不同提取方法對柑橘皮總黃酮及其抗氧化活性的影響

吳梅青，陳丹，李俊雅

(湘潭醫衛職業技術學院，湖南湘潭411102)

不同提取方法對柑橘皮總黃酮及其抗氧化活性的影響

吳梅青，陳丹，李俊雅

(湘潭醫衛職業技術學院，湖南湘潭411102)

研究不同提取方法對柑橘皮總黃酮及抗氧化活性的影響。選用堿溶酸沉、回流、超聲、微波和水提等5種提取方法，測定5種不同的提取液中總黃酮的含量；采用DPPH、普魯士藍兩種方法測定其抗氧化活性；并分析總黃酮含量和抗氧化活性之間的關系。在對總黃酮的測定中，結果如下：回流提取法>超聲提取法>微波提取法>水提法>堿溶酸沉法，回流提取總黃酮含量大于其它幾種方法，與其他3種提取方法進行對比，差異非常明顯(P<0.05)，而與超聲提取比較差異不明顯(P>0.05)。抗氧化的結果顯示，5種提取方法所得的黃酮提取液均有較強的抗氧化活性；不同提取方法提取柑橘總黃酮抗氧化性的效果依次為：超聲提取法>微波提取法>回流提取法>水提法>堿溶酸沉法。相關性分析發現，總黃酮的含量與抗氧化活性呈一定的正相關。結果表明，不同的提取方法會對柑橘黃酮含量以及抗氧化活性產生一定的影響，各提取液中黃酮含量和抗氧化活性之間具有正相關的關系。

柑橘；黃酮；不同提取方法；抗氧化活性

柑橘果實歷來是我國傳統的中藥材，其中的黃酮類物質含量豐富。其黃酮主要存在于柑橘屬植物果實的外皮中。研究表明，黃酮類化合物有多重生物學作用，如抗炎抑菌、抗氧化、降血糖、降血脂、抗癌、抗腫瘤及增強免疫力等作用，其安全、無毒，已在醫藥、食品加工等方面得到廣泛應用[1]。近年來國內外有關柑橘黃酮的報道日漸增多，柑橘黃酮以其特有的生理活性逐漸引起人們的重視，目前市場上已有大量以天然黃酮物質作為膳食補充劑制成的各種保健品和食品，柑橘黃酮作為食品添加劑具有廣闊的發展前景。本研究以湖南產柑橘皮為研究對象，參考相關文獻資料，采用堿溶酸沉法、水提法、回流提取法、超聲提取法、微波提取法等5種提取方法提取柑橘中總黃酮，分析不同提取方法對柑橘總黃酮含量及其抗氧化活性的影響，旨在為更加深入研究柑橘黃酮的作用提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

蜜桔，購買于湖南湘潭某農貿市場，產地為常德石門；蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，100080-200707 )；二苯代苦味酰基(DPPH)自由基(梯希愛(上海)化成工業發展有限公司)；鐵氰化鉀(廣州化學試劑廠)；三氯乙酸(國藥集團化學試劑有限公司)；鄰苯三酚(上海邁坤化工有限公司；)無水乙醇； NaOH、Al(NO3)3、NaNO2等為分析純；超純水。

1.2 儀器

雙光束紫外分光光度計(UV2600，上海天美科學儀器有限公司)；分析天平(十萬分之一，賽多利斯BP211D)；XL-600B多功能粉碎機(永康市小寶電器有限公司)；KQ3200DB數控超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 原料預處理

將蜜桔洗滌后剝皮，再蜜橘皮放在50℃烘箱中烘干至恒重。采用多功能粉碎機進行粉碎，過60目篩，放干燥器中，備用。

2.2 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱定蘆丁對照品10.90mg置25mL量瓶中，加一定量75%的乙醇溶解，冷卻至室溫，再加75%的乙醇至刻度，得0.4360mg/mL的蘆丁對照品溶液。

精密量取對照品溶液0、1、1.5、2、2.5、3、4mL，分別置25mL容量瓶中，各加75%乙醇補足至5.0mL，各加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，靜置6min，再加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻、靜置6min，再4%氫氧化鈉試液10mL，再加75%乙醇至刻度，搖勻，靜置15min。以空白試劑作對照液，用雙光束紫外分光光度計在510nm的波長處測定吸光度，以對照品質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標得到標準曲線，如圖1所示。

圖1 蘆丁標準曲線

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 水提取液的制備。精密稱定2.1項下樣品約4.0g，置于250mL 圓底燒瓶中，加100 mL 水，直火加熱回流提取1h，放冷至約50℃，抽濾，重復提取3次，過濾，合并濾液，放置過夜，沉淀完全，減壓抽濾，沉淀用蒸餾水洗滌3次，抽干，將沉淀物轉移到表面皿中，于45℃恒溫真空干燥至恒重。用75%的乙醇溶解并定容至250mL容量瓶中，備用。平行試驗3次。

2.3.2 回流提取液的制備。精密稱定2.1項下樣品約 4.0g，置250 mL的圓底燒瓶中，加75%的乙醇回流提取3次，提取時間分別為1.0、0.5、0.5 h, 乙醇用量分別為40、30、30mL，合并3次回流提取液，定容至250 mL的容量瓶中，備用。平行試驗3次。

