Tim- 3通過膽固醇酯水解酶影響巨噬細胞泡沫化過程的機制

劉菲菲 李晨光 孫大鵬 張鳳香

(錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121001)

·基礎研究·

Tim- 3通過膽固醇酯水解酶影響巨噬細胞泡沫化過程的機制

劉菲菲 李晨光 孫大鵬 張鳳香

(錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121001)

目的 觀察Tim- 3是否通過調節巨噬細胞內膽固醇脂水解酶(CEH)的表達干擾泡沫化細胞的形成，進而影響動脈粥樣硬化的發生發展。方法 Western印跡檢測CEH蛋白的表達；液體閃爍計數測定THP- 1 巨噬細胞內膽固醇流出情況；HPLC檢測胞內脂質含量；油紅O染色顯示胞內脂滴情況；ELISA檢測腫瘤壞死因子(TNF)- α、MIF、白細胞介素(IL)- 10的分泌情況。結果 Ad- Tim- 3組細胞中CEH的表達被明顯抑制，胞內膽固醇流出減少，胞內總膽固醇(TC)、膽固醇酯(CE)及游離膽固醇(FC)的含量明顯增加，TNF- α和MIF分泌增多，IL- 10的分泌減少；Ad- CEH組和Ad- Tim- 3+Ad- CEH組細胞中CEH的表達水平被明顯增強，胞內膽固醇流出增加，胞內TC、CE及FC的含量明顯減少，TNF- α和MIF分泌減少，IL- 10分泌增多。結論 Tim- 3可以通過增強巨噬細胞內CEH的活性抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉化。

膽固醇酯水解酶；巨噬細胞；Tim- 3

Tim是一組表達在巨噬細胞表面的受體蛋白家族，Tim- 3是TIM家族成員之一，屬于適應性免疫反應的負調控分子，早期研究發現Tim- 3主要在Th1細胞上表達，與炎癥性疾病的發病有關，可通過調節單核細胞和巨噬細胞等免疫細胞的活性干擾動脈粥樣硬化(AS)等炎癥性疾病的發生發展過程〔1，2〕。膽固醇酯水解酶(CEH)又叫膽鹽刺激脂酶，在AS斑塊發生發展過程中起重要作用。它能催化膽固醇酯(CE)水解為游離膽固醇(FC)，降低斑塊內纖維組織含量，減少CE在細胞內聚積，抑制巨噬細胞形成和T細胞浸潤〔3，4〕。本研究主要探討Tim- 3對巨噬細胞上CEH表達的調節作用及向泡沫細胞轉化的可能機制，進而為AS的防治提供新靶點和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人單核巨噬細胞THP- 1(上海生命科學研究院); ox- LDL(北京生物技術有限公司)；鼠抗人CEH抗體、鼠抗人Tim- 3抗體(上海生工)；小鼠抗β- actin抗體、山羊抗鼠 IgG (中杉金橋公司)；ECL發光試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒(凱基生物科技發展有限公司)。

1.2 細胞培養、泡沫化處理 將人THP- 1細胞以每孔1.0×106個細胞接種在含有10%胎牛血清(FBS)，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養基的六孔板中，在 37℃，5%CO2培養箱中孵育。加入100 ng/ml佛波醇12肉- 豆蔻酸酯13- 乙酸酯(PMA)，作用72 h，細胞分化成巨噬細胞。在50 mg/ml ox- LDL， 0.3%牛血清白蛋白(BSA)的無血清RPMI 1640培養基中共同孵育48 h，巨噬細胞轉化成泡沫細胞。實驗分為Control組、Ad- CEH組、Ad- Tim- 3+Ad- CEH組、Ad- Tim- 3組，按分組分別作用各組泡沫細胞48 h。

1.3 油紅O染色 培養的巨噬細胞，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛脫水- PBS中固定10 min。60%異丙醇漂洗，用0.3%油紅O在60%異丙醇中染色巨噬細胞10 min，再用60%異丙醇洗滌; 然后用蘇木精復染巨噬細胞3 min。 用水充分洗滌后，用顯微鏡以400倍放大倍數拍攝巨噬細胞。

1.4 膽固醇流出測定 培養上述細胞，然后用0.2 μCi/ml〔3H〕膽固醇標記。 72 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，并在含有0.1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的RPMI 1640培養基中孵育過夜，使所有細胞庫中的〔3H〕膽固醇平衡。 平衡的〔3H〕膽固醇標記的細胞用PBS洗滌，并在含有RPMI 1640培養基和0.1%BSA的2 ml流出培養基中孵育。 在指定的時間獲得150 μl流出介質樣品，并通過0.45 μm過濾器除去任何浮動細胞。 單層在PBS中洗滌2次，并用異丙醇提取細胞脂質。 然后通過液體閃爍計數測量培養基和細胞相關的〔3H〕膽固醇。 通過公式計算流出百分比：〔總培養基計數/(總細胞計數+總培養基計數)〕×100%。

