鹽脅迫下轉復合多基因歐美楊107楊幼苗生長及生理響應*

陳盼飛 左力輝 王桂英 王進茂 任亞超 楊敏生

(1.河北農業大學林學院 保定 071001； 2.廊坊市農林科學院 廊坊 065000)

鹽脅迫下轉復合多基因歐美楊107楊幼苗生長及生理響應*

陳盼飛1左力輝1王桂英2王進茂1任亞超1楊敏生1

(1.河北農業大學林學院 保定 071001； 2.廊坊市農林科學院 廊坊 065000)

【目的】 通過觀測轉復合多基因歐美楊107楊(轉基因107楊)幼苗在不同濃度鹽脅迫下生長性狀，質膜透性、光合作用等各項指標，以及外源基因表達產物積累量的變化，綜合評價轉復合多基因楊樹在鹽脅迫下的適應能力?！痉椒ā?以轉化成功且已經過驗證的轉基因107楊為試驗材料，未轉基因107楊為對照(CK)，進行組培擴繁，在幼苗株高10 cm時定植在花盆中，置于人工氣候室中培養。分別用0、3、6 g·L-1的NaCl溶液進行鹽脅迫處理，脅迫25天后觀測2個株系幼苗的生長指標、生理參數變化，以及甜菜堿與Bt毒蛋白的積累量?！窘Y果】 2個株系的生長指標觀測結果表明： 在低鹽濃度處理下，轉基因107楊幼苗株高增長量顯著高于非轉基因對照，轉基因株系幼苗地徑增長量與對照差異不顯著； 高鹽濃度處理下，2個株系幼苗株高與地徑均受到鹽脅迫的顯著影響。2個株系的生理參數觀測結果表明： 在低鹽濃度處理下，轉基因107楊幼苗質膜透性顯著低于對照107楊，葉綠素含量有一定程度的增加，凈光合速率與蒸騰速率顯著高于對照，光系統Ⅱ實際光合效率Y(Ⅱ)小幅度降低但顯著高于對照，光系統Ⅱ能夠保持較高的電子傳遞速率；Fv/Fm增幅較高，具有較大光合作用潛力。在高鹽濃度下，轉基因株系幼苗葉綠素含量降幅較小，而質膜透性、凈光合速率均顯著降低，Fv/Fm、Y(Ⅱ)均呈現較大幅度下降，光系統Ⅱ電子傳遞速率受到較大影響，光合能力下降，變化趨勢與對照相同，2個株系幼苗均受到較大程度的鹽害。轉基因株系中外源基因表達產物積累量的ELISA研究結果表明，隨鹽濃度的增加，Cry1Ac毒蛋白、Cry3A毒蛋白及甜菜堿含量都呈現增加趨勢； 在高鹽濃度脅迫下外源基因產物積累量均顯著增加?！窘Y論】 轉基因107楊在低濃度鹽脅迫下表現出良好的適應性，耐鹽性優于對照107楊。在高濃度鹽脅迫下轉基因株系與對照107楊均受到較大影響，轉基因株系并未顯示其優勢。鹽脅迫可以誘導外源Bt基因、BADH基因表達加強，鹽脅迫下轉基因107楊表現出良好的耐鹽和抗蟲潛力。

轉復合多基因； 歐美楊107楊； 耐鹽性；BADH基因；Bt基因

楊樹(Populus)是世界中緯度地區廣泛栽培的主要樹種之一。楊樹在我國北方地區生態建設和林業生產中占有不可替代的地位，我國楊樹種植面積遠遠超過世界所有其他國家楊樹人工林面積之和(盧孟柱等， 2006)。然而隨著楊樹栽培面積的不斷擴大，蟲害現象日趨嚴重，給生態環境和林業生產帶來前所未有的毀滅性災難； 另一方面，隨著土壤鹽漬化問題的日益加劇，可利用土地資源逐年減少，嚴重影響農林業生產和可持續發展。