2.3.3 堿溶酸沉法液的制備。精密稱定2.1項下樣品約4.0g，置于干凈的燒杯中，加已煮沸的0.4%硼砂水溶液40mL加熱至沸騰，并在攪拌條件下加石灰乳調pH值在8～9，并保持該pH值煮沸20min，趁熱用4層紗布過濾；藥渣同法再操作2次，合并3次濾液，并用濃 HC1調pH值約為3～4，攪拌，放置過夜使沉淀完全，減壓抽濾，沉淀用蒸餾水洗滌3次，抽干，將沉淀物轉移到表面皿中，于45℃恒溫真空干燥至恒重。用75%的乙醇溶解并定容至250mL容量瓶中，備用。平行試驗3次。

2.3.4 超聲提法液的制備。精密稱定2.1項下樣品約4.0g，置于100mL的三角瓶中，用75%的乙醇30mL在超聲功率250W及超聲溫度25℃的水浴中提取30min，同法再操作2次，合并濾液，濃縮后得提取液，用75%的乙醇定容至250mL容量瓶中，備用。平行試驗3次。

2.3.5 微波提法液的制備。精密稱定2.1項下樣品約2.0g，置于100mL的三角瓶中，加入40mL的75%乙醇溶液，采用微波輔助提取，微波輻射功率 400W、微波輻射時間 30s×3，趁熱過濾，同法再操作2次，合并濾液，回收乙醇，用75%的乙醇定容至250mL容量瓶中，備用。平行試驗3次。

2.4 總黃酮含量的測定

精密吸取1mL上述總黃酮提取液置25mL容量瓶中，按2.2項下方法測定510nm處的吸光度，對照標準曲線 ，按照(1)公式計算柑橘皮中總黃酮的含量。

(1)

式中：C為提取物總黃酮含量(mg)，V為總樣品體積(mL)，W為樣品重量(g)，v為測定的樣品體積(mL)，N為稀釋倍數。

2.5 抗氧化活性的測定

2.5.1 不同方法黃酮提取物對DPPH自由基清除能力的測定。對 DPPH 自由基抗氧化活性的測定參照文獻[2-4]方法并稍做修改，方法如下：精密稱取 DPPH 標準品 0.0098g，用無水乙醇溶解并定容至 250 mL，配成0.1mol /L DPPH自由基溶液，現配現用。在具塞試管中分別加入2.00mL不同提取方法提取的柑橘皮黃酮提取液，再加入2.00mL 0.1mol /L DPPH自由基溶液， 搖勻，靜置 30 min。用2.00mL無水乙醇代替樣品和用2.00mL75%的乙醇混合后，用紫外-可見分光光度計在517 nm 處分別測定吸光度值(Aj)。空白對照組是以2.00mL無水乙醇代替樣品，用紫外-可見分光光度計在517 nm 處分別測定吸光度(A0)。DPPH自由基的清除率按(2)公式計算：

(2)

2.5.2 不同方法黃酮提取物對Fe3+還原能力的測定。采用普魯士蘭法測定不同方法黃酮提取物還原Fe3+的能力[5]。方法如下：在15mL具塞試管加入不同提取方法濃度不同的提取液1mL后，依次加入磷酸鹽緩沖液(C=0.2mol/L，pH6.6)2mL，1%鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)2mL，混合均勻后于50℃浴中反應20min后迅速冷卻，然后分別加入2mL 10%三氯乙酸(TCA)，混勻，離心(3000r/min)10min后，取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵0.5mL，混勻后于700nm處測定其吸光值。反應物吸光度增大說明還原能力增強。

3 結果與分析

3.1 不同提取方法提取柑橘皮黃酮的比較

5種提取方法中柑橘總黃酮的含量見表1。從表1中可以看出回流提取的總黃酮大于其它幾種方法，含量為83.34mg/g；其次為超聲提取法，含量為68.13mg/g；微波法為 56.42mg/g，水提法為44.76mg/g，堿溶酸沉法最低，為34.12mg/g。回流提取法與超聲波提取相比黃酮含量差異不顯著(P>0.05)，而與水提和堿溶酸沉提取之間黃酮含量差異顯著(P<0.05)。以上數據表明，柑橘黃酮易溶于乙醇，醇提法有利于柑橘黃酮的溶出。

表1 5種提取方法所得總黃酮含量比較

3.2 抗氧化活性的測定

3.2.1 不同方法黃酮提取物對DPPH自由基的清除能力。將5種不同提取方法的黃酮提取液按2.5.1的方法測定不同方法提取的提取液對對DPPH自由基的清除作用，結果如圖2所示。從圖2中可以看出，超聲提取液中總黃酮對DPPH自由基清除率最高，為72.62%；堿溶酸沉法提取液中總黃酮對DPPH自由基清除率最低，為40.45%；回流提取液為68.78%；微波提取液為64.72%，水提取液為48.26%。5種提取方法在實驗濃度清除效果：超聲提取法>微波提取法>回流提取法>水提法>堿溶酸沉法。超聲提取液、回流提取液和微波提取液的抗氧化能力與堿溶酸沉提取液和水提液的抗氧化能力相比有顯著差異性(P<0.05)。