1.5 HPLC分析 細胞用PBS洗滌3次。 將0.5%NaCl加入約50～200 μg細胞蛋白/ml。 使用超聲處理器將細胞超聲處理2 min。 使用BCA試劑盒測量細胞溶液中的蛋白質濃度。 使用0.1 ml等分試樣細胞溶液(含有5～20 μg蛋白質)測量FC，另一等分試樣用于總膽固醇(TC)檢測。 FC溶于異丙醇(1 mg膽固醇/ml)，儲存于-20℃備用。蛋白沉淀，并在15℃下以1 500 r/min離心10 min。 將10 μl上清液樣品應用于HLPC柱。使用異丙醇∶正庚烷∶乙腈(35∶13∶52)以1 ml/min的流速洗脫柱8 min。

1.6 Western印跡檢測相關蛋白的表達 細胞溶液作用48 h后，冷PBS清洗2次，提取細胞總蛋白，按照試劑盒說明書用BCA法定量。電泳分離后通過電轉儀將凝膠上的蛋白樣品移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉在37℃封閉2 h。分別加入1∶500 Tim- 3抗體、 1∶1 000 CEH單克隆抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入山羊抗鼠 IgG (1∶200)緩沖液，4℃孵育2 h。洗膜3次后凝膠成像。

1.7 ELISA法檢測細胞因子的分泌情況 具體步驟均按照ELISA試劑盒說明操作。誘導后泡沫細胞接種于24孔板中，按照每孔2×105個細胞PMA的培養液培養72 h后，PBS洗3遍，在分組處理48 h后收集各組細胞的培養液。揭去封板膜后室溫孵育30 min，期間配置洗滌液，洗滌液洗滌后棄去、甩干，重復5次。最后加入顯色劑，15 min后加入終止液終止，酶標儀450 nm波長順序測定各孔吸光度(OD值)。

1.8 統計學方法 應用SPSS13.0軟件，所有數據均采用ANOVA方法進行處理，計量資料分析采用t檢驗，計數資料分析采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1 Tim- 3對巨噬細胞內CEH表達的影響 與Control組(93.231±2.129)比較，Ad- Tim- 3組巨噬細胞內CEH的表達(50.736±2.706)被明顯抑制，而Ad- Tim- 3+Ad- CEH組(127.023±5.895)和Ad- CEH組(126.442±5.561)巨噬細胞內CEH的表達均被明顯增強(P<0.05)。見圖1。

圖1 Ad- Tim- 3和Ad- CEH對巨噬細胞中CEH表達的影響

2.2 Ad- Tim- 3和(或)Ad- CEH對巨噬細胞泡沫化的影響 各組作用細胞48 h后，油紅O染色結果顯示，Control組細胞陽性率為45.76%±2.95%；Ad- Tim- 3組細胞陽性率為67.82%±4.02%；Ad- Tim- 3+Ad- CEH組細胞陽性率為26.31%±2.12%；Ad- CEH組細胞陽性率為27.26%±2.87%。

2.3 Ad- Tim- 3和(或)Ad- CEH對巨噬細胞內膽固醇流出的影響 Control組膽固醇流出(9.25±0.41),Ad- Tim- 3組明顯抑制膽固醇流出(6.24±0.25)；而Ad- Tim- 3+Ad- CEH組(16.11±0.30)和Ad- CEH組(14.76±0.53)顯著增加巨噬細胞膽固醇流出。

2.4 Ad- Tim- 3和(或)Ad- CEH對巨噬細胞脂質蓄積的影響 與Control組比較，Ad- Tim- 3組細胞內CE、FC、TC含量均明顯增加(P<0.05)；而Ad- Tim- 3+Ad- CEH組和Ad- CEH組細胞內CE、FC、TC含量明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 HPLC分析各組膽固醇代謝結果

與Control組比較：1)P<0.05

2.5 Ad- Tim- 3和(或)Ad- CEH對巨噬細胞上清液中細胞因子分泌的影響 與Control照組比較，Ad- Tim- 3組細胞上清中TNF- α和MIF的分泌均明顯增多，而IL- 10的分泌均被明顯抑制(P<0.05)；Ad- Tim- 3+Ad- CEH組和Ad- CEH組細胞上清中TNF- α和MIF的分泌被明顯抑制，而IL- 10的分泌明顯增多(P<0.05)。 見圖2。

