Notch1表達對腎癌細胞生物學行為的影響

尚春香 付宏偉 南 征 馬吉成 李 葉

(青海省第五人民醫院腫瘤科，青海 西寧 810007)

Notch1表達對腎癌細胞生物學行為的影響

尚春香 付宏偉1南 征 馬吉成 李 葉

(青海省第五人民醫院腫瘤科，青海 西寧 810007)

目的 探討Notch1表達對腎癌細胞生物學行為的影響。方法 通過Western印跡檢測Notch1在人正常腎小管上皮細胞HK- 2，人腎癌細胞786- O，Caki- 1，769- P，GRC- 1及ACHN中的表達；siRNA Notch1及siRNA NC轉染腎癌細胞48 h后，Western印跡及RT- PCR檢測轉染情況，MTT法及Hoechst染色檢測細胞活力及凋亡情況，Transwell法檢測細胞遷移侵襲能力，Western印跡檢測Bax，Bcl- 2，基質金屬蛋白酶(MMP)2，MMP9蛋白表達。結果 HK- 2細胞中Notch1蛋白表達量顯著低于5株腎癌細胞786- O，769- P，GRC- 1，Caki- 1及ACHN，且在Caki- 1中Notch1表達量最高，因此作為后續實驗的細胞株。siRNA Notch1及siRNA NC轉染腎癌細胞48 h后，與siRNA NC組比較，siRNA Notch1組Notch1蛋白及mRNA表達量下調，細胞活力降低，細胞凋亡率提高，細胞侵襲數目減少，Bax表達量上調，Bcl- 2、MMP2及MMP9表達量下調(P<0.01)。結論 Notch1低表達能顯著抑制腎癌細胞Caki- 1的惡性生物學行為，可能與調控細胞凋亡蛋白及下調MMPs表達有關。

Notch1；腎癌細胞；增殖；凋亡；侵襲

腎癌又稱為腎細胞癌，發病隱匿，一旦確診常處于晚期，且主要治療方式為手術根治性切除，但預后差〔1〕。Notch信號通路對于細胞的增殖、凋亡、分化、遷移發揮著類似于干細胞自我更新的作用，且研究顯示此信號通路是一種獨立的小腦視網膜多發毛細血管瘤(VHL)/缺氧誘導因子(HIF)途徑，與腎癌的發生發展密切相關〔2〕。Notch有4種常見的受體(Notch1～Notch4)，其中Notch1研究最為廣泛。Notch1在包括腎癌在內的多種腫瘤組織高度表達〔3〕。研究還顯示小分子RNA干擾Notch1能顯著抑制Caki- 1細胞增殖〔4〕；而過度活化的Notch1對于Caki- 1細胞的增殖具有促進作用〔5〕，但具體的作用機制未知。本研究將繼續探討Notch1對腎癌細胞生物學行為的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人正常腎小管上皮細胞HK- 2，人腎癌細胞786- O、Caki- 1、769- P、GRC- 1及ACHN均購于中科院上海細胞庫。

1.2 試劑及儀器 四唑鹽試劑(MTT)，結晶紫(美國sigma公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒，Hoechst 33258染色試劑盒(南京凱基生物技術有限公司)；LipofectamineTM2000，Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)；兔抗人Bax，Bcl- 2，基質金屬蛋白酶(MMP)2，MMP9，甘油醛- 3- 磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(美國Epitmics公司)；Transwell 小室(美國Corning 公司)；siRNA Notch1，Notch1 NC(廣州銳博生物技術有限公司)。DMI4000倒置熒光顯微鏡(德國萊卡公司)；DYCZ- 25D型雙垂直電泳儀，DYCZ- 25D型轉印電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；Gel Doc XR凝膠成像系統(美國伯樂公司)。

1.3 細胞轉染 當腎癌細胞生長達到50%的時候，利用LipofectamineTM2000脂質體將siRNA Notch1，Notch1 NC轉染到腎癌細胞，6 h后換成含10%血清的DMEM培養基，Western印跡及RT- PCR檢測細胞中Notch1蛋白及mRNA的表達。

1.4 噻唑藍(MTT)法檢測細胞活力 將5×103個腎癌細胞接種到96孔板，培養24 h后，按1.3轉染48 h后，每孔加入20 μl的MTT(終濃度為5 mg/ml)，繼續培養4 h后，棄去上清液，每孔加入150 μl的二甲基亞砜，使沉淀物溶解，10 min后，于酶標儀波長570 nm處測定OD值，OD值即代表細胞活力。每組平行3個實驗。