目前，基因工程技術在楊樹抗蟲、耐鹽和耐旱等抗性遺傳改良方面取得了很多研究成果，在不同程度上提高了楊樹的抗蟲、耐鹽以及耐旱能力(Klockoetal.， 2014； Duetal.， 2012； Hanetal.， 2013)。綜合來看，依靠單基因轉化對楊樹進行遺傳改良獲得的效果有限，多基因導入或聚合育種可以作為培育楊樹新品種的一條可選途徑。前人在基因的修飾和改造、多基因表達載體的構建、轉基因植物的篩選和培育等方面進行了大量研究。王建革等(2006)通過基因槍法將雙價抗蛀干害蟲基因(BtCry3A+OC-I)、透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)、枯草桿菌果聚糖蔗糖酶基因(SacB)、報告基因nptⅡ以及調節基因JERF36等外源基因導入到庫安托楊(Populus×euramericana‘Guariento’)基因組，共獲得25株抗性植株，經過southern雜交和PCR檢測，外源基因成功整合到庫安托楊基因組中，其中7株含有上述全部5個外源基因。ELISA試驗表明，BtCry3A基因在7株庫安托楊中已得到表達，并且轉基因植株在濱海鹽堿地中生長良好。朱永興等(2015)以‘寧楊1號’(P.tomentosacv.Niyang-1)為轉化受體材料，建立楊樹多基因遺傳轉化體系，并對三價質粒MT(SOS1-SOS2-SOS3)進行了共轉化并建立了最佳的‘寧楊1號’多基因遺傳轉化體系，獲得14株PCR陽性株系。

本研究利用轉復合多基因(BtCry1Ac+BtCry3A+BADH)歐美楊107楊(Populus×euramericanacv. ‘74/76’)為試驗材料，以未轉基因歐美楊107楊為對照，在人工氣候室控制環境下，通過澆施不同濃度的NaCl水溶液進行鹽脅迫處理，觀測2個楊樹株系幼苗的株高、節間距等生長指標，電導率、光合相關參數等生理變化，以及轉基因株系外源Bt基因、BADH基因表達產物積累量的變化。通過綜合分析比較，探究轉多基因107楊在鹽脅迫下的生長和生理響應，為多元復合基因轉化及轉基因新品種培育提供借鑒和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為歐美楊107楊與轉復合多基因(BtCry1Ac+BtCry3A+BADH)歐美楊107楊(轉基因107楊)高抗株系1號，由河北農業大學遺傳育種實驗室提供。轉基因107楊是將3個目的基因構建在同一轉化載體上，采用農桿菌介導法，將外源基因整合到歐美楊107楊基因組中，獲得轉基因組培苗，經分子檢測、Bt毒蛋白檢測及初步抗性試驗，證明外源基因已整合到107楊基因組中，并進行了轉錄和表達，初步證明轉基因株系具有抗蟲性和耐鹽能力(王奧璇， 2015)。

1.2 試驗設計

對2個107楊株系進行組培擴繁，組培苗生根后，移入內徑5 cm、高8 cm的盆中，每個株系栽植50株。栽培用土壤為園土∶基質土=1∶3。盆栽苗置于人工氣候室中培養，條件為日溫26～28 ℃，夜溫18 ℃； 光周期： 14 h·d-1(光強10 000 Lx)。培養40天后，幼苗株高約10 cm時，選取生長一致的幼苗，定植在內徑18 cm、高20 cm的盆中，每盆2株，分別為對照107楊與轉基因107楊，共27盆。

定植2天后，分別用NaCl濃度為0、3、6 g·L-1的鹽溶液進行脅迫處理。每個處理設置9盆幼苗，3次重復。每隔4天澆1次鹽溶液，每次150 mL。鹽脅迫25天后，每株選取頂端第1片完全展開的成熟葉片，進行光合色素含量、光合作用指標和葉綠素熒光參數的測定。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 生長指標的測定 在鹽處理前和第25天時，分別用不銹鋼刻度尺、千分尺測量鹽脅迫前后的株高、地徑。每個處理9次重復。

