大約克種豬抗腹瀉新品系導入新血緣

龍清孟，熊勝利，代興洪，馮文武，侯 萍，金 敏，王錦鳳，龔 菲，申金蓉，冉雪琴（.貴州省種畜禽種質測定中心，貴州 貴陽 55008；.貴州大學，貴州 貴陽 55005）

大約克種豬抗腹瀉新品系導入新血緣

龍清孟1，熊勝利1，代興洪1，馮文武1，侯 萍1，金 敏1，王錦鳳1，龔 菲1，申金蓉1，冉雪琴2（1.貴州省種畜禽種質測定中心，貴州 貴陽 550018；2.貴州大學，貴州 貴陽 550025）

引起斷奶前后仔豬腹瀉的主要致病菌是豬腸毒素性大腸桿菌（ETEC），而F4ac型是ETEC中流行性最為廣泛的類型。試驗在貴州省種畜禽測定中心種豬場內進行，試驗豬群為已經選育出的美系大約克抗腹瀉專門化新品系，試驗目的是對已經培育出的美系大約克抗腹瀉專門化新品系，導入加系大約克血緣，避免新品系在閉鎖選育中出現近親衰退。2016年7月引種，9月9日對引進的22頭加系大約克種豬采樣，送往貴州大學動物科學院對豬腸毒素性大腸桿菌（ETEC）F4ac的受體基因MUC13進行基因型鑒別。結果顯示，GG基因型頻率為13.64%（3/22）、GA基因型頻率68.18%（15/22）、AA基因型頻率18.18%（4/22），G基因頻率0.477 3、A基因頻率0.522 7。在保留引進加系大約克血統需要的前提下，將腹瀉抗性基因GG型個體直接選入美系大約克抗腹瀉新品系群體，同時，盡可能保留繁殖性能較為優(yōu)秀的GA、AA基因型個體，與原有的美系抗腹瀉種豬按照不同選配組合方案進行配種：GA♂×GG♀、GG♂×GA♀、GG♂×AA♀、AA♂×GG♀，在世代選育中逐漸加大后代腹瀉抗性有利基因型GG個體選留力度，將腹瀉抗性有利基因GG型個體選入抗腹瀉新品系中，最終實現腹瀉抗性有利基因血緣更新，并純繁推廣。

引進加系；大約克種豬；抗腹瀉基因；腹瀉抗性新品系；導入新血緣

腸毒素性大腸桿菌（ETEC）F4ac是引發(fā)新生仔豬和斷奶前仔豬腹瀉的最主要致病菌[1-2]。F4ac型是腸毒素性大腸桿菌ETEC（F4）菌毛3種血清型（F4ab型、F4ac型、F4ad型）中致病性最強、流行性最廣的一類[3-4]。在世界范圍內，腸毒素性大腸桿菌（ETEC）感染導致的仔豬腹瀉每年都給養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經濟損失[5-6]。在養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的瑞典、英國和丹麥，新生仔豬腹瀉的發(fā)生率分別為75.0%、50.5%和36.6%[7-8]。我國仔豬腹瀉的發(fā)生率也很高，2012年對國內某省4 118個養(yǎng)豬場戶進行的流行病學調查發(fā)現，哺乳仔豬腹瀉發(fā)生率高達18.31%、死亡率在10.44%～57.01%之間[9-10]。早年在豬流行性腹瀉病毒還沒被大量報道之前，我國仔豬腹瀉的發(fā)生率全年平均高達46.5%[11]，個別地區(qū)甚至更高。近年來更是出現豬流行性腹瀉病毒和ETEC混合感染導致仔豬大面積發(fā)生腹瀉和死亡的事件。因此，進行腸毒性大腸桿菌（ETEC）F4ac腹瀉基因的選育，培育抗腹瀉新品系，可以從種源上最大限度控制新生仔豬及斷奶前仔豬的腹瀉發(fā)生率，從而提高豬場的經濟效益和國外引進種豬的使用價值。