1.5 Hoechst染色檢測細胞凋亡 將1×104個腎癌細胞接種到6孔板，培養24 h后，按1.3轉染48 h后，收集細胞，用4%多聚甲醛固定細胞15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，將Hoechst染色液加入6孔板，在室溫條件下避光染色15 min，并在熒光顯微鏡下觀察細胞形態，細胞發白發亮說明細胞呈凋亡狀態。每組平行3個實驗。

1.6 Transwell法檢測細胞侵襲 在實驗前Transwell小室微膜上均勻鋪上Matigel膠備用。腎癌細胞按1.3轉染后，用胰蛋白酶將細胞消化下來，接種到Transwell的上室，而下室不接種細胞，僅加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基，繼續培養48 h后，將小室取出來，用多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌3次，結晶紫染色5 min，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，并對Transwell的下室中隨機5個視野中的細胞數目進行計數，并取平均值，即為細胞的侵襲數目。每組平行3個實驗。

1.7 RT- PCR檢測Notch1 mRNA在腎癌細胞株中的表達 根據Trizol試劑盒提取細胞總的RNA，并檢測總RNA的純度。接著利用一步法RT- PCR試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，并用cDNA進行擴增，最后用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的產物。Notch1上游引物：5′- CCTTTGTGCTTCTGTTCTTCG- 3′，下游引物：5′- CCACTCATTCTGGTTGTCGTC- 3′。 GAPDH作為內參，上游引物：5′- AGCCACATCGCTCAGACA- 3′，下游引物5′- TGGACTCCACGACGTACT- 3′。

1.8 Western印跡檢測細胞中Bax，Bcl- 2，MMP2，MMP9的表達 將1×104個腎癌細胞接種到6孔板，培養24 h后，按1.3進行轉染，在冰浴條件下將轉染好的細胞刮下來，離心收集細胞，并用細胞裂解液裂解細胞30 min，4℃離心得到的上清液就是總蛋白。蛋白濃度根據BCA試劑盒來測定，測定后將蛋白煮沸10 min，使蛋白變性，然后上樣，上樣量大約30 ng左右，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，接著濕法轉膜30～40 min。轉膜結束后，將膜置于2%的胎牛血清(BSA)中于室溫條件下封閉1 h。接著將膜放入一抗溶液(兔抗人Bax，Bcl- 2，MMP2，MMP9，GAPDH單克隆抗體，稀釋度1∶100)中孵育，4℃過夜；第2天將膜取出，放入二抗溶液在室溫條件下孵育1～2 h。凝膠成像系統中曝光。用Quantity one軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.9 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 Notch1在人正常腎小管上皮細胞HK- 2及5株腎癌細胞株中的表達情況 Notch1在人正常腎小管上皮細胞HK- 2，人腎癌細胞786- O，769- P，GRC- 1，Caki- 1及ACHN中的表達，結果表明HK- 2細胞(0.18±0.02)中Notch1蛋白表達量顯著低于5株腎癌細胞(0.35±0.03，0.48±0.05，1.23±0.12，1.37±0.13，0.38±0.04)，且在Caki- 1中Notch1表達量最高，因此作為后續實驗的細胞株。見圖1。

2.2 siRNA Notch1在Caki- 1細胞中的表達 siRNA Notch1及Notch1 NC在Caki- 1細胞轉染48 h后，二者蛋白及mRNA表達量分別為〔(0.83±0.08 vs 0.16±0.01)及(1.01±0.10 vs 0.19±0.02)，P<0.01〕。見圖2。

2.3 siRNA Notch1對Caki- 1細胞活力及凋亡的影響 見圖3。

A：HK- 2；B：786- O；C：769- P；D：GRC- 1；E：Caki- 1；F：ACHN圖1 Notch1在人正常腎小管上皮細胞HK- 2及5株腎癌細胞株中的表達情況

A：Notch1 NC組；B：siRNA Notch1組圖2 siRNA Notch1在Caki- 1細胞中的表達

圖3 siRNA Notch1對Caki- 1細胞凋亡的影響

siRNA Notch1組(0.34±0.03)細胞活力顯著低于Notch1 NC組(0.76±0.07)(P<0.01)。通過Hoechst染色實驗發現，siRNA Notch1組(38.45±3.80)%細胞凋亡率顯著高于Notch1 NC組(5.70±0.57)%(P<0.01)。

2.4 siRNA Notch1對Caki- 1細胞侵襲能力的影響 Caki- 1細胞轉染48 h后，siRNA Notch1組(43.21±4.30)細胞侵襲數目顯著低于Notch1 NC組(145.38±14.98,P<0.01)。見圖4。