1.3.2 質膜透性的測定 在鹽處理第25天時，分別取2個楊樹株系幼苗相同部位葉片，用去離子水沖洗2遍，用濾紙吸干葉面浮水后用打孔器打孔取樣，在電子天平稱量后放入50 mL三角瓶中，按200 mL·g-1加入去離子水，抽真空20 min，靜置2 h，用DDS-11A型電導儀測定電導值，然后將樣品在97 ℃中水浴30 min，靜置2 h，測定電導值，以相對電導率表示細胞原生質膜透性的大小。每個處理4次重復。

1.3.3 光合色素的測定 葉綠素 a、葉綠素 b含量的測定按照李合生(2000)方法，用上海精工722 s分光光度計進行測定，含量以 mg·g-1FW 表示。每個處理6次重復。

1.3.4 光合作用指標的測定 上午9： 00—10： 00在人工氣候室條件下采用Li-6400XT便攜式光合儀(美國拉格公司生產)進行光合速率有關指標的測定，其中包括： 凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)以及氣孔限制值(Ls)。每個處理6次重復。

1.3.5 葉綠素熒光參數的測定 測定前用暗處理夾片對楊樹幼苗的葉片進行20 min的暗處理。然后采用Porket PEA高速連續擊發式熒光儀(英國Bioscientific有限公司生產)測定幼苗光化學活性、光能吸收和轉化效率。葉綠素熒光參數的測定和光合作用指標的測定同時進行。每個處理4次重復。

1.3.6 轉基因株系葉片外源Bt毒蛋白含量的測定 采用美國Agdia公司Bt-Cry1Ab/1Ac及Bt-Cry3A ELISA試劑盒進行Bt毒蛋白含量的測定。稱取0.1 g左右(記錄實際質量)新鮮葉片，在液氮中研磨至粉末狀，加入1 mL 1× PBST提取緩沖液，研磨呈勻漿狀，10 000 r·min-1離心10 min取上清液用于Bt毒蛋白含量的檢測。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。每個處理6次重復。

1.3.7 葉片甜菜堿含量的測定 采用北京冬歌生物科技有限公司植物甜菜堿(Betaine)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒進行甜菜堿的測定。稱取0.1 g左右(記錄實際質量)新鮮葉片，液氮中研磨至粉末，加入0.9 mL PBS(濃度為0.01 mol·L-1，pH為7.4)提取緩沖液，勻漿充分，2 000～3 000 r·min-1離心20 min取上清液用于甜菜堿含量的檢測，具體操作步驟參照試劑盒說明書。每個處理3次重復。

1.4 數據分析

采用DPS v 7.05數據處理系統對各項參數進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下生長指標變化

稀土元素具有重要的指示性作用，可以判斷地層和礦體成因及物質來源[10，12]。據徐紅偉(2009)等研究，礦區蝕變巖稀土配分曲線與花崗巖接近一致，反映出二者在成因上存在密切關系。

由表1可知，轉基因107楊在3 g·L-1低濃度鹽處理下株高增長量小幅升高，但未達到顯著水平，且顯著高于相同濃度鹽處理下的對照107楊。在6 g·L-1高濃度鹽處理下，轉基因107楊株高增長量顯著降低，且與相同濃度鹽處理下的對照無顯著差異。對照107楊株系在不同NaCl濃度處理下，株高增長量均受到明顯抑制。在不同濃度鹽處理下，2個株系幼苗地徑均呈現逐漸降低的趨勢，在3 g·L-1低鹽濃度處理下，轉基因107楊地徑增長量比對照107楊高，但2個株系間差異不顯著。在6 g·L-1高鹽濃度處理下，2個株系地徑增長量均顯著降低且株系之間無顯著差異?？梢娫诘蜐