低溫脅迫下短枝木麻黃耐寒相關基因的差異表達分析*

李 楠 鄭勇奇 丁紅梅 柳新紅 盛煒彤 江 波 李海波

(1.中國林業科學研究院林業研究所 國家林業局林木培育重點實驗室 北京 100091；2.浙江省林業科學研究院 杭州310023； 3.浙江中醫藥大學 杭州 310053)

低溫脅迫下短枝木麻黃耐寒相關基因的差異表達分析*

李 楠1,2鄭勇奇1丁紅梅3柳新紅2盛煒彤1江 波2李海波2

(1.中國林業科學研究院林業研究所 國家林業局林木培育重點實驗室 北京 100091；2.浙江省林業科學研究院 杭州310023； 3.浙江中醫藥大學 杭州 310053)

【目的】 對6個耐寒相關調控基因(RAP2.7，ABR1，AtHSFA6B，AtbZIP44，GRXC6和HSP18.2)在耐寒和不耐寒木麻黃種質中精細表達模式進行分析，為深入解析木麻黃耐寒的分子機制提供理論基礎。【方法】 測定耐寒(ZS7)和不耐寒(HN1)2種短枝木麻黃無性系在-2 ～-11 ℃低溫脅迫下的相對電導率，基于Logistic方程對處理溫度和對應的相對電導率進行擬合，計算低溫半致死溫度(LT50)。根據前期轉錄組測序得到的6個耐寒相關調控基因的EST序列設計特異引物，利用逆轉錄實時熒光定量PCR分析6個基因在-2，-5，-8 ℃連續3個溫度梯度脅迫下的表達差異，以及在-5 ℃低溫下連續脅迫1，2，5，8，16，24，48，72 h后，在耐寒和不耐寒短枝木麻黃無性系中的精細表達模式?；蛳鄬Ρ磉_量的計算采用2-ΔΔCT法。【結果】 在低溫脅迫下，耐寒和不耐寒短枝木麻黃無性系的相對電導率存在極顯著差異(P<0.01)，低溫半致死溫度分別為-5.92 ℃和-2.87 ℃。在常溫條件下，6個基因在耐寒和不耐寒種質中的相對表達量皆無明顯差異。在臨近不耐寒種質半致死溫度的-2 ℃下持續2 h后，6個耐寒相關基因在不耐寒種質中的表達被強烈抑制，而在耐寒種質中的表達被激活； 在臨近耐寒種質半致死溫度的-5 ℃下持續2 h后，不耐寒種質中的各基因被進一步抑制，同時在耐寒種質中的表達亦被強烈抑制； 在低于半致死溫度的-8 ℃下持續2 h后，各基因的表達繼續受到抑制。對在臨近耐寒種質半致死溫度的-5 ℃脅迫下，耐寒種質和不耐寒種質的精細表達模式分析表明，在-5 ℃低溫脅迫下，耐寒種質中6個基因的表達在8 h后開始呈現極顯著上調，表達量最高值集中在低溫脅迫后的第8，24，48 h； 不耐寒種質中6個基因的表達在1～16 h內皆呈現極顯著下調，表達量最低值集中在1～5 h內?！窘Y論】 在耐寒相關調控基因的表達水平上，耐寒和不耐寒短枝木麻黃對低溫的應答機制明顯不同。低溫激活了耐寒種質中轉錄因子、ROS家族基因、ROS應答因子等調控基因的增強表達以抵御和適應逆境脅迫，但抑制了在不耐寒種質中的表達，顯著降低了不耐寒種質對低溫逆境的耐受能力。該研究在一定程度上對于豐富木麻黃適應低溫的分子機制，以及耐寒無性系的分子選育都具有一定的參考價值。

