綠色熒光蛋白標記枯草芽孢桿菌Y13UV在油茶體內的定殖*

金 勤 朱丹雪 周國英 李 河 何苑皞 張 茜,2

(1. 森林有害生物防控湖南省重點實驗室 經濟林培育與保護教育部重點實驗室 中南林業科技大學 長沙 410004；2. 湖南汽車工程職業學院 株洲 412001)

綠色熒光蛋白標記枯草芽孢桿菌Y13UV在油茶體內的定殖*

金 勤1朱丹雪1周國英1李 河1何苑皞1張 茜1,2

(1. 森林有害生物防控湖南省重點實驗室 經濟林培育與保護教育部重點實驗室 中南林業科技大學 長沙 410004；2. 湖南汽車工程職業學院 株洲 412001)

【目的】 枯草芽孢桿菌Y13UV對油茶炭疽病具有良好的防治效果，研究其在油茶體內的定殖動態，為油茶炭疽病的防治提供依據?！痉椒ā?通過原生質體轉化法引入綠色熒光蛋白質粒，構建熒光標記菌株。通過噴葉、灌根、噴葉灌根結合處理多種接種方式及重復接種，測定菌株在油茶體內不同組織部位的定殖數量，分析其定殖規律及能力。【結果】 標記菌株可以在油茶根、莖和葉內定殖，單次接種當天，根內回收的標記菌株數量為1.07×105cfu·g-1； 噴葉灌根結合處理7天后，油茶根、莖和葉內標記菌株的數量分別為8.70×102、5.00×102和7.30×102cfu·g-1，均高于噴葉、灌根單獨處理。重復接種時，油茶根莖葉內標記菌株的定殖量在接種3～5天內達到高峰，然后呈現穩定趨勢， 20天時定殖量開始大幅下降，第30天噴葉灌根處理的油茶根內的定殖量僅為5.30×102cfu·g-1。熒光標記菌株生長較好，穩定表達，對炭疽病菌具有良好的抑制效果。【結論】 枯草芽孢桿菌Y13UV能通過噴葉灌根方式接種在油茶體內定殖并傳導，有較好的定殖能力。

綠色熒光蛋白； 枯草芽孢桿菌； 油茶炭疽??； 定殖

在油茶(Camelliaoleifera)生產中，油茶炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)是一種最主要的病害，在各大產區普遍發生，造成嚴重的落葉、落果、落蕾，產量降低(楊華等， 2015)。目前，防治油茶炭疽病主要是采取化學防治和生物防治手段(陳彧等， 2010)。但大量使用化學農藥容易導致植物病原菌產生抗藥性，造成環境污染，引起人畜中毒等問題(周國英等， 2007)。國內外已有不少關于生物防治植物病害的報道。周建宏等(2011)通過對40多種植物進行篩選，利用篩選出來的丁香(Syringaoblata)和黃苓(Scutellariabaicalensis)研制出了防治油茶炭疽病的純植物源農藥。宋光桃(2009)從油茶林土壤中分離出了對油茶炭疽病具有拮抗作用的放線菌CF17。美國Agraquest公司(2001)將枯草芽孢桿菌QST713制成生物殺菌劑，具有廣譜性。

利用能夠在寄主植物體內定殖的內生拮抗菌對病害進行防治具有獨特的優勢(楊光道等， 2009)，實際應用中拮抗作用強并不一定是最好的生防因子，生防菌能否在植株體內定殖才是取得防效的關鍵。研究內生細菌定殖的常用方法有同位素示蹤法(葛銀林等， 1995)、免疫學方法(劉云霞等， 1996)、抗生素標記法(吳藹民等， 2001)、熒光標記法(殷幼平等， 2010)。熒光標記中的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)熒光性能穩定、無需外源反應底物、對宿主細胞無毒害作用、檢測方便，成為研究微生物與宿主或環境互作的重要工具(王卿等， 2015)。劉郵洲等(2014)發現綠色熒光蛋白基因標記的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在番茄(Lycopersiconesculentun)根際土壤中有一定的定殖能力，接種30天后仍可檢測到標記菌株。杜芳等(2015)研究了枯草芽孢桿菌Y10在白菜(Brassicarapa)根、莖及葉部組織的定殖情況，結果表明枯草芽孢桿菌在白菜體內有良好的定殖能力，且這種特性可能與其防治根腫病有關。Yang等(2013)將攜帶質粒gfpmut3a基因的穿梭載體pGFP4412 導入生防枯草芽孢桿菌中，通過浸種、蘸根以及灌根接種研究其在黃瓜(Cucummissativus)根表的定殖，發現在根基部和中部都有標記菌株聚集而形成膜狀結構，在根的分叉和根冠處可觀察到大量標記菌株。關于綠色熒光蛋白標記枯草芽孢桿菌在油茶體內定殖的研究，國內目前未見相關報道。

