柴胡皂苷D對胃癌SGC-7901細胞生長、遷移抑制作用和Norrin、Livin的影響

張曉海 張洪濤 胡孝定 王曦燁 鐘華

柴胡皂苷D對胃癌SGC-7901細胞生長、遷移抑制作用和Norrin、Livin的影響

張曉海 張洪濤 胡孝定 王曦燁 鐘華

目的 探討柴胡皂苷D對胃癌SGC-7901細胞生長、遷移抑制作用和Norrin、Livin水平的變化。方法 實驗分為對照組（正常培養SGC-7901細胞）、低劑量組（SGC-7901細胞+5μmol/L柴胡皂苷D）、中劑量組（SGC-7901細胞+10μmol/L柴胡皂苷D）和高劑量組（SGC-7901細胞+20μmol/L柴胡皂苷D）。采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測各組細胞24、48、72h細胞增殖情況；采用TUNEL法檢測各組細胞凋亡情況；采用Transwell檢測各組細胞遷移能力；采用real-time PCR對各組細胞中Norrin及Livin的表達進行檢測；采用Western blot檢測各組細胞Norrin、Livin、CDC25A、cyclin A2、p21和cyclin D1表達。結果 與對照組比較，低劑量組對SGC-7901細胞生長、凋亡和Norrin、Livin、p21及cyclin D1的表達未產生明顯影響（P＞0.05），但可減低SGC-7901細胞CDC25A、cyclin A2表達（P＜0.05）；中、高劑量組SGC-7901細胞生長抑制作用明顯，熒光TUNEL顯示凋亡率高于對照組（P＜0.05），Norrin及Livin mRNA表達減少（P＜0.05），CDC25A及cyclin A2表達具有抑制作用（P＜0.05），且具有劑量依賴性，對p21及cyclin D1無明顯影響（P＞0.05）。 結論 柴胡皂苷D可能通過Norrin、Livin的表達、干擾腫瘤細胞生長周期、介導腫瘤細胞凋亡等作用，抑制人胃癌SGC-7901細胞生長、遷移能力。

胃癌柴胡皂苷D 凋亡 Norrin Livin SGC-7901細胞

胃癌在我國每年大約有50萬例新發患者，在惡性腫瘤中發病率、死亡率均為順位第3位[1]。目前，手術及化療的治療效果并不能達到患者、醫生的期望[2]。因此，尋找治療胃癌的有效藥物不僅對患者具有一定的治療意義，而且具有重要的社會意義。柴胡皂苷是中藥柴胡的主要有效成分，研究證實柴胡皂苷D具有抗病毒、抗過敏、抗炎、抗腫瘤和抑制細胞黏附等作用[3]。Lee等[4]實驗發現，柴胡皂苷D對胃癌、乳腺癌、肝癌細胞均有較強的殺傷作用，其中對于胃癌細胞的殺傷作用最強。但目前對于柴胡皂苷D抗腫瘤機制的研究較少且不夠深入。Norrin和Livin是近年來新發現的腫瘤相關因子，與腫瘤的生長、侵襲有密切關系[5-6]。筆者觀察應用不同濃度柴胡皂苷D對人胃癌SGC-7901細胞的生長抑制作用及對Norrin和Livin的影響，為柴胡皂苷D治療胃癌提供基礎理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料 柴胡皂苷D由天然產物化學及功能分子合成（內蒙古自治區重點實驗室提供）。SGC-7901細胞（美國ATCC公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；NO-501一氧化氮檢測儀（日本IMN公司）；WD-9405B型水平搖床（北京六一公司）；CDC25A、cyclin A2、p21、cyclin D1、β-actin內參抗體（英國ABCAM公司）；Annexin V細胞凋亡試劑盒（美國SIGMA公司）；RPMI 1640（美國GIBCO公司）。

1.2 細胞培養與分組 SGC-7901細胞加入到10%滅活FBS的MEM培養液中（條件：37℃；5%體積分數CO2；飽和濕度），每2~3d傳代1次。將細胞懸濁液以6×104個/孔的密度接種于24孔板，細胞融合80%~90%進行轉染，將細胞分為對照組（正常培養SGC-7901細胞）、低劑量組（SGC-7901細胞+5μmol/L柴胡皂苷D培養30min）、中劑量組（SGC-7901細胞+10μmol/L柴胡皂苷D培養30min）和高劑量組（SGC-7901細胞+ 20μmol/L柴胡皂苷D培養30min）[7]。