短枝木麻黃； 低溫凍害； 耐寒性； 基因表達； 分子選育

木麻黃科 (Casuarinaceae) 植物包含了4個屬96個種(Wilsonetal.,1989)，為常綠喬木或灌木，該科植物常被統稱為木麻黃，天然分布于東南亞地區、太平洋西南群島和澳大利亞地區。我國自20世紀50年代從國外引進木麻黃，目前已擁有人工林30萬hm2(仲崇祿等， 2005)。短枝木麻黃(Casuarinaequisetifolia)、細枝木麻黃(C.cunninghamiana)、粗枝木麻黃(C.glauca)和山地木麻黃(C.junghuhniana)是我國人工栽培面積最廣泛的4個種(Zhongetal., 2010)。木麻黃植物對我國沿海陸地生態系統的恢復、沿海自然災害的防御、貧瘠沿海沙地和嚴重退化的南方山區丘陵地區的土壤改良等均有重要作用，特別在沿海前沿沙質地帶仍是無可替代的樹種(陳彥等， 2005； 張云生等， 2002； 仲崇祿等， 2005)。浙江省自20世紀60年代開始向臺州、寧波、舟山沿海地區引種，短枝木麻黃已經成為浙江省海岸線的重要防護林樹種(何貴平等， 2011； 張昕等， 2011)。然而，木麻黃生長適溫在22.1～26.9 ℃，耐寒性較差(Duke, 1983)。引種的木麻黃常遭受較嚴重凍害，給沿海防護林建設造成較大損失。低溫凍害已成為了擴大木麻黃種植范圍和推進沿海防護林建設的主要制約因素。因此，研究木麻黃的耐寒機制和性能，提高木麻黃的耐寒適應性，推進木麻黃耐寒品種的選育，是當前沿海防護林工程建設中迫切需要解決的瓶頸問題。

迄今為止，國內外對木麻黃樹種耐寒性的研究基本上還停留在抗性生理指標的測定分析以及對耐寒無性系或實生苗田間選育的階段，從分子水平上對木麻黃耐寒機制的研究非常匱乏(仲崇祿等， 1998； 柯玉鑄等， 2000； 葉功富等， 2004； 2008； 王泳等， 2005； 薛揚等， 2008； 2012； 何貴平等， 2011； 張勇等， 2011； 武沖等， 2012； 鄔金等， 2013)。第2代高通量測序技術研究轉錄組具有快速得到基因表達譜變化、精確分析轉錄本的SSR、SNP位點和可變剪接變異，以及發現低豐度轉錄本和新轉錄本的獨特優勢，被廣泛應用于植物冷適應和低溫響應機制的研究(Marionietal., 2008； Lietal., 2012； Toralesetal., 2013； Tianetal., 2013； Wangetal., 2014)。鑒于這一優勢，為了從低溫應答基因的表達水平上全面解析木麻黃的耐寒機制，在前期研究中對從浙江省舟山選育出的短枝木麻黃耐寒無性系(ZS7)在低溫脅迫過程中的轉錄組測序，鑒定出了一批與信號轉導、碳水化合物合成、次生代謝以及抗氧化酶等代謝途徑相關的差異表達基因，其中包括64個與耐寒相關的轉錄因子家族基因、20個與耐寒相關的ROS家族基因成員和24個在低溫脅迫下的ROS應答基因(Lietal., 2017)。為了進一步了解這些差異表達基因在低溫脅迫過程中的精細表達規律，在本研究中，選用短枝木麻黃耐寒無性系ZS7和不耐寒無性系HN1為種質材料，通過電導率和致死溫度來反映不同耐寒種質在生理水平上的差異，并進一步從分子水平上，利用實時熒光定量 PCR(quantitative Real-Time PCR，qPCR)研究不同耐寒種質在低溫脅迫過程中的基因表達規律及表達差異，以期為深入解析木麻黃的耐寒機制提供參考，為推進木麻黃耐寒品種分子選育提供有價值的候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以來自舟山的短枝木麻黃耐寒無性系ZS7和海南的不耐寒無性系HN1為供試材料。用于生理測試的供試材料種植于浙江省林業科學研究院苗圃，各取5株1年生無性系正常生長的枝條(包括葉和小枝)用于低溫梯度脅迫試驗(王泳等， 2005； 何貴平等， 2011)。低溫脅迫試驗模擬自然界降溫過程，先將供試材料在低溫人工氣候箱(PRXD-300，上海喬躍)中從常溫(RT)預冷至10 ℃左右，之后逐步降溫至-2，-5，-8，-11 ℃，在降至每個低溫節點持續2 h后，各取出12個枝條測定電導率和致死溫度。12個枝條等分為3份作為3個重復。