枯草芽孢桿菌Y13UV是本實驗室經過誘變獲得的優良菌株，本試驗通過GFP標記研究Y13UV在油茶體內的定殖及消長動態，為提高Y13UV防治油茶炭疽病效果和制定施用方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株： 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Y13UV，本實驗室分離、誘變保存。

供試質粒和內切酶： pHT315-GFP，高效表達綠色熒光蛋白基因的大腸桿菌(Escherichiacoli)一蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)穿梭載體，HindⅢ和XbaⅠ內切酶均由本實驗室保存。

供試油茶苗： 湘林210品種，2年生健康盆栽苗，購于湖南省林業種苗中心； 長勢、苗高、大小一致。

1.2 GFP標記菌株Y13UV的構建及檢測

參考陳燕紅等(2014)的方法，本實驗室自行構建標記菌株。

1.2.1 熒光顯微鏡檢測 挑取少許綠色熒光蛋白標記菌株菌體涂布固定，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測(激發光波長480 nm，發射光波長520 nm)，觀察有無熒光產生。

1.2.2 GFP標記菌株生長動力學測定 挑取GFP標記菌單菌落接種到LB液體培養基中，30 ℃、200 r·min-1培養24 h，按1%的接種量接種到100 mL新鮮的LB液體培養基中，每隔4 h測定OD600值。

1.2.3 GFP標記菌株抑菌活性測定 采用平板對峙法： 取炭疽病菌菌餅放在PDA平板中央，將GFP標記菌株接種至距離炭疽病菌1.5 cm處，置于28 ℃恒溫培養箱中。待朝向標記菌株方向的病原菌菌落不再生長時，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率。

1.3 GFP標記菌株在油茶體內的定殖動態

1.3.1 單次接種監測GFP標記菌株在油茶體內的定殖動態 采用噴葉法、灌根法和噴葉灌根結合法接種標記菌菌懸液，濃度為3.2×108cfu·mL-1，每處理3次重復，每處理100株，以無菌水處理為對照。噴葉法： 用噴霧器將菌液均勻地噴灑到油茶葉片上，每株10 mL； 灌根法： 將GFP標記菌株菌液澆灌于油茶根部，每株10 mL； 噴葉灌根綜合法： 噴葉和灌根同時接種，分別為每株5 mL，共10 mL。分別于接種0，1，3，5，7天……對油茶根(主根與側根混勻)、莖(莖下： 地表3～8 cm莖部；莖中： 8～13 cm莖部；莖上： 13～20 cm莖部)、葉(從上往下不同部位的葉子混勻)進行取樣回收，每處理隨機抽取3株，每份組織樣品0.5 g，直至回收不到標記菌株。

1.3.2 重復接種監測GFP標記菌株在油茶體內的定殖動態 單次接種7天后，進行第2次接種。采用的接種方法、菌液濃度及用量與1.3.1 相同。

分別于接種后1，3，5，10，15，20，30天對油茶根、莖、葉進行取樣回收，每處理隨機抽取3株，每份組織樣品0.5 g，直至回收不到標記菌株。

1.3.3 標記菌株的回收與鑒定 分別稱取油茶苗根、莖、葉組織各0.5 g，經表面消毒后研磨成勻漿，分別取0.1 mL各梯度稀釋液涂布LB氯霉素抗性平板，28 ℃培養2～3天，在熒光顯微鏡下觀察熒光菌落數。用接種環挑取單菌落到10 ml LB液體培養基中，37 ℃、180 r·min-1培養6 h，提取質粒，用HindⅢ和XbaⅠ從GFP兩端切開驗證回收的菌株是否為標記菌株。

1.4 數據統計分析

數據均為平均數±標準誤差，采用Excel 2007和SPSS19.0軟件處理，顯著性水平采用Duncan’s新復極差法分析。

2 結果與分析

2.1 綠色熒光蛋白標記枯草芽孢桿菌Y13UV的構建及其檢測

2.1.1 綠色熒光蛋白標記枯草芽孢桿菌Y13UV的熒光檢測 綠色熒光蛋白標記菌株構建好之后，挑取標記菌株于載玻片上涂布并固定，在熒光顯微鏡下檢測到菌株發熒光(圖1)，并將綠色熒光蛋白標記菌株記為Y13UV-GFP。

