可達90%以上，且MAI和發病嚴重程度均較高，能夠為RA的發病機制和病理特征的研究提供穩定的動物模型基礎。目前國內外很多文獻研究實驗大鼠作為動物模型，大鼠的CIA模型動物品系有DA大鼠、SD和Wistar遠交群大鼠、近交系Lewis大鼠，其中DA大鼠主要由國外引進，價格昂貴、適應力差、免疫力低下，不易哺育等特點限制了其實際應用；遠交群SD和Wistar大鼠價格便宜、適應力強，繁殖快等特點為國內研究建造CIA模型高頻率應用；近交系Lewis大鼠因購買方便，價格合理是國內使用率相對較高的品系〔4〕。小鼠CIA敏感性和老鼠的組織相容性復合體(MHC)相關，因此只有選擇易感性強的H- 2q或H- 2r單倍型的小鼠如：DBA/1 (H- 2q) B10.RIII (H- 2r)和易感性稍弱的C57BL/6小鼠。在大鼠中對CIA的敏感性也與組織相容性復合體相關，但與小鼠相比較具有比較寬的范圍，因此本實驗選擇小鼠作為動物模型。目前小鼠CIA模型的品系大致分為兩種易感性強的DBA/1 (H- 2q)或B10.RIII (H- 2r)和易感性較弱的C57BL/6(H- 2b)小鼠，對有文獻報道C57BL/6小鼠CIA模型的發病率最高為70%〔5〕,明顯低于DBA/1J品系的小鼠(發病率90%～100%)。不同品系的小鼠對不同種類的Ⅱ型膠原蛋白的敏感度是不同的，如B10.RIII小鼠對牛型、豬型的Ⅱ型膠原蛋白敏感，但是對雞型和人型的Ⅱ型膠原蛋白無反應。DBA/1J小鼠對雞型、牛型、豬型、人型都具有高敏性，故本實驗選擇牛Ⅱ型膠原蛋白。試劑在乳化過程的充分性也至關重要，本實驗用橡皮管連接的兩個空針作為乳化的工具，將等體積溶于完全弗氏佐劑中的膠原蛋白在冰浴環境中來回推動乳化，乳化時間至少2～3 h才能將其充分乳化。但此種乳化耗時久，過程中試劑耗損大，推薦使用勻漿器充分乳化。

1 Courtenay JS,Dallman MJ,Dayan AD,etal.Immunisation against heterologous type Ⅱ collagen induces arthritis in mice〔J〕.Nature,1980;283(5438):666- 8.

2 張 巍,王 芳,王 博,等.佐劑誘導關節炎大鼠模型的建立及成纖維樣滑膜細胞的分離〔J〕.中國動物實驗學報,2012;20(6):73- 7.

3 孫佳蕾,武 平,陳白露,等.類風濕關節炎動物模型在中醫研究中的應用〔J〕.現代中西醫結合雜志,2015;24(4):444- 7.

4 趙宏艷,王 燕,肖 誠,等.不同品系、不同性別對大鼠CIA發病情況的比較研究〔J〕.中國中醫基礎學雜志,2010;16(9):761- 4.

5 賈俊峰,李曉燕,朱 平,等.C57BL/ 6小鼠CIA模型的建立及其監測體系的初步篩選〔J〕.解放軍醫學雜志,2004;29(6):472- 4.

〔2016- 01- 13修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

杭州市科技局項目(No.20110733Q15)

應旭旻(1972- )，男，博士，主任中醫師，碩士生導師，主要從事腎臟病學研究。

周夏娟(1988- )，女，碩士，住院醫師，主要從事中醫藥防治腎臟疾病研究。

R392

A

1005- 9202(2017)15- 3689- 02；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.020

1 杭州市急救中心