用于分子試驗的供試材料采用盆栽方式，在浙江省林業科學研究院溫室進行扦插繁殖。塑料盆尺寸為13 cm(高)×20 cm(直徑)。盆栽基質為泥炭和蛭石混合物(4∶1)，裝盆前進行滅菌處理。培養條件為： 光照16 h，溫度25 ℃，光強180 μmoL·m-2s-1，相對濕度60%～70%。在溫室中培養2個月后，扦插苗高度達到15～20 cm時，選取生長良好、長勢較一致的植株，開始低溫處理。Ⅰ)低溫梯度處理設計： 參照上述用于電導率測定的低溫梯度脅迫試驗。將ZS7和HN1無性系置于低溫人工氣候箱中，從常溫(RT)預冷至10 ℃左右，之后逐步降溫至-2，-5，-8 ℃，在降至每個低溫節點持續2 h后，各取出5株，取幼嫩枝條用錫箔紙包裹后迅速放入液氮中，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存、備用。以在常溫25 ℃下同步培養的ZS7和HN1無性系作為2種低溫處理的對照，取樣方法同上。將每次取樣的5株幼嫩枝條剪碎后混合，等分為3份作為3個重復，用于RNA的提取、qPCR試驗。Ⅱ)連續低溫處理設計： 將ZS7和HN1無性系各40株移入低溫人工氣候箱內，在-5 ℃下連續處理1，2，5，8，16，24，48，72 h，并于每個時間點分別取ZS7和HN1的5株幼嫩枝條，用錫箔紙包裹后迅速放入液氮中，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存、備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 電導率、致死溫度測定 細胞膜透性測定采用電導法(劉會超等， 2008； 李迎春等， 2012)。應用Logistic方程y=k/(1+ae-bx)對處理溫度和對應的相對電導率進行擬合，并得出低溫半致死溫度LT50(朱根海等， 1986)。式中：y為低溫處理下的相對電導率；x為處理溫度；k、a和b均為方程的參數，k為y的最大極限值，b反映了x和y之間的對應關系，a表示曲線對原點的相對位置。推導 Logistic 方程的二階導數并令其為零，計算方程的拐點溫度 LT50。

1.2.2 總RNA提取與cDNA合成 采用離心柱型RNA Prep Pure Plant Kit試劑盒(TIANGE，北京天根)提取短枝木麻黃幼嫩枝條的總RNA，提取方法參照試劑盒的操作說明。總RNA樣品經NanoDrop 2000超微量分光光度計(Thermo Scientific，美國熱電)測定濃度及純度。將質量檢測合格的總RNA樣品用于qPCR反應合成cDNA。cDNA合成采用進行qPCR反應的專用逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(TAKARA，大連寶生)，逆轉錄方法參照試劑盒的操作說明。

1.2.3 qPCR候選基因與引物設計 用于qPCR分析的6個差異表達基因及特異引物見表1。選擇組成型表達的UBCE(ubiquitin-conjugating enzyme)作為內參基因。特異引物的設計利用Oligo 6.54軟件(MBI，USA)。引物合成由北京擎科新業生物技術(TSINGKE)有限公司完成。

1.2.4 qPCR qPCR分析在ABI ViiA7實時熒光定量PCR儀(ABI ViiA 7 Real Time PCR System，Applied Biosystems，USA)上進行，采用ABI SYBR? Select Master Mix試劑盒，方法參照試劑盒的操作說明。具體為，在20 μL的反應體系中，包含2×SYBR? Select Master Mix 10 μL、Forward Primer (10 pmol·μL-1) 1 μL、Reverse Primer (10 pmol·μL-1) 1 μL、cDNA模板1 μL、RNase Free ddH2O 7 μL。擴增程序為： 95 ℃預變性2 min； 95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸各40 s，共50個循環。每個擴增反應重復3次。擴增反應結束后利用熔解曲線檢測產物特異性： 將該反應體系從60 ℃緩慢升溫至95 ℃，每升高1 ℃采集5次熒光信號。

表1 用于本研究的短枝木麻黃候選基因及qPCR引物①

①R2表示標準曲線(cDNA模板濃度與CT值)的相關系數。R2represent the correlation coefficient of standard curve (cDNA templet concentration and circulated threshold).