圖1 Y13UV-GFP在熒光顯微鏡下的表現Fig.1 Fluorescence under the fluorescence microscope of Y13UV-GFP

2.1.2 綠色熒光蛋白標記菌株Y13UV-GFP生長曲線測定 從圖2可以看出，綠色熒光蛋白標記菌株Y13UV-GFP的生長趨勢與原始菌株Y13UV基本一致。這表明外源質粒的轉入以及綠色熒光蛋白的表達對菌株Y13UV生長沒有產生不利影響。

圖2 Y13UV菌株及Y13UV-GFP標記菌株生長曲線Fig.2 Growth curve of Y13UV and Y13UV-GFP strains

2.1.3 綠色熒光蛋白標記菌株Y13UV-GFP的抑菌效果測定 從表1可知： 標記菌株Y13UV-GFP和原始菌株Y13UV相比，對炭疽病的抑制效果無顯著差異，因此Y13UV-GFP可以用來進行定殖動態和生防能力的研究。

表1 標記菌株Y13UV-GFP和原始菌株Y13UV的抑菌效果①

①平均數后相同字母表示無顯著性差異(P>0.05)。The same letter after the averages indicate there was no significant difference(P>0.05).

2.2 標記菌株Y13UV-GFP在油茶體內的定殖動態

2.2.1 標記菌株的回收與鑒定 從LB平板上挑取的Y13UV-GFP中提取出 pHT315-GFP(約7.2 kb)質粒，對質粒進行雙酶切后可獲得與GFP片段(約714 bp)長度相當的片段。由此可以確定回收到的菌株是Y13UV-GFP。如圖3： M為DL10000 marker，1為從回收菌株中提取的質粒pHT315-GFP，2為HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后的產物。

2.2.2 單次接種監測Y13UV-GFP在油茶體內的定殖動態 如表2所示： 灌根處理當天，油茶苗根部能夠檢測到Y13UV-GFP，其定殖數量高達1.07×105cfu·g-1。接種后第1天，在莖及葉組織可以檢測到標記菌株； 莖上部位及葉片，定殖數量隨時間遞增逐漸減少。接種后第7天，葉片內定殖數量顯著低于根部(P<0.05)； 并且回收的植株中，有的葉內已經檢測不到標記菌株。表明Y13UV-GFP能夠通過油茶苗根部短時間內侵入并向上傳遞，但定殖時間有限。

噴葉處理后，根、葉片、莖下部位的Y13UV-GFP定殖數量呈現遞減趨勢。接種后第1天葉內的定殖數量顯著高于灌根處理(P<0.05)； 莖上部位的定殖數量為1.1×103cfu·g-1，莖中部位僅有2.1×102cfu·g-1。在3，5，7天均出現了莖上部位的定殖量高于莖中，此現象在噴葉灌根結合處理后再次出現，且第7天回收的大部分油茶苗葉片內檢測不到Y13UV-GFP，說明通過葉部侵入的Y13UV-GFP有一定向下傳遞的能力。

噴葉灌根結合處理后，接種后1天根部定殖數量為2.00×104cfu·g-1，顯著高于灌根處理的數量3.00×103cfu·g-1(P<0.05)； 莖上部位的定殖數量高于莖中部位，此現象與噴葉方式處理相同。第7天根部定殖數量為8.70×102cfu·g-1，仍然高于灌根處理； 葉內Y13UV-GFP定殖數量也高于噴葉處理的數量。

綜合來看，3種接種方式下Y13UV-GFP定殖量存在顯著性差異，噴葉灌根結合處理為最優接種方式。

圖3 Y13UV-GFP酶切鑒定Fig.3 Enzyme identification of Y13UV-GFP

表2 單次接種情況下Y13UV-GFP在油茶體內的定殖動態①

①同一組織不同時間列中具有相同小寫字母的處理表示不同天數沒有達到顯著差異(P>0.05)The same column with the same letters are not significant difference on different day(P>0.05).