1.3 四唑鹽比色法（MTT）檢測各組細胞抑制率 實驗前用臺盼藍拒染法確認SGC-7901細胞拒染率在95%以上，調整細胞數為4×107個/L，取200μl接種于96孔板中（每組細胞6個復孔），設對照組、空白對照組、實驗組，培養24、48、72h后，每孔加入5g/L MTT 20μl，繼續培養4h后去上清液，逐一加入DMSO 100μl后震蕩混勻，待藍色晶體完全溶解反應后，應用酶標儀測定570nm處的吸光度值（OD值）。抑制率（%）=（1-實驗組OD值/空白對照組OD值）×100%[8]。

1.4 Transwell遷移實驗 在各組SGC-7901細胞培養48h后，將無血清培養液中的5×104個細胞置于Transwell的上層小室中，再取出1×104個細胞滴入無血清培養液重懸細胞，然后移至Transwell小室中層。孵化24h后，用無菌棉簽擦除小室內細胞。用0.1%結晶紫染色20min，顯微鏡下取隨機視野經行拍照計數，此實驗步驟重復3次[9]。

1.5 TUNEL法檢測各組胃癌SGC-7901細胞凋亡 各組細胞經過0.1%Trition X-100透化后，用PBS漂洗3次，每次漂洗5min，再滴加3%過氧化氫（H2O2）200μl，漂洗3次后，加入蛋白酶K工作液置于常溫下20min；漂洗3次后加入TUNEL反應液（TdT+熒光素標記的dUTP）37℃恒溫箱中避光孵育1h；PBS清洗3次后加入DAPI，再次應用PBS漂洗3次，最后防熒光淬滅封片劑封片。隨機移動組織切片，選取細胞分布較均勻的高倍視野計數1 000個以上，在相鄰的10個視野下，藍色熒光為細胞核，綠色熒光為凋亡細胞核，即陽性細胞。凋亡指數（AI）計算：AI=各視野陽性細胞數/視野所有細胞總數×100%。

1.6 real-time PCR檢測各組細胞內 Norrin及 Livin mRNA表達 經過總RNA提取后進行RNA濃度檢測，反轉錄后行real-time PCR檢測。每個樣品基行6個復孔平行實驗，實驗結果舍去較大誤差數值后選取剩余值平均值最為實驗數據，實驗結果采用2-△△CT法分析數據。引物信息見表1。

表1 參照引物信息

1.7 Western blot檢測細胞內CDC25A、cyclin A2、p21、cyclin D1的表達 取培養48h細胞，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑PMSF，提取蛋白質，測定濃度。取樣15μl以10%SDS-PAGE電泳，常規轉膜后脫脂奶粉封閉，加一抗anti-CDC25A（1∶500）、anti-cyclin A2（1∶500）、anti-p21（1∶200）及anti-cyclin D1（1∶500）4℃孵育過夜，TBST洗脫5min×3次，HRP-山羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育2h，TBST洗脫10min×3次，ECL化學發光顯像，并讀取灰度值[10]。目的蛋白的相對表達量=目的蛋白的灰度值/內參蛋白的灰度值。

1.8 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組細胞抑制率的比較 與對照組比較，低劑量組細胞的增殖未受到明顯抑制（P＞0.05），中、高劑量組與對照組相比，細胞增殖則受到明顯抑制，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；高劑量組與中劑量組相比，細胞增殖受到的抑制更為明顯（P＜0.05），詳見表2。

表2 各組細胞增殖及凋亡的影響

2.2 Transwell遷移實驗結果 結果提示，對照組細胞數為（190±7）個/視野，低劑量組細胞數為（114±9）個/視野，中劑量組細胞數為（87±6）個/視野，高劑量組細胞數為（38±4）個/視野。與對照組相比，低、中、高劑量組視野下細胞數量均低于對照組，且隨劑量的增加而減少，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖1。

圖1 T r a n s w e l l檢測各組細胞遷移能力（a：對照組；b：低劑量組；c：中劑量組；d：高劑量組；結晶紫染色，×2 0 0）

2.3 各組細胞凋亡結果的比較 對照組僅有少量細胞凋亡（AI=4.94±1.14），與對照組相比，低劑量組細胞凋亡情況（AI=4.46±1.18）無明顯變化（P＞0.05），中、高劑量組細胞AI分別為11.76±2.85、34.34±7.74，明顯高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與中劑量組相比，高劑量組細胞凋亡更多，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 T U N E L檢測各組細胞凋亡（a：對照組；b：低劑量組；c：中劑量組；d：高劑量組；T U N E L染色，×2 0 0）