1.3 數據分析

采用2-ΔΔCT法計算qPCR試驗中的基因相對表達量，計算公式為： 基因相對表達量=2-ΔΔCT。其中，ΔΔCT計算公式為： ΔΔCT=ΔCT(試驗組)-ΔCT(對照組)； 試驗組或對照組的ΔCT計算公式為： ΔCT=CT(目的基因)-CT(內參基因)。為了驗證qPCR反應的擴增效率，將cDNA模板濃度經5倍梯度稀釋，用目的基因與內參基因的qPCR引物進行擴增得到CT值，每個模板重復3次，得到標準曲線。根據標準曲線的相關系數(R2)和斜率(slope)，計算得到擴增效率E=10-1-slope-1。利用Excel 2010、Origin 7.5和SPSS 18.0統計分析軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同耐寒型短枝木麻黃無性系在低溫脅迫下的相對電導率變化

低溫引起的細胞膜結構破壞是導致植物低溫損傷和死亡的根本原因。相對電導率可作為鑒定植物耐寒性的指標。在低溫脅迫下，2種供試材料的相對電導率變化見圖1。短枝木麻黃耐寒無性系ZS7和不耐寒無性系HN1葉片的相對電導率均隨溫度的降低而升高，總體呈S型曲線的變化趨勢。在每個脅迫溫度下，ZS7和HN1的相對電導率均存在極顯著差異(P<0.01)。在-2 ℃到-8 ℃脅迫期間，耐寒ZS7的相對電導率上升幅度較大，在-8 ℃到-11 ℃趨于緩慢。不耐寒HN1在-2 ℃到-5 ℃相對電導率迅速升高，在-5 ℃到-11 ℃趨于緩慢。該結果表明，HN1在-5 ℃下細胞膜透性已經遭到破壞，呈不可逆的狀態，而耐寒ZS7相對電導率的變化從-8 ℃才開始趨緩，表明耐寒ZS7葉片的質膜穩定性比不耐寒HN1高，受低溫傷害程度較輕，體現出了較強的耐寒性。

圖1 低溫脅迫下2種短枝木麻黃無性系葉片的相對電導率變化Fig.1 Changes of relative electric conductivity in leaves of two Casuarina equisetifolia clones under low temperature stress同一曲線不同小寫字母和大寫字母分別表示該無性系葉片在不同溫度下相對電導率之間差異顯著(P<0.05)、極顯著(P< 0.01)。Different small and capital letters in the same curve represent significant (P<0.05) and highly significant (P<0.01) difference between relative electric conductivity in leaves of the clone at various temperatures, respectively．

2.2 不同耐寒性短枝木麻黃無性系的低溫半致死溫度

低溫半致死溫度(half-lethal temperature，LT50)是指電解質滲出率達到50%時的溫度，可用于評價一個物種的耐寒性強弱。表 2 所示為2種短枝木麻黃無性系的Logistic方程及低溫半致死溫度。耐寒無性系ZS7和不耐寒無性系HN1的擬合度分別為0.998和0.997，都達到極顯著水平(P< 0.01)，說明擬合的Logistic方程可靠性強。根據Logistic方程進一步計算得到ZS7和HN1的低溫半致死溫度(LT50)分別為-5.92 ℃和-2.87 ℃，由此進一步證明了ZS7比HN1具有更強的耐寒能力，也為后續進一步開展耐寒相關調控基因的表達模式分析提供了參考溫度。

表2 低溫脅迫下2種短枝木麻黃無性系相對電導率回歸方程及半致死溫度①

①**: 極顯著差異 Highly significant (P< 0.01).

2.3 低溫脅迫下各耐寒相關基因的表達分析

2.3.1 低溫梯度脅迫下耐寒相關基因的表達 為了進一步了解木麻黃應答低溫脅迫的分子機制，選取了在前期轉錄組研究中鑒定出的6個耐寒相關調控基因(Lietal., 2017)，分別代表了轉錄因子(transcription factor)家族基因成員(包括RAP2.7，ABR1，AtHSFA6B，AtbZIP44)、ROS家族基因成員(GRXC6)和ROS應答基因(HSP18.2)，基于qPCR分析耐寒相關基因的精細表達規律(表1)。本研究以ZS7和HN1的LT50(-5.92 ℃和-2.87 ℃)為參考，設置在達到LT50前的-2 ℃、-5 ℃以及降至LT50后的-8 ℃共3個低溫梯度來分析各個基因表達模式。