2.2.3 重復接種監測Y13UV-GFP在油茶體內的定殖動態 1) 灌根接種標記菌株Y13UV-GFP在油茶體內的定殖動態 通過灌根處理，回收檢測結果顯示： 在油茶根莖葉組織中均可分離檢測到標記菌株Y13UV-GFP，且根內的定殖量顯著高于葉(P<0.05)。在接種初期，根內的定殖量為3.73×103cfu·g-1，高于莖和葉中的定殖量。隨著接種時間的延長，在根中的定殖量逐漸下降，在30天時僅有5.30×102cfu·g-1。在莖的各部位(莖下、莖中、莖上)和葉中的定殖量呈現先上升后下降的趨勢，莖下部位定殖量在第3天達到高峰，而莖中、莖上和葉的高峰期均為第5天。各組織中標記菌株的數量在第5～15天較為穩定， 20天后數量迅速減少。在第30天時，根內的數量高于莖內各部位和葉。

圖4 灌根接種標記菌株Y13UV-GFP在油茶體內的定殖動態Fig.4 Colonization of Y13UV-GFP in Camellia oleifera by pouring root

2) 噴葉接種標記菌株Y13UV-GFP在油茶體內的定殖動態 采用噴葉法將標記菌株Y13UV-GFP接入油茶苗后，回收檢測結果表明： 在接種后第1天，標記菌株Y13UV-GFP在油茶葉內的定殖數量為6.00×103cfu·g-1，然后迅速下降； 在無套袋處理、自然滴落的情況下，在接種1天后根部回收到的Y13UV-GFP數量為3.27×103cfu·g-1，與灌根處理的油茶根部第1天的回收量基本一致。莖內各部位Y13UV-GFP的定殖量先增后減，莖下部的定殖量在第5天達到最大值1.60×103cfu·g-1，而莖中部和上部在第3天就達到最大值，3～10天莖上部位回收量均高于莖中部位。第30天時，根內的數量高于葉和莖內各部位； 葉內Y13UV-GFP的定殖數量為4.00×102cfu·g-1，略高于灌根處理葉內30天的定殖量。

圖5 噴葉接種標記菌株Y13UV-GFP在油茶體內的定殖動態Fig.5 Colonization of Y13UV-GFP in Camellia oleifera by spraying leaf

3) 噴葉灌根接種標記菌株Y13UV-GFP在油茶體內的定殖動態 通過噴葉灌根接種處理，根內標記菌株的定殖數量高于噴葉或灌根單獨處理的數量。在接種后第1天，根部標記菌株Y13UV-GFP數量達8.67×103cfu·g-1，然后降低，第30天的數量與灌根接種處理的相同。莖各部位的定殖量呈現先上升后下降的趨勢，高峰期分別為3天和5天。接種后1天，葉內Y13UV-GFP的數量較高，第3天有所下降，第5天出現第2次高峰，之后下降。第30天時，葉內的定殖量高于其他2種處理方式。

圖6 噴葉灌根接種標記菌株Y13UV-GFP在油茶體內的定殖動態Fig.6 Colonization of Y13UV-GFP in Camellia oleifera by spraying leaf and pouring root

3 討論

采用噴葉法、灌根法、噴葉灌根結合法3種接種方法接種，均能使標記菌株侵入油茶根莖葉內，并在油茶植株體內繁殖和傳導。單次接種時，3種接種方式下標記菌株的定殖時間短，不同接種方式的定殖量存在差異。重復接種使標記菌株在油茶體內的定殖時間長達30天，噴葉灌根結合處理30天后，根部定殖量為5.3×102cfu·g-1，葉部為6.7×102cfu·g-1，莖各部(莖上、莖中和莖下)的定殖量均高于其他2種處理方法。經酶切鑒定分析，回收菌株均為標記菌株Y13UV-GFP。

王瑞芹(2014)用抗利福平標記Y13菌株，雖然抗利福平標記的菌株與綠色熒光蛋白標記的菌株在油茶體內定殖沒有顯著性差異，但抗性菌株接種到植物后，部分菌株會因為在植物體內沒有了選擇壓力而在增殖過程中丟失了抗利福平的能力(范曉靜， 2007)，再者植物內生菌有些也可能對利福平具有抗藥性，從而造成分離到的細菌數量不準確，綠色熒光蛋白基因標記就減小了分離菌量與實際定殖菌量的差異。

研究中發現，單次接種時Y13UV-GFP定殖時間短，重復接種時葉部回收并未出現5天和7天就已檢測不到標記菌株的情況，由此猜想，重復接種的方式更易于內生拮抗細菌對植株生境的適應并穩定定殖。重復接種延長了Y13UV-GFP在油茶體內的定殖時間，也有報道(王卿等， 2015)指出強化接種1次可能會使生防菌保持一定的種群優勢，進而將可能對植物有較長的保護作用。 彭袆等(2010)研究發現多黏芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)能在番茄根表面形成生物膜，國外也有研究(Timmusketal., 2005)報道多黏芽孢桿菌可以在植物根尖形成生物膜，生物膜所包被的細菌群體，對不良環境有較強的耐受力(Costertonetal., 1995)。至于枯草芽孢桿菌Y13UV是否能在油茶根部形成生物膜則有待進一步研究。