2.4 各組細胞中Norrin及Livin mRNA表達的比較 經real-time PCR檢測，與對照組相比，中、高劑量組Norrin和Livin的mRNA表達減少（P＜0.05），低劑量組中表達未見明顯改變（P＞0.05）；與低劑量組比較，中、高劑量組Norrin、Livin mRNA表達減少（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組Norrin、Livin mRNA表達減少更加明顯（P＜0.05），詳見表3。

2.5 各組細胞中Norrin和Livin的表達 與對照組比較，中、高劑量組Norrin和Livin表達減少（P＜0.05），低劑量組中表達未見明顯改變（P＞0.05）；與低劑量組比較，中、高劑量組Norrin和Livin表達減少，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組Norrin和Livin表達減少更加明顯（P＜0.05）。見圖3、表4。

表3 各組細胞中N o r r i n及L i v i n m R N A表達的比較

注：與對照組比較，*P＜0.0 5；與低劑量組比較，▲P＜0.0 5；與中等劑量組比較，△P＜0.0 5

圖3 各組細胞中N o r r i n、L i v i n的表達（A:對照組;B:低劑量組;C:中劑量組;D:高劑量組）

表4 各組細胞中N o r r i n、L i v i n的表達

2.6 各組細胞中CDC25A、cyclin A2、p21、cyclin D1表達的比較 與對照組相比，低、中、高劑量組CDC25A、cyclin A2表達均明顯減少，且表達量隨藥物劑量增大而減少，差異均有統計學意義（均P＜0.05），p21、cyclin D1表達則無明顯改變（P＞0.05）；見圖4、表5。

圖4 各組細胞中C D C 2 5 A、c y c l i n A 2、p 2 1、c y c l i n D 1的表達（A:對照組;B:低劑量組;C:中劑量組;D:高劑量組）

表5 各組細胞中C D C 2 5 A、C y c l i n A 2、p 2 1及C y c l i n D 1的表達

3 討論

我國對早期胃癌排查不及時，導致胃癌發現時多為中、晚期，臨床治療以手術、化療相結合為主[11]。但化療藥物具有毒副反應較強、靶向性不明確、易產生耐藥性等缺點，在臨床應用中受到了諸多限制。因此，尋找高效、靶向治療胃癌的方法或藥物已成為目前的研究熱點。有研究發現，柴胡皂苷D抗腫瘤作用是通過增強巨噬細胞游走能力和吞噬能力、抑制腫瘤細胞分裂并誘導凋亡等機制實現的[12]。另有研究證實，柴胡皂苷D可干擾腫瘤細胞S期DNA合成及蛋白質代謝的作用，可明顯抑制腫瘤細胞增殖[13]。

Norrin最早被發現參與眼部血管生成[14]，但近期的研究中發現，Norrin在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，與臨床分期呈正相關；同時發現Norrin可上調抗凋亡因子Mcl-1、Bcl-2和下調促凋亡因子Bax[5]，從多個方面促進腫瘤細胞生長。Livin是近年來新發現的腫瘤抗凋亡因子，目前研究認為，Livin的表達與胃癌細胞轉移速度及分化程度呈正相關[15]。本研究發現，中、高劑量組SGC-7901細胞生長受到抑制，細胞凋亡數量增加；且Transwell結果表明，中、高劑量柴胡皂苷D可明顯Transwell視野下細胞數量，說明柴胡皂苷D可抑制SGC-7901細胞增殖及遷移能力。本研究在分子層面發現，中、高劑量的柴胡皂苷D可明顯下調SGC-7901細胞中Norrin和Livin的表達，且mRNA表達與蛋白結果相一致，提示柴胡皂苷D可能通過減少Norrin、Livin的表達，減少抗凋亡因子的表達，打破了原有凋亡/抗凋亡細胞因子的表達比例，導致SGC-7901細胞凋亡率顯著增加，降低了SGC-7901細胞增殖及遷移能力。