在qPCR試驗中，6個耐寒相關調控基因和1個內參基因的溶解曲線均呈單一峰值擴增。根據濃度梯度稀釋擴增得出的標準曲線相關系數(R2)均大于0.99，擴增效率介于97.27%～108.05%，表明所有qPCR引物的擴增具有高特異性，且擴增效率一致，滿足利用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

圖2所示為在常溫下和連續低溫梯度-2，-5，-8 ℃脅迫下，6個耐寒相關基因RAP2.7，ABR1，GRXC6，AtbZIP44，AtHSFA6B和HSP18.2在耐寒無性系ZS7和不耐寒無性系HN1中的表達情況。從總體上來看，耐寒無性系ZS7中各基因(除RAP2.7基因外)在低溫梯度脅迫下的表達呈現先升高后下降的變化趨勢，而不耐寒無性系HN1的表達呈下降趨勢。在常溫條件下，這6個基因在ZS7和HN1無性系中的相對表達量皆無明顯差異。在降至-2 ℃后，5個基因(ABR1，AtHSFA6B，AtbZIP44，GRXC6，HSP18.2)在ZS7中的表達量均極顯著高于常溫，而RAP2.7基因的表達顯著降低； 6個基因在HN1的表達量均極顯著低于常溫； 各基因的表達量在ZS7中均極顯著高于在HN1中。這表明在HN1臨近半致死狀態下，這6個耐寒相關基因在不耐寒種質HN1中的表達被強烈抑制，而在耐寒種質ZS7中的表達被激活，說明當外界環境從常溫降到-2 ℃時，短枝木麻黃為了抵御和適應低溫脅迫造成的傷害，快速啟動低溫應答機制，激活了耐寒相關基因的增強表達。

在降至-5 ℃后，各基因在2種無性系中的表達均被抑制，且除RAP2.7和AtbZIP44基因在ZS7和HN1中的表達量無明顯差異外，其余4個基因在ZS7中的表達量均極顯著高于HN1。這表明當降至臨近ZS7的半致死溫度下，不耐寒種質HN1中的各基因被進一步抑制，同時在耐寒種質ZS7中的表達亦被強烈抑制，這也許表明當溫度繼續下降至臨近LT50的-5 ℃時，即短枝木麻黃處于組織所受傷害不可逆轉的溫度節點，低溫脅迫導致細胞質膜的結構和功能受到破壞，細胞內電解質的外滲量增多，相對電導率迅速升高(圖1)，使其對低溫脅迫的應答調控機制受到影響，導致短時間內耐寒調控基因的表達受到抑制，因而有必要對在該溫度脅迫下的精細表達模式進一步研究。在降至低于半致死溫度的-8 ℃后，伴隨著明顯凍害癥狀的出現，葉片嚴重萎蔫，各基因的表達繼續受到抑制。

圖2 短枝木麻黃耐寒相關基因在常溫(RT)和低溫梯度脅迫下的表達Fig.2 The expression of cold resistance related genes in Casuarina equisetifolia under normal(RT) and successive low temperatures**代表基因的表達在無性系ZS7和HN1之間達極顯著差異(P<0.01)。** represent highly significant (P<0.01) difference between genes in two clones.

圖3 短枝木麻黃耐寒相關基因在常溫(RT)和連續低溫(-5 ℃)脅迫下的表達模式Fig.3 The expression of cold resistance related genes in Casuarina equisetifolia under normal(RT) and low temperature (-5 ℃) conditions for 1～72 h