本中心豬場曾對引進美國大約克種豬基礎豬群采耳樣組織，送往江西農業(yè)大學進行抗腹瀉基因檢測研究，結果顯示，大約克種豬在MUC13基因的腹瀉抗性等位基因GG型的頻率為16.79%（23/137），G基因頻率為0.46，腹瀉易感不利等位基因（A）基因頻率為0.54[12-13]。這一檢測結果表明，利用分子育種技術輔助育種，兼顧選留表型和生產性能優(yōu)秀個體，逐世代加大GG純合抗性個體的選留比例，逐步淘汰AA和AG易感基因型個體，可使育種豬群中有利基因頻率提高，最終建立抗K88（F4ac）腹瀉專門化品系。近年來，測定中心的技術人員，致力于研究國外引進種豬抗性新品系的培育工作及推廣應用。種豬場在世代選育中采用抗腹瀉基因檢測技術，保留腹瀉抗性有利基因GG型個體，組建核心群種豬抗腹瀉新品系，建立大約克種豬抗腹瀉選育示范點。測定中心技術人員開展了大約克種豬6個不同基因型的組合配種方案：GG♂×GG♀、GA♀×GG♂、GA♂×GA♀、AA♂×GG♀、AA♂×GA♀、AA♂×AA♀，在相同的飼養(yǎng)環(huán)境條件下，跟蹤觀察其哺乳仔豬腹瀉發(fā)生率、腹瀉致死率、其他原因致死率、斷奶成活率，結果表明，不同組合選配所生仔豬在哺乳期間的腹瀉發(fā)生率相應為2.71%、26.44%、46.18%、30.32%、40.96%、44.14%，其后代腹瀉致死率相應為0、3.07%、6.49%、3.94%、11.65%、12.5%，其哺乳仔豬其他原因致死率相應為0.78%、1.92%、2.67%、1.97%、4.42%、5.08%，其斷奶成活率相應為 99.22%、95.02%、90.84%、94.09%、83.94%、82.42%[12]。研究表明，組合選配優(yōu)秀情況依次為GG♂×GG♀>GA♀× GG♂>AA♂×GG♀>GA♂×GA♀>AA♂×GA♀>AA♂×AA♀。在初步建立大約克抗腹瀉新品系的基礎上，2016年7月引進加系大約克種豬22頭，導入新血緣。引進種豬抗腹瀉基因檢測及不同基因型個體選配計劃如下。

1 材料與方法

1.1 樣品

貴州省種畜禽種質測定中心2016年7月新引進的5月齡加系大約克種豬22頭，在隔離觀察期滿、健康檢查各項指標合格后，9月9日采用前腔靜脈采血（22份），送貴州大學動物科學院冉雪琴教授的實驗室進行抗腹瀉基因的檢測研究。每份血樣10 mL（全血），于離心管中-20℃保存，采用天根生化科技（北京）有限公司生產的血液基因組DNA提取試劑盒制備基因組DNA，作為PCR檢測的模板。

1.2 主要試驗儀器設備

①離心機（Avanti-J30I），美國貝克曼庫爾特公司生產；②制冰機（banshen），美國Grant公司生產；③凝膠成像系統（GelDocXR），美國Bio-rad公司生產；④熒光定量PCR儀（MyCycler），美國Bio-rad公司生產；⑤標準型凈化工作臺（SW-CJ-IFD），上海錦星科學儀器有限公司生產；⑥電泳儀（DYY．III2穩(wěn)壓電泳儀），北京六一儀器廠生產；⑦-80℃超低溫冰箱，美國Thermo公司生產；⑧水浴恒溫鍋（SHZ-82），中國金壇市醫(yī)療儀器廠生產。

1.3 PCR擴增

根據GenBank上公布的豬MUC13基因序列設計4條特異性引物（表1），由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

表1 引物序列

PCR反應體系為10 μL：2×PCR mix 5.0 μL，引物（10 pmol/L）各0.5 μL，基因組DNA（100 ng/μL）1.0 μL，雙蒸水補足10 μL體積。擴增條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃/63℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 試驗結果

2.1 基因型檢測結果

將電泳得到的83 bp條帶定為G基因，173 bp條帶定為A基因；那么只有1條173 bp條帶的樣品則定義為AA基因型個體，只有1條83 bp條帶的樣品則定義為GG基因型個體，而既有173 bp條帶、又有83 bp條帶的樣品則為雜合的AG基因型。圖1為AA基因型和GG基因型檢測結果。