為了深入探究柴胡皂苷D抑制SGC-7901細胞生長、遷移作用的其他相關機制，本研究進一步檢測了細胞周期調節因子CDC25A、cyclin A2、p21和cyclin D1。CDC25A是細胞在G1/S、G2/M轉化中的關鍵因子，可通過對細胞周期蛋白依賴性激酶2-細胞周期素E復合物和CDK2-cyclinA的去磷酸化作用，促進細胞進入S期[16]；cyclin A2是細胞進入分裂周期的必須因子，cyclin A2減少會導致細胞增殖的停止。已有證據證實CDC25A在多種腫瘤疾病中發現其高表達，并與不良轉歸有密切關系[17]。本研究表明，低、中、高劑量柴胡皂苷D均可有效減少SGC-7901細胞CDC25A、cyclin A2的表達，而對細胞周期蛋白依靠性激酶p21和具有促進細胞增值的cyclin D1并無明顯影響[18-19]，說明柴胡皂苷D并不能影響SGC-7901細胞所有的細胞周期，而是通過減少腫瘤細胞內CDC25A、cyclin A2的表達，導致SGC-7901細胞S期阻滯，從而無法合成腫瘤細胞繁殖所需的蛋白及DNA，進而降低SGC-7901細胞增殖能力。值得注意的是，低劑量柴胡皂苷D可對胃癌細胞CDC25A、cyclin A2的表達雖產生一定影響，但并無明顯抑制SGC-7901細胞增殖能力，其原因可能為CDC25A、cyclin A2輕微的減少并不能對SGC-7901細胞的細胞周期產生明顯影響，也可能與培養時間較短有關。另一方面，現階段并無直接證據表明Norrin、Livin與細胞周期蛋白CDC25A、cyclin A2可相互影響，因而推測柴胡皂苷D通過影響細胞周期、促進細胞凋亡等多重作用共同降低胃癌SGC-7901細胞增殖及遷移能力。

綜上所述，柴胡皂苷D可能通過減少SGC-7901細胞中Norrin、Livin、CDC25A及cyclin A2的表達而起到促進凋亡，抑制SGC-7901細胞的生長、遷移作用。下一步將深入研究，證實胃癌組織中Norrin、Livin是否與CDC25A及cyclin A2具有相互影響的作用。

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Effect of saikosaponin D on proliferation and migration of human gastric cancer cell line SGC-7901

ZHANG Xiaohai,ZHANG Hongtao,HU Xiaoding,et al.Department of Internal Medicine,Zhejiang Skin Disease Prevention and Treatment Center,Huzhou 313200，China

Gastric cancer Saikosaponin D Apoptosis Norrin Livin SGC-7901 cell

2 0 1 6-0 8-1 7）

（本文編輯：嚴瑋雯）

d o i：1 0.1 2 0 5 6/j.i s s n.1 0 0 6-2 7 8 5.2 0 1 7.3 9.1 5.2 0 1 6-1 3 0 8

3 1 3 2 0 0杭州，浙江省皮膚病防治研究所內科（張曉海、張洪濤、胡孝定、鐘華）；內蒙古民族大學天然產物化學及功能分子合成自治區重點實驗室（王曦燁）

張曉海，E-m a i l：w y l t e a m@1 6 3.c o m

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of saikosaponin D on the growth and migration of human gastric cancer cell line SGC-7901. Methods Cultured human gastric cancer SGC-7901 cells were divided into control group and low, medium,high dose groups,which were treated with 0,5,10 and 20 μmol/L saikosaponin D,respectively.The cell proliferation was determined by MTT method at 24 h,48 h and 72 h after treatment;apoptosis was detected by fluorescence TUNEL method, cell migration ability was assayed by Transwell method,the expression of Livin and Norrin mRNA was detected by Real-time PCR,the expression of Norrin,LivinCDC25A,cyclin A2,p21 and cyclin D1 proteins was detected by blot Western blotting. Results Compared to control group,the expression of CDC25A cyclin A2 in low dose group was decreased(P＜0.05),however, there were no changes in cell apoptosis and expression of Norrin,Livin,p21 and cyclin D1(P＞0.05),in medium and high dose groups,cell proliferation was significantly inhibited,apoptosis rate was increased(P＜0.05),the expression of Norrin and Livin mRNA was decreased(P＜0.05),the expression CDC25A and cyclin A2 proteins was inhibited in a dose-effective manner(P＜0.05),and there were no changed in expression of p21 and cyclin D1(P＞0.05). Conclusion Saikosaponin D can inhibit the growth and migration of human gastric cancer SGC-7901 cells,which is associated with down-regulating Livin and Norrin expression,interfering with the cell cycle and promoting cell apoptosis.