2.3.2 連續低溫脅迫下耐寒相關基因的表達 為了進一步明確短枝木麻黃在臨近半致死溫度時6個耐寒相關基因的精細表達模式，對2種無性系在-5 ℃低溫脅迫下持續1，2，5，8，16，24，48，72 h的表達進行比較分析。圖3所示為在連續-5 ℃低溫脅迫下，RAP2.7，ABR1，AtHSFA6B，AtbZIP44，GRXC6和HSP18.2基因在耐寒無性系ZS7和不耐寒無性系HN1中的表達模式。在常溫條件下，各基因在ZS7和HN1無性系中的相對表達量皆無明顯差異，但在-5 ℃低溫脅迫下存在顯著不同。在ZS7中，6個基因的表達在1～5 h內與常溫沒有明顯差異，8 h后開始呈現極顯著上調，表達量最高值集中在低溫脅迫后的第8，24，48 h(圖3)。而在HN1中，6個基因的表達在1～16 h內皆呈現極顯著下調，表達量最低值集中在1～5 h內(圖3)。就6個基因在ZS7與HN1無性系間的表達量差異而言，ABR1，GRXC6，AtHSFA6B和HSP18.2這4個基因在2 h內出現，而RAP2.7和AtbZIP44這2個基因在8 h出現。此外，6個基因的表達量最高值依次為ABR1(168)>AtbZIP44(57)>GRXC6(56)>HSP18.2(54)>AtHSFA6B(33)>RAP2.7(7)，可見，ABR1基因的表達量最高，是AtbZIP44，GRXC6，HSP18.2，AtHSFA6B基因的3～5倍，RAP2.7基因的24倍(圖3)。這一表達模式表明對于耐寒種質，一定時間的半致死溫度脅迫激活了耐寒相關調控基因的增強表達以應對逆境； 但對于不耐寒種質，低溫脅迫短時間內即抑制了耐寒相關調控基因的表達，導致其耐寒性顯著降低。

3 討論

低溫半致死溫度(LT50)能較準確地反映植物所能耐受的最低溫度，在植物抗寒研究領域得到了廣泛應用(許瑛等， 2008； 孫海偉等， 2012； 任俊杰等， 2014； Suetal., 2015)。當溫度繼續下降至低于LT50時，組織中液態水將迅速結冰，導致凍害發生(Rajashekaretal., 1979)，植物組織所受的傷害也將不能恢復(任俊杰等， 2014)。因此LT50可以認為是植物組織所受傷害不可逆轉時的轉折溫度，研究在LT50溫度前后耐寒相關基因的表達對于探究木麻黃應對低溫脅迫的分子機制具有重要意義。本研究基于LT50反映了2種不同短枝木麻黃種質在耐受低溫程度上的差異，并進一步從分子水平上研究了在LT50溫度脅迫前后，2種耐寒性不同的種質在6個耐寒相關基因表達上差異。在2種低溫脅迫方式下，耐寒和不耐寒種質對低溫的應答機制明顯不同，在LT50前后，6個耐寒相關基因在不耐寒短枝木麻黃種質中的表達一直被強烈抑制，而在耐寒種質中，5個基因(除RAP2.7外)的表達都呈現先升高后下降的變化趨勢。此外，當臨近LT50的-5 ℃時，盡管短時間的低溫脅迫暫時抑制了耐寒種質中5個基因(除RAP2.7外)的表達，但在脅迫達到8 h后再次增強表達，并一直持續至48 h。這表明未經過耐寒鍛煉的短枝木麻黃種質，缺乏抵御低溫脅迫的內在調控機制，而耐寒短枝木麻黃種質經過長期的低溫適應，形成了一系列由調控基因介導的耐寒調節機制，尤其在組織受到不可逆轉傷害的溫度節點，該機制被充分調動，以提高自身的抗逆性。

為了適應各種生物與非生物逆境脅迫，植物啟動了多種防御性機制。由轉錄因子介導的信號傳導是最為快速有效的防御應答反應之一，構成了植物復雜調控網絡的重要組成部分(Leeetal., 2005； Ashraf, 2010)。在本研究中，-5 ℃持續低溫脅迫顯著誘導了耐寒短枝木麻黃ZS7中ABR1、AtbZIP44和AtHSFA6B這3個轉錄因子基因的增強表達，其中AtHSFA6B基因的表達量在8 h達到最高，ABR1和AtbZIP44基因則在24 h之后。這表明不同轉錄因子響應低溫的速度與強度不同，且發揮最大調節作用的時間也不一致。此外，這3個基因的表達量均呈現先升高后下降的變化規律，這可能是由于它們被誘導表達后激活了下游一系列抗逆相關基因的表達，調節植物體內各種生理生化反應，從而提高木麻黃對低溫脅迫的抗性。而后期表達量下降的原因，可能與已經對脅迫環境適應有關，也可能體現了轉錄因子基因的誘導受脅迫時間的限制，超過一定的時間，表達逐漸受到抑制，對低溫的耐受能力也逐漸降低(楊帆等， 2010)。這種隨逆境脅迫時間的持續，轉錄因子基因先升高后下降的表達模式也在對構樹(Broussonetiapapyrifera)耐鹽(楊帆等， 2010)、水稻(Oryzasativa)耐低溫(Liuetal., 2012)和胡楊(Populuseuphratica)耐鹽(Shenetal., 2013)等的研究上得到了相似結果。