與Control組比較：1)P<0.05 圖2 Ad- Tim- 3和Ad- CEH對THP- 1 巨噬細胞上清中TNF- α、MIF、IL- 10分泌的影響

3 討 論

巨噬細胞是AS形成的主要效應細胞，其影響AS形成的機制是通過吞噬血液中的大量脂質形成泡沫細胞，而形成的泡沫細胞繼續聚集脂質，不斷大量蓄積的脂質又可以進一步導致細胞內炎癥因子分泌增加，而分泌的炎癥因子可進一步加速AS的形成〔5〕。

Tim- 3表達在CD4+Th1細胞上,可調節Th1細胞反應，在自身免疫性疾病、AS、抗感染等中發揮一定作用〔6，7〕。另外，Tim- 3可促進TNF- α、IL- 6分泌及調節巨噬細胞共刺激分子表達，即影響炎癥介質如 TNF- α、MIF、IL- 10的釋放〔8〕。研究已經發現〔9，10〕，CEH在AS的形成過程中起到十分重要的作用，CEH的表達水平與AS的易感性呈負相關。本研究結果發現，高表達的Tim- 3可以明顯抑制巨噬細胞內CEH的表達，但當CEH的表達被增強時Tim- 3的這種抑制作用不再存在。進一步研究發現，增加Tim- 3的表達可以進一步加強巨噬細胞向泡沫細胞的轉化，增加CE在巨噬細胞內的聚集，減少 FC 的流出。但當增強CEH的表達時Tim- 3的這種促進泡沫細胞形成和抑制膽固醇外流的作用卻被明顯降低。同時還發現，Tim- 3可以通過調節巨噬細胞內CEH的表達來影響TNF- α、MIF和IL- 10細胞因子的分泌，進而進一步影響AS的形成與發展。

綜上，Tim- 3可能是通過抑制巨噬細胞內CEH的表達，減少巨噬細胞內膽固醇流出，促進胞內脂質蓄積來影響AS病變的發生發展。但其在 AS 形成過程中的作用還需進一步研究。

1 Monney L,Sabatos CA,Gaglia JL,etal.Th1- specific cell surface protein Tim- 3 regulates macrophage activation and severity of an autoimmune disease〔J〕.Nature,2002;415(6871):536- 41.

2 Zhao Z,Jiang X,Kang C,etal.Blockade of the T cell immunoglobulin and mucin domain protein 3 pathway exacerbates sepsis- induced immune deviation and immunosuppression〔J〕.Clin Exp Immunol,2014;178(2):279- 91.

3 Bandyopadhyay S,Long ME,Allen LA.Differential expression of microRNAs in Francisella tularensis- infected human macrophages:miR- 155- dependent downregulation of MyD88 inhibits the inflammatory response〔J〕.PLoS One,2014;9(10):e109525.

4 Wang J,Yu F,Jia X,etal.MiR- 155 deficiency enhances the recruitment and functions of myeloid- derived suppressor cells in tumor microenvironment and promotes solid tumor growth〔J〕.Int J Cancer,2015;136(6):E602- 13.

5 Mc Laren JE,Michael DR,Ashlin TG,etal.Cytokines,macrophage lipid metabolism and foam cells: implications for cardiovascular disease therapy〔J〕.Prog Lipid Res,2011；50:331- 47.

6 Zhang XM,Shan NN,Sun M,etal.Imbalanced expression of human Tim- 1 and Tim- 3 in peripheral blood mononuclear cells from immune thrombocytopenia patients〔J〕.Int Immunopharmacol,2014;19(1):1- 4.

7 Yong QC,Jun PR,Juan Z,etal.MiR- 155 regulates interferon- c production in natural killer cells via Tim- 3 signalling in chronic hepatitis C virus infection〔J〕.Immunology,2015;145,485- 97.

8 Rangachari M,Zhu C,Sakuishi K,etal.Bat3 promotes T cell responses and autoimmunity by repressing Tim- 3 - mediated cell death and exhaustion〔J〕.Nat Med,2012;18(9):1394- 400.

9 Sakai K,Igarashi M,Yamamuro D,etal.Critical role of neutral cholesteryl ester hydrolase 1 in cholesteryl ester hydrolysis in murine macrophages〔J〕.J Lipid Res,2014;55(10):2033- 40.

10 Bie J,Wang J,Yuan Q,etal.Liver- specific transgenic expression of cholesteryl ester hydrolase reduces atherosclerosis in Ldlr- /- mice〔J〕.J Lipid Res,2014;55(4):729- 38.

〔2017- 01- 17修回〕

(編輯 李相軍)

國家自然科學基金(81541099);遼寧省自然科學基金(2016010330- 301)

張鳳香(1978- )，女，博士，副主任醫師，副教授，碩士生導師，主要從事動脈粥樣硬化研究。

劉菲菲(1982- )，女，碩士，醫師，主要從事動脈粥樣硬化研究。

R33

A

1005- 9202(2017)15- 3641- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.001