圖1 引進加系大約克種豬抗腹瀉有利基因GG型及易感基因AA型

2.2 克隆測序

將得到的173 bp和83 bp兩種條帶分別切膠回收，連接T-載體，送基因公司克隆測序。根據峰的移動位置確定該延伸產物對應的SNP位點，根據峰的顏色可得知摻入的堿基種類，證實擴增片段確為MUC13基因，位于內含子7當中，并證實相應位置的堿基確為G或A。

2.3 引進加系大約克種豬抗腹瀉基因檢測結果

由表2可知，GG型個體3頭（1公2母），GA型個體15頭（全部為母豬），AA型個體4頭（1公3母）。

表2 22頭新引進的5月齡加系大約克種豬抗腹瀉基因檢測結果及選配計劃

2.4 MUC13基因的基因型頻率和基因頻率

由表3可知，新引進的5月齡加系大約克GG基因型13.64%（3/22）、GA基因型頻率68.18%（15/ 22）、AA基因型頻率18.18%（4/22），G基因頻率47.73%、A基因頻率52.27%。

表3 新引進22頭加系大約克豬MUC13基因的基因型頻率和基因頻率

3 分析與討論

3.1 抗性新品系建立后導入新的血緣

在純種繁育場已建立健全血統、系譜完整的抗性新品系，并且在抗腹瀉新品系穩(wěn)定的情況下，通過引種導入新血緣，避免重蹈閉鎖選育的覆轍。

（1）首先，通過對引進加系大約克種豬的檢測，明確豬腸毒素性大腸桿菌（ETEC）F4ac的受體基因MUC13的基因型。

本次研究結果顯示，引進加系大約克種豬在MUC13基因GG基因型頻率13.64%（3/22）、GA基因型頻率68.18%（15/22）、AA基因型頻率18.18%（4/22），G基因頻率0.477 3、A基因頻率0.522 7，這一檢測結果與美系大約克種豬GG基因型頻率為16.79%（23/137）、GA基因型頻率59.12%（81/137）、AA基因型頻率24.10%（33/137），G基因頻率為0.46、A基因頻率為0.54[12-13]的結果基本一致。

（2）其次，在明確豬群受體MUC13基因型的基礎上，優(yōu)先考慮選配方案為GG♂×GG♀。

在考慮引進種豬的血統、繁殖性能、表型等指標的前提，將新引進加系大約克與原有美系大約克或新引進加系之間，按照GG♂×GG♀選配，加大世代抗腹瀉基因GG型個體選育力度，每年根據血統需要選留體型外貌、生產性能等優(yōu)秀的個體作為后備種豬，進入腹瀉抗性新品系群體。

（3）再次，將新引進加系大約克與原有美系大約克、或加系與加系豬、美系與美系之間依次考慮GA♂×GG♀、GG♂×GA♀、GG♀×AA♂、GA♂×AA♀、GA♂×GA♀等配種方案。

依據前人的研究結果和我們的檢測分析，對后備種豬和基礎種豬進行選擇時，選育時首先把生產性能、體型外貌都表現優(yōu)秀的GG基因型個體作為種公豬和種母豬進行擴繁。本研究根據生產需要，盡可能保全豬場血統，對繁殖性能、體型外貌優(yōu)秀的GA型、AA型個體，可考慮采用GA♂×GG♀、GG♂×GA♀、AA♂×GG♀、GG♂×AA♀、GA♂×GA♀等配種方案，最終選留到抗腹瀉基因GG型優(yōu)秀個體，再逐步淘汰基因GA型、AA型個體。

3.2 大約克種豬腹瀉抗性新品系的選育需要足夠長的時間

測定中心對自己豬場繁殖群的研究表明，豬腸毒素性大腸桿菌（ETEC）F4ac的受體基因MUC13抗腹瀉有利基因GG基因型頻率和G基因頻率大約克繁殖群分別為16.79%（23/137）、0.47；在杜洛克繁殖群分別高達86.05%（37/43）、0.92；而在長白豬繁殖群中分別為40.74%（11/27）、0.47[13]。這一結果說明，在抗腹瀉有利基因GG基因型頻率和G基因頻率上，大約克豬群<長白豬群<杜洛克豬群，在世代選育中，大約克比長白豬群、杜洛克豬群較難選育出純合腹瀉抗性GG型個體，完全建立抗腹瀉新品系的時間相對較長。