注：1-堿溶酸沉法，2-超聲提取法，3-回流提取法，4-微波提取法，5-水提取法。

3.2.2 不同方法黃酮提取物對Fe3+還原能力的測定。將5種不同提取方法的黃酮提取液按2.5.2的方法測定提取液中總黃酮對 Fe3+的還原能力，結果如圖3所示。由圖3可以看出，超聲提取液中總黃酮對Fe3+的還原能力最高；堿溶酸沉法提取液中總黃酮對Fe3+的還原能力最低。5種提取方法在實驗濃度對Fe3+的還原能力：超聲提取法>微波提取法>回流提取法>水提法>堿溶酸沉法。超聲提取液、微波提取液和回流提取液對Fe3+的還原能力相比較，差異性不顯著(P>0.05)。

注：1-堿溶酸沉法，2-超聲提取法，3-回流提取法，4-微波提取法，5-水提取法。

3.2.3 不同提取方法黃酮含量與抗氧化活性間的相關關系。采用Excel做統計分析計算相關系數，總黃酮的含量與對DPPH自由基的清除率和對Fe3+的還原能力有一定的相關性，相關系數分別為0.6514和0.8168。而對DPPH自由基的清除率和對Fe3+的還原能力之間有較強的相關性，相關系數達到0.9422。

4 討論

從測定結果看，不同提取方式柑橘總黃酮的效

率依次為：回流提取法>超聲提取法>微波提取法>水提法>堿溶酸沉法；不同提取方式提取柑橘總黃酮抗氧化性的效果依次為：超聲提取法>微波提取法>回流提取法>水提法>堿溶酸沉法。不同提取方式總黃酮含量與抗氧化性有一定的相關性。由于不同提取方法破壞決柑橘皮細胞的程度也不相同，其有效成分的含量也不同，造成抗氧化性的能力也不太相同。無論是從有效成分的角度還是抗氧化能力的角度考慮，回流提取法和超聲提取法都是比較理想的提取方法。

5種不同方法提取得到的柑橘提取液中，回流提取法對柑橘總黃酮的提取率最高，但是從抗氧化能力方面看，超聲取液中總黃酮的抗氧化能力最高，可能與超聲波浸提過程中低溫提取有利于保護有效成分等優點有關[6]。因此，柑橘黃酮進行提取方法篩選時，要綜合考慮黃酮的提取率及其抗氧化活性。

[1]吳梅青,劉捷頻,陳丹.柑橘黃酮抗氧化和抗腫瘤作用的研究進展[J].亞太傳統醫藥,2017,173(13):83-85.

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[3]萬利秀,肖更生,徐玉娟,等.柑橘皮黃酮純化前后抗氧化性比較研究[J].食品科學,2011,5(32):87-91.

[4]Zhang Qingfeng, Zhang Zhongrong, Cheung Honyeung. Antioxidant activity of Rhizoma smilacis Glabrae extracts and its key constituent-astilbin[J]. Food Chemistry, 2008,115:297-303.

[5]林瑤,譚冰,韋文榮,等.不同提取法對廣金錢草總黃酮抗氧化活性的影響研究[J].右江民族醫學院學報,2016,4(38):364-367.

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EffectofDifferentExtractionMethodsontheContentofTotalFlavonoidsCompoundanditsAntioxidatantActivityinCitrusPeels

Wu Meiqing, Chen Dan, Li Junya
(Xiangtan Medicine Health Vacational College, Xiangtan,Hunan 411102)

To study the effects of different extraction methods on the content of total flavonoids compound and its antioxidatant activity in Citrus Peels. Flavonoids compound was extracted respectively by alkali-solution and acid-isolation，reflux extraction(RE), ultrasonic extraction(UE), microwave extraction(ME) and water extraction(WE). The total flavonoids content and its antioxidatant activity was determined by UV spectrophotometry. The correlation between flavonoids compound and antioxidatant activity was analyzed. In the determination of total flavonoids, the result was: reflux extraction > ultrasonic extraction > microwave extraction > water extraction> alkali-solution and acid-isolation. The flavonoids content extracted by RE was the highest which showed a significant difference(P<0.05) compared with other methods except UE(P>0.05). The antioxidatant results showed the flavonoids extracts by the five different methods had strong antioxidatant activity. The antioxidant effect of different extraction methods as follows: ultrasonic extraction > microwave extraction >reflux extraction > water extraction> alkali-solution and acid-isolation. There was positive correlation between flavonoids compound and its antioxidatant activity. Flavonoids compound and antioxidatant activity in citrus peels was affected by different extracting methods. There was positive correlation between flavonoids compound and its antioxidatant activity.

Citrus peels;Total flavonoid; Different extraction methods; Antioxidant activity

2017-03-19

湖南省教育廳科學研究項目 (15C1362)

吳梅青(1971-)，女，教授，碩士，研究方向：天然藥物的研究與應用，E-mail：wmq0519@sina.com。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.04.002

R284.2

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