AP2/ERF家族的轉錄因子處于調控網絡的節點(Xuetal., 2011； Zhuangetal., 2011)，主要通過激活冷誘導基因(cold regulated，COR)、應答脫水基因(responsive to dehydration，RD)等一系列下游冷調節基因的表達來增強對低溫逆境的適應。不同于AP2/ERF家族中的大多數成員，AP2型基因RAP2.7隸屬該家族中DREB亞家族轉錄因子A-5亞組基因，為EAR(ERF-associated amphiphilic repression)型轉錄抑制子(Dongetal., 2010)，其過量表達會導致植物耐受性降低，而缺失突變體植株則會對逆境的耐受性增強(Tsutsuietal., 2009； Yaishetal., 2009)。在本研究中，-2 ℃的低溫對耐寒相關基因RAP2.7具有負調控作用，在-5 ℃持續低溫脅迫下，其表達量也遠遠低于其他5個基因。RAP2.7基因在耐寒短枝木麻黃中的這一低溫應答模式表明，在低溫逆境的應答上，一些AP2型基因成員的轉錄調控機制不同于ABR1、AtHSFA6B和AtbZIP44，耐寒短枝木麻黃是通過這些AP2型轉錄因子在低溫脅迫下的負調控作用來增強其對低溫的耐受性。AP2/ERF 類轉錄因子基因家族成員在不同植物中存在的數量及類型不同(Velascoetal., 2010)。在前期對耐寒型短枝木麻黃的轉錄組研究中，初步鑒定出了18個在低溫脅迫下差異表達的AP2/ERF類轉錄因子成員，其中11個上調、7個下調(Lietal., 2017)。因此為了全面了解AP2型轉錄因子在低溫逆境下的轉錄調控機制，有必要對這些AP2型成員的精細表達模式進一步研究。

低溫誘導了植物體內活性氧(reactive oxygen species, ROS)的大量產生，進而從根本上導致氧化脅迫，對植物組織內的蛋白、脂類、碳水化合物和核酸造成巨大傷害。在氧化脅迫下，植物細胞的抗氧化防御系統隨之被激活，通過清除ROS以抵御氧化脅迫導致的傷害(Gilletal., 2010)。硫氧還蛋白GRXC6屬于抗氧化酶類ROS家族的成員，熱激蛋白基因HSP18.2是ROS應答基因(Lietal., 2017)。本研究顯示在-5 ℃的低溫誘導下，GRXC6在48 h達到最高表達量，HSP18.2在8～48 h一直維持較高的表達量，這表明在低溫脅迫下，耐寒短枝木麻黃種質通過誘導ROS家族基因和ROS應答基因的上調表達來調整增強ROS清除能力，進而減輕氧化脅迫導致的傷害，提高其抗氧化能力以適應逆境。植物參與不同逆境脅迫響應的基因之間存在復雜的互作關系(Huangetal., 2012)。熱激轉錄因子HSF是植物熱激響應的主要控調因子，在逆境脅迫下與熱激元件(heat shock element，HSE)識別并特異結合，從而激活下游基因HSP的轉錄和表達(Pelham, 1982)，對植物抵抗逆境傷害和其他生命活動具有關鍵作用(Baniwaletal., 2004)。在本研究中，HSP18.2和AtHSFA6B具有同步一致的表達模式，均在8～48 h持續高表達，這可能預示了在低溫脅迫早期，AtHSFA6B基因的高表達迅速啟動了對下游HSP18.2的調控機制，以增強短枝木麻黃低溫逆境的耐受能力。

4 結論

在耐寒相關調控基因的表達水平上，耐寒和不耐寒短枝木麻黃種質對低溫的應答機制明顯不同。低溫激活了耐寒種質中轉錄因子、ROS家族基因、ROS應答因子等調控基因的增強表達以抵御和適應逆境脅迫，但抑制了在不耐寒種質中的表達，顯著降低了不耐寒種質對低溫逆境的耐受能力。這在一定程度上對于豐富木麻黃適應低溫的分子機制，以及耐寒無性系的分子選育都具有一定的參考價值。顯然，要全面深入解析木麻黃耐寒的分子機制，還需要增加更多耐寒相關候選基因的表達模式研究，并進一步開展功能分析研究。為此，克隆基因全長、構建木麻黃功能基因超表達載體、建立遺傳轉化體系等，將是在本研究基礎上繼續跟進的工作。