純種大約克抗腹瀉新品系在世代選育中，需要考慮保全種豬血統、兼顧生產性能及表型等指標。因此，在兼顧種豬血統、生產性能、體型外貌選育基礎上，不僅需要保留抗腹瀉有利基因GG型個體，同時有必要將生產性能、體型外貌都表現優(yōu)秀的腹瀉易感基因型GA、AA型個體先保留下，按照GG♂×GA♀、GA♂×GG♀、GG♂×AA♀、AA♂×GG♀、GA♂×GA♀等選配組合，最終選育出該血統抗腹瀉GG型后代作為后備種豬，再逐步淘汰腹瀉易感基因型GA型父本、母本，建立血統較為完善的新品系。對以上5個組合選配的后代，如果采用整窩仔豬都作抗腹瀉基因檢測，那么，檢出GG型的個體長大后也不一定能作為后備豬，這一方法增加了新品系選育的成本；如果是按照常規(guī)選育選留后備豬，再對選留后備豬采樣作抗腹瀉基因檢測，所選留的豬不一定都檢出抗腹瀉基因GG型個體，可能只有一定比例的后備豬檢出抗腹瀉GG型，所以采用這種選育方案就需要選留足夠數量的后備豬，因為不一定在F1代中檢出GG型個體，可能在F2代甚至F3代中才能選留到抗腹瀉基因型GG個體作為后代。因此，大約克多個血統抗腹瀉新品系的選育，需要相對足夠長的時間（3～6年），才能圓滿完成選育研究任務。

3.3 雜交利用

抗性新品系進行雜交利用，其后代的腹瀉抗性情況有待于進一步深入研究。

[1]唐建紅，鄧政，林峰，等.抗仔豬斷奶前腹瀉豬專門化新品系的培育[J].豬業(yè)科學，2013（10）：102-105.

[2]Kolotilin I,Kaldis A,Devriendt B,et al．Production of a subunit vaccine candidate against porcine post-weaning diarrhea inhigh-biomass transplastomic tobacco[J].PLoS One,2012,7(8): e42405.

[3]Joller D,Jorgensen C B,Bertschinger H U,et al.Vogeli P Refined localization of the Escherichia coli F4ab/F4ac receptor locus on pig chromosome 13[J].Animal Genetics,2009,40(5): 749-752.

[4]Ren J,Yah X,Ai H,et al.Susceptibility towards enterotoxigenic Escherichia coli F4ac diarrhea is governed by the MUC13 gene in pigs[J].PLoS One,2012,7(9):e44573.

[5]Zhang Francis D H.Genetic fusions of heat-labile toxoid(LT) and Heat-stable toxin b(STb)of porcine enterotoxigenic Escherichiacolielicitprotectiveanti-LTandanti-STbantibodies[J]. Clinical and Vaccine Immunology,2010,l7(8):1223-1231.

[6]Zanello G Berri M,Dupont J,et al.Saccharomyces cerevisiae modulates immune gene expressions and inhibits ETEC mediated ERK1/2 and p38 signaling pathwaysinintestinal epithelial ceils[J].PLoSOne,2011,6(4):e18573.

[7]Pearce G P.Epidemiology of entericdisease in grower-finisherpigs:apostal surveyof pig producers inEngland[J].The Veterinary record,1999,144:338-342.

[8]Johansen M,Alban L,Kj?rsgaard H D,et al.Factors Influencing the Weight Gain of Piglets[C]//Proceedings of the 17th International Pig Veterinary Society Congress.(Iowa,U.S.A), 2002,1:227.

[9]趙明軍，閏若潛，盛敏，等.仔豬腹瀉病流行形勢與防控措施[J].養(yǎng)豬，2013（2）：109-110.

[10]龍清孟，熊勝利，龔菲，等.從規(guī)模化豬場仔豬死亡數據分析研究提高仔豬成活率對策[J].豬業(yè)科學，2014（8）：113-116.

