2014—2017年豬偽狂犬病病原與野毒gE抗體監測數據統計分析與預防對策

牟 迪，夏 偉，唐志芬，張宇輝，朱慶虎，袁 遠，熊永忠

（哈爾濱維科生物技術開發公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬病防制與保健

2014—2017年豬偽狂犬病病原與野毒gE抗體監測數據統計分析與預防對策

牟 迪，夏 偉，唐志芬，張宇輝，朱慶虎，袁 遠，熊永忠

（哈爾濱維科生物技術開發公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬偽狂犬病（Pseudorabies,PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一種高度接觸性傳染病。作為危害全球養豬業最嚴重的豬傳染病之一，感染豬偽狂犬病引起的主要癥狀有種豬繁殖障礙，仔豬呼吸道病綜合征、神經癥狀、腹瀉、生長發育受阻等。20周齡以下的仔豬感染率和死亡率可達100%，成年豬常呈隱性潛伏感染或長期帶毒的狀態，當環境激變或者被其它應激因素激發，往往可與其它病原體協同作用引起多種疾病的發生，從而引起疫病的暴發。目前，我國應用偽狂犬病基因工程缺失疫苗對PR進行免疫，使得該病的流行趨勢有所緩和，但該病的潛伏感染情況還是相當普遍，其臨床癥狀已經從典型轉為非典型，雖死亡率大幅降低，但是卻嚴重影響豬群的生長速度和繁殖性能，給我國養豬業造成嚴重的經濟損失。因此，做好豬場偽狂犬病的病原檢測和血清學檢測，及時清除隱性帶毒豬，對凈化豬群至關重要。為掌握現有的防疫控制體系下我國豬場偽狂犬病感染的狀況，及為有效控制和消滅豬偽狂犬病提供科學依據，哈獸維科技術服務部檢測實驗室于2014—2017年期間共收到全國28個省市443個規模豬場的1 636份病料（淋巴結和腦組織），30個省市874個規模豬場的33 517份血清樣品。通過PCR及ELISA方法對偽狂犬病病原與野毒gE抗體進行檢測與監測，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及分布

1.1.1 病原檢測樣品 樣品來源于全國28個省市443個豬場，樣品包括淋巴結和腦等組織共1 636份，通過調查了解豬場免疫背景和臨床發病情況以及剖檢典型發病豬取組織樣品，-20℃冷凍送檢。

1.1.2 血清樣品 樣品來自全國30個省（直轄市）874個規模化豬場，共33 517份。通過豬前腔靜脈或耳緣靜脈現場采集后送檢實驗室的方式來收集檢測樣品。

1.2 主要試劑和儀器

TaKaRa One Step DNA PCR Kit試劑盒[購自寶生物工程（大連）有限公司]、MEM營養液、DNA提取試劑盒（購自天根生物科技有限公司）、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB、DEP水、瓊脂糖、DL 2 000 Marker。生物安全柜、分析天平、研磨器、高速離心機、迷你掌上離心機、渦旋振蕩器、PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、冰箱、微波爐、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、酶標儀等。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank登陸的PRV的基因序列，用Oligo 6.0軟件設計引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成（表1）。

表1 引物序列

1.4 樣品處理

1.4.1 核酸提取 按檢測需求分別對腦和淋巴結樣品混合，用研磨器充分研磨，利用MEM營養液進行10倍稀釋，然后利用DNA提取試劑盒進行核酸抽提。

1.4.2 待檢血清的制備 血清樣品室溫靜置2～6 h后，3 000 r/min離心15 min，取上清置于滅菌EP管或小瓶內，編號。對于沒有條件分離血清的豬場，室溫靜置，讓其自然析出血清，盡快送達實驗室。處理好的血清均置于-20℃保存備用。

1.5 病毒核酸檢測

用天根生物科技有限公司DNA提取試劑盒，從病毒培養液提取DNA為模板，采用TaKaRa One Step DNA PCR Kit試劑盒進行PCR擴增，反應條件94℃ 2 min；（94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min）× 35個循環，72℃延伸10 min，PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 ELISA檢測

按照豬偽狂犬病病毒gE抗體ELISA檢測試劑盒的操作說明進行。

1.7 結果判定

1.7.1 PCR病原檢測結果判定 PRV陽性對照出現1 245 bp擴增帶，陰性對照無帶出現時，試驗結果成立。被檢樣品出現1 245 bp擴增帶為陽性，否則為陰性。

1.7.2 ELISA檢測結果判定 陰性對照A（650）的平均值減去陽性對照A（650）的平均值必須大于或等于0.3，試驗方能有效。如果S/N值（樣品/陰性對照比率）低于或等于0.60，樣品應判定為PRV gE抗體陽性。如果S/N值大于0.60但小于或等于0.70，樣品應重測。如果試驗結果不變，間隔一定時間后重新采樣、檢測。如果S/N值大于0.70，樣品應判定為PRV gE抗體陰性。

2 結果

2.1 PCR擴增結果

2.1.1 2014年1月至2017年5月對28個省443個規模豬場送檢的1 636份淋巴結和腦等組織樣品，進行了PRV病原的檢測。結果顯示，2014年PRV陽性檢出率12.42%（41/330），2015年PRV陽性檢出率6.50%（24/369），2016年PRV陽性檢出率16.86%（100/593），2017年1—5月PRV陽性檢出率9.01%（31/344），2014年1月至2017年5月總體檢出率為11.98%（196/1 636）（如表2、圖1）。