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(責任編輯 徐 紅)

Analysis on Differential Expression of Cold Resistance Related Genes ofCasuarinaequisetifoliaunder Low Temperature Stress

Li Nan1,2Zheng Yongqi1Ding Hongmei3Liu Xinhong2Sheng Weitong1Jiang Bo2Li Haibo2

(1.KeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivationofStateForestryAdministrationResearchInstituteofForestry,ChineseAcademyofForestryBeijing100091; 2.ZhejiangAcademyofForestryHangzhou310023; 3.ZhejiangChineseMedicalUniversityHangzhou310053)

【Objective】 The expression patterns of 6 cold resistance related genes (RAP2.7,ABR1,AtHSFA6B,AtbZIP44,GRXC6 andHSP18.2) in cold-tolerant and cold-intolerantCasuarinaequisetifoliawere analyzed in order to provide a theoretical basis for elucidating the molecular mechanism ofCasuarinatrees in response to cold stress.【Method】 The relative conductivity in cold-tolerant (ZS7) and cold-intolerant (HN1) clones ofC.equisetifoliawere measured under low temperature stresses at -2--11 ℃. The low half-lethal temperature (LT50) were calculated by fitting the temperature with the relative conductivity based on the logistic equation. Quantitative Real-Time PCR (qPCR) was employed to investigate the differential expression of the 6 cold resistance related genes in cold-tolerant and cold-intolerant clones under successive low temperature stresses at -2, -5 and -8 ℃, as well as precise expression patterns under low temperature stresses at -5 ℃ for 1, 2, 5, 8, 16, 24, 48 and 72 h. The specific primers for qPCR were designed based on the EST sequences of 6 cold resistance related genes identified from previous transcriptome analysis. Analysis of relative gene expression data was performed using 2-ΔΔCTmethod.【Result】 Under low temperature stresses, relative conductivity in cold-tolerant and cold-intolerant clones had a very highly significant difference (P<0.01), LT50was -5.92 ℃ and -2.87 ℃, respectively. Under normal temperature condition, the relative expression of all the 6 genes in 2 clones had no significant differences. However, under low temperature stress at -2 ℃ for 2 h, which was close to the LT50of cold-intolerant clone, expression of these genes in the cold-intolerant clone were strongly inhibited, while in the cold-tolerant clone were activated. Under low temperature stress at -5 ℃ for 2 h, which was close to the LT50of the cold-tolerant clone, expression of these genes were further inhibited in the cold-intolerant clone, also in the cold-tolerant clone. Under low temperature stress at -8 ℃ for 2 h, which was lower than the LT50, the expression of all 6 genes in 2 clones were inhibited continuously. The precise expression patterns analysis revealed that the expression of all 6 genes were significantly up-regulated in the cold-tolerant clone under low temperature stress at -5 ℃ for 8 h, reaching the maximum at 8 h, 24 h and 48 h, and significantly down-regulated in the cold-intolerant clone at 1-16 h, reaching the minimum at 1-5 h.【Conclusion】 On the expression level of cold resistance related genes, different clones showed significantly different responding mechanisms to low temperature stress. Low temperature induces the expression of genes belonging to transcription factors and ROS family, and genes related with the response to ROS in cold-tolerantC.equisetifoliato resist or adapt to cold stress, instead it was inhibited in the cold-intolerantC.equisetifolia, thus significantly decreased its adaptation to cold stress. This study provided a useful basis for enriching the molecular mechanism ofCasuarinatrees in coping with cold stress, and for molecular selection and breeding of cold-tolerantCasuarinaclones.

Casuarinaequisetifolia； low temperature stress； cold tolerance； gene expression； molecular breeding

10.11707/j.1001-7488.20170707

2017-03-10；

2017-06-01。

浙江省農業(林木)新品種選育重大科技專項(2016C02056-9)。

S718.46

A

1001-7488(2017)07-0062-10

*李海波為通訊作者。