[11]王紅寧.仔豬腹瀉成因及綜合防治技術措施[J].中國畜牧雜志，2006，42（6）：58-60.

[12]熊勝利，龍清孟，陳大芳，等.對引進美國SPF大約克種豬抗腹瀉后代選育探討[J].養(yǎng)豬，2013（5）：49-50.

[13]熊勝利，龍清孟，陳大芳，等.抗病育種技術在引進美國SPF種豬后代選育中應用探究[J].養(yǎng)豬，2014（3）：73-74.

（感謝貴州大學動物科學學院冉雪琴教授對項目研究的大力幫助！）

（編輯：富春妮）

白面包和全麥面包哪個更好

【美國《發(fā)現》月刊網站6月6日文章】題：面包之爭：工業(yè)白面包還是手工全麥面包？（作者 卡爾·恩格爾金）

做三明治時更加健康的選擇是哪個：工業(yè)加工的白面包，還是手工制作的全麥面包？

對于想知道這種熱烈爭論的問題明確而且非黑即白答案的人，我們要先表示歉意。答案是兩個都好，因人而異。

這個結論來自以色列的魏茨曼科學研究所，該研究所近期對比了吃白面包或全麥面包以獲得大量卡路里的飲食方式的短期健康影響。在隨機化的試驗中，科學家要求20名健康的人增加一周的面包攝入量—從每天占卡路里攝入量的10%提升到占25%。一半的參與者食用工業(yè)的白面包補充面包攝入量，而另一半吃當地面包店準備的全麥面包。

第一周結束后，所有參與者在所謂的清除階段的兩周內完全不吃面包。然后再重復試驗，但這次是第一周吃白面包的人改吃全麥面包，吃全麥面包的人改吃白面包。

在每一個試驗階段之前、之中和之后，研究人員檢測了參與者的一系列健康指標：清晨血糖水平、炎癥和組織損傷的標記、膽固醇水平、腎和肝的各種酶以及維生素和礦物質水平。研究人員還采集了每個人的糞便樣本，以評估每個人的微生物情況，也就是每個人肚子里的細菌。

簡而言之，每個人的結果都不同。一些人在轉變?yōu)槌园酌姘院笮玛惔x反應變得更好，而其他人在吃全麥面包的時候表現更好。研究人員把整組數據放在一起平均以后，結果沒有什么用—白面包和全麥面包之間不存在臨床上具有顯著意義的區(qū)別。6日研究人員把該成果發(fā)表在《細胞-代謝》月刊上。

但是有個重要的解釋：所有參與者都攝入了同樣量的碳水化合物，而全麥面包所含的碳水化合物較少，因此表明參與者吃的全麥面包多于白面包。

該研究的作者之一亞伯拉罕·利維說：“我們沒有考慮到你會吃多少是建立在你感覺多飽的基礎上，所以還需要進一步研究。”

研究人員表示，他們的研究鼓勵大家不要聽信一些不合理的理論，也不要跟從統一的飲食建議，而是更應該關注每個人的不同之處。2015年，魏茨曼科學研究所的同一個團隊要求800個人吃完全相同的東西，每個人代謝食物方式都不同。換句話說，對一個人來說健康的飲食可能對另一個人來說就不健康。

該研究的作者之一埃蘭·埃利納夫說：“迄今為止，食物的營養(yǎng)價值都是基于最基本的科學計算出來的，不存在適合所有人的單一飲食方式。”

（轉自參考消息[N]，2017-06-17）

S828.8

A

1002-1957(2017)04-0053-04

2017-06-06收稿，2017-07-03修回

貴州省農業(yè)攻關課題[黔科合NY字（2012）3061號]；貴州省農委2009年立項—引進美國良種豬場口蹄疫、豬瘟等重大傳染性疾病防控技術研究

龍清孟（1973-），女，貴州松桃人，高級獸醫(yī)師，碩士，主要從事引進國外良種豬的選種選育、疫病防控與技術推廣工作. E-mail:lqingmeng@sina.com

冉雪琴（1968-），女，重慶人，教授，碩士生導師，博士，研究方向為動物生理學與分子生物學.E-mail:rxueq@yahoo.com.cn