表2 2014—2017年 PRV病原陽性率

圖1 2014—2017年PRV病原陽性率

2.1.2 病料樣品來自全國28個省市，其中黑龍江、遼寧、山東、福建、江西送檢占比相對較高，湖南、江蘇、青海等地PRV病原檢出率相對較高（表3）。如果按照地區統計，所有地區均存在不同程度的PRV野毒感染情況，其中西北和西南地區豬場的PRV病原陽性率較高（圖2）。

表3 病料來源及PRV病原陽性率

圖2 不同地區PRV gE病原陽性率和PRV gE抗體陽性率

2.2 ELISA檢測結果

2.2.1 應用阻斷ELISA方法對2014年1月至2017年5月期間全國30個省市874個規模化豬場送檢的33 517份血清樣本進行檢測的結果表明，PRV抗體陽性血清12 795份，總體抗體陽性率為38.17%；其中，2014年PRVgE抗體陽性率為26.70%（1721/6 446），2015年PRV gE抗體陽性率為38.07%（2 550/6 699），2016年PRV gE抗體陽性率為43.62%（5 722/13119），2017年1—5月PRV gE抗體陽性率為38.63%（2 802/7 253）（如表4，圖3）。

表4 2014—2017年PRV野毒抗體陽性率

圖3 2014—2017年PRV野毒抗體陽性率

2.2.2 血清樣品來自全國30個省市，其中廣東、遼寧、河北、北京送檢占比相對較高，河南、河北、天津、新疆等地PRV gE抗體陽性率相對較高（表5）。如果按照地區統計，華中和華北地區豬場的PRV gE抗體陽性率較高（圖2）。

表5 血清來源及PRV野毒抗體陽性率

3 討論

3.1 2014年1月至2017年5月通過對全國28個省市443個規模豬場的1 636份淋巴結和腦組織樣品進行檢測，檢測PRV的樣品主要以發病豬腦為主，臨床上表現典型神經癥狀，如肌肉震顫、精神沉郁、口吐白沫等，以哺乳仔豬和保育豬發病為主。部分豬場暴發時以母豬流產、早產、死胎等，保育豬神經癥狀和育成豬嚴重呼吸道病為典型臨床表現。剖檢后腦出血病變嚴重。選用合適的引物，采用PCR方法對PRV病原檢測和數據統計分析得知，2014年PRV陽性檢出率12.42%（41/330），2015年PRV病原陽性檢出率下降為6.50%（24/369），2016年PRV病原陽性檢出率又有所上升，為16.86%（100/593），2017年1—5月PRV病原陽性檢出率9.01%（31/344），相比2016年有所下降。2014年1月至2017年5月總體病原檢出率為11.98%（196/1 636）。

3.2 2014年1月至2017年5月期間，對全國30個省市874個規模化豬場送檢的33 517份血清樣本通過ELISA方法進行PRV gE抗體檢測，結果顯示，2014年PRV gE抗體陽性率為26.70%（1 721/6 446），2015年PRV gE抗體陽性率上升為38.07%（2 550/ 6 699），2016年檢測PRV gE抗體陽性率繼續上升，達到43.62%（5 722/13 119），2017年1—5月PRV gE抗體陽性率略有下降，為38.63%（2 802/7 253），2014年1月至2017年5月總的PRV gE抗體陽性率為38.17%（12 795/33 517）。通過數據可以看出，我國豬場豬偽狂犬病野毒感染依然嚴重。

3.3 對不同地理分布豬場的調查中發現，我國西北地區的偽狂犬病病原檢出率（25.00%）最高，其次為西南地區（16.44%）。而在PRV gE抗體檢測方面，華中地區（58.65%）和華北地區（51.46%）PRV gE抗體陽性率較高。不同地區檢出率的差異與區域內豬場的疫苗防疫、飼養管理、生物安全等諸多因素有關。調查結果顯示檢測的874家豬場沒有偽狂犬病野毒gE抗體陰性場，對于豬偽狂犬病的防制甚至凈化，情況不容樂觀。

3.4 做好豬場偽狂犬病的控制與凈化包含疫苗免疫、生物安全和飼養管理等各個方面的工作。對于疫苗的免疫，針對如今的豬偽狂犬病流行情況，推薦種公豬/母豬1年普免3～4次，2頭份/頭，仔豬1～3日齡滴鼻1頭份/頭（PRV-gE抗體陰性的豬場可不滴鼻），45～55日齡二免2頭份/頭，90～100日齡三免2頭份/頭。由于存在種豬帶毒導致豬場暴發豬偽狂犬病，或者繼發其它疾病的危險。因此，豬場要做好種豬場偽狂犬病的病原檢測和血清學監測。對于帶毒種豬要及時清除，凈化豬群。在疫苗免疫的同時，做好生物安全措施，加強飼養管理，才能很好地控制以及凈化豬偽狂犬病。

（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2017)04-0089-03

2017-07-03

牟 迪（1988-），男，吉林伊通人，碩士，主要從事動物疫苗技術服務工作.E-mail：281032446@qq.com