圖4 siRNA Notch1對Caki- 1細胞侵襲能力的影響(×200)

2.5 siRNA Notch1對Caki- 1細胞中Bax及Bcl- 2表達量的影響 Caki- 1細胞轉染48 h后，與Notch1 NC組比較，siRNA Notch1組Bax表達上調，Bcl- 2表達下調(P<0.01)。見圖5，表1。

2.6 siRNA Notch1對Caki- 1細胞中MMPs表達量的影響 Caki- 1細胞轉染48 h后，與Notch1 NC組比較，siRNA Notch1組MMP2及MMP9表達下調(P<0.01)。見圖6，表1。

圖5 siRNA Notch1對Caki- 1細胞中Bax及Bcl- 2表達量的影響

圖6 siRNA Notch1對Caki- 1細胞中MMPs表達量的影響

組別Bcl-2/GADPHBax/GADPHMMP2/GADPHMMP9/GADPHNotch1NC組0.98±0.100.32±0.030.87±0.091.33±0.13siRNANotch1組0.38±0.031)1.12±0.101)0.20±0.021)0.46±0.041)

與Notch1 NC比較：1)P<0.01

3 討 論

Notch主要信號蛋白上的受體與配體結合，將信號傳遞給下一個受體并引起一系列分解過程，從而調控細胞的增殖，分化，凋亡等過程〔6〕。因此，Notch信號通路在胚胎發育，神經退行性疾病，免疫功能紊亂及腫瘤的發生過程中發揮著重要作用〔2〕。Notch1于1991年從人類T淋巴細胞白血病中首次被鑒定出來，位于人類染色體9q34.3染色體上，通過調控細胞的增殖、凋亡等生命過程影響著腫瘤的發生發展〔7〕。研究顯示Notch1與Notch信號通路的其他蛋白在腎透明細胞癌組織陽性表達率高于正常腎組織，并與腫瘤的病理分級、大小等臨床參數密切相關，提示Notch1對于腎癌的診斷及預后具有顯著意義〔3〕。另外研究還表明Notch1在腎癌細胞Caki- 1及786- O中的表達量顯著高于正常腎小管上皮細胞HK- 2，且干擾Notch1表達能顯著降低Caki- 1細胞活力，但具體的作用機制尚未見報道〔4〕。張振等〔4〕研究結果所述，腎癌細胞中Notch1表達顯著高于HK- 2細胞，提示Notch1在腎癌組織中可能起著促癌作用。本研究結果表明腎癌細胞Caki- 1中Notch1表達下調后能顯著降低細胞活力，并誘導細胞凋亡；同時，Transwll侵襲實驗結果也證實siRNA Notch1能顯著抑制Caki- 1細胞侵襲能力，與siRNA Notch1在頭頸部鱗狀細胞癌〔8〕、乳腺癌〔9〕中的作用一致。

細胞的凋亡與增殖受凋亡相關基因的嚴格調控，其中最常見的是Bcl- 2家族。Bcl- 2是此家族中研究最廣泛的抑凋亡蛋白，能與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，進而阻斷凋亡信號，促進細胞存活。而Bax能自身形成二聚體，將凋亡信號傳遞給Caspase家族，最終導致細胞凋亡。研究已經表明腎癌組織中Bcl- 2高表達，而Bax低表達甚至缺失〔10〕。另外，腫瘤細胞侵襲的關鍵步驟之一是細胞外基質降解，以便于腫瘤細胞快速進出，而蛋白水解酶MMPs能夠降解大部分的細胞外基質降解。其中MMP2具有雙重功能，既能夠降解細胞外基質成分，還能夠誘導新生血管的生成，最終導致腫瘤細胞的遷移浸潤。MMP9是分子量最大的MMPs，幾乎能夠降解所有的細胞外基質成分，且腎癌組織中MMP2及MMP9陽性率顯著高于癌旁組織〔11〕。有研究表明siRNA Notch1能顯著調控Bcl- 2家族蛋白表達，并下調MMPs表達，進而抑制腫瘤細胞的增殖及侵襲等生物學行為〔9〕。本研究結果表明siRNA Notch1能顯著下調Bcl- 2、MMP2及MMP9表達、上調Bax表達，提示siRNA Notch1能通過調控Bcl- 2家族蛋白及MMPs蛋白進而抑制腎癌細胞的惡性生物學行為。

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〔2017- 05- 21修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

付宏偉(1978- )，男，副主任醫師，主要從事脊柱、創傷研究。

尚春香(1976- )，女，碩士，副主任醫師，主要從事腫瘤化療研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3645- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.003

1 青海省第五人民醫院骨科