噴葉灌根結合處理30天后，葉片中的定殖數量比根部多，相比噴葉灌根單獨處理的效果好。出現這一結果，筆者分析其原因可能是綜合處理增強了菌株在葉內的定殖效果。葉內的標記菌株包括從根部進入并傳遞到葉片的標記菌株和直接從葉片侵入的標記菌株，更多的標記菌株與其他內生菌競爭生態位，在油茶體內繁殖，具有生長優勢。針對此結果，筆者展開了后續試驗，研究Y13UV菌株在油茶體內定殖對葉內微生物的影響。

國內外研究表明，生防菌能否在植物體內有效定殖是其發揮防病作用的重要因素(Kloepperetal., 1981； 連玲麗等， 2011)。本試驗初步明確了Y13UV菌株能夠在油茶體穩定定殖，不同部位定殖量也有較大差異，這說明對特定部位有所偏好，可能與各部位分泌的營養物質有關(李世貴等， 2009； 杜芳等， 2015)。本試驗也只研究了Y13UV-GFP在油茶體內的定殖動態，能否在其他植物體內穩定定殖，進而發揮防治效果，還需進一步研究，為大范圍推廣Y13UV提供依據。

4 結論

將綠色熒光蛋白基因導入到枯草芽孢桿菌Y13UV中，標記菌株Y13UV-GFP在藍光激發下可以發出強而穩定的綠色熒光、生長好、具有較好的抑菌效果。標記菌株可以通過灌根和噴葉的方式侵入油茶體內，并進行繁殖和傳導； 20天后達到穩定定殖狀態，定殖時間長達30天，為制定枯草芽孢桿菌Y13UV的林間施用措施提供了理論基礎。

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(責任編輯 朱乾坤)

Colonization of GFP-TaggedBacillussubtilisY13UVinCamelliaoleifera

Jin Qin1Zhu Danxue1Zhou Guoying1Li He1He Yuanhao1Zhang Qian1,2

(1.HunanProvincalKeyLaboratotyforControlofForestDiseaseandPestsKeyLaboratoryforNon-WoodForestCultivationandConservationofMinistryofEducationCentralSouthUniversityofForestandTechnologyChangsha410004；2.HunanAutomotiveEngineeringVocationalCollegeZhuzhou412001)

【Objective】BacillussubtilisY13UVcan controlColletotrichumgloeosporioideseffectively. Studying its colonization dynamics could provide a scientific basis for controllingC.gloeosporioides. 【Method】 The GFP plasmid was introduced into cells by protoplasts conversion and to acquire GFP-tagged Y13UV.Camelliaoleiferaplants were inoculated with the GFP-tagged Y13UVwith different methods including foliar spray, root irrigation, foliar spray plus root irrigation, and single or multiple inoculations. The population numbers of GFP-tagged Y13UVin different tissues ofCamelliaoleiferawere quantified after inoculations to test the colonization ability of the GFP-tagged strain. 【Result】 GFP-tagged Y13UVcould colonize in root, stem and leaf tissues ofCamelliaoleifera. In the same day after single inoculation, the population numbers of the marked strain in root were 1.07×105cfu·g-1. Seven days after inoculation by foliar spray plus root irrigation, the population of marked strain in root, stem and leaf tissues ofCamelliaoleiferawere 8.70×102, 5.00×102 and 7.30×102cfu·g-1, respectively. And the population numbers were higher than inoculation by foliar spray or root irrigation alone. With multiple inoculations, the population numbers of the tagged strain reached their peaks about 3-5 days after inoculation, the populations kept stable until they dropped dramatically 20 days after inoculation,. The population number of 30th day in root tissue ofCamelliaoleiferawas5.30×102cfu·g-1when inoculated by foliar spray plus root irrigation. The results showed that GFP-tagged Y13UVgrew better, expressed stably and still had good inhibition toC.gloeosporioides. 【Conclusion】 After inoculated by foliar spray or root irrigation, GFP-tagged Y13UVcould colonize and transfer inCamelliaoleifera, and displayed good colonization ability.

green fluorescent protein(GFP)；Bacillussubtilis；Colletotrichumgloeosporioides； colonization

10.11707/j.1001-7488.201707012

2016-04-08；

2016-12-26。

“十二五”農村領域國家科技計劃課題(2012BAD19B0803)； 湖南省研究生科技創新基金項目(CX2015B294)； 中南林業科技大學研究生科技創新基金項目(CX2015B15)。

S763.13

A

1001-7488(2017)07-0111-07

* 周國英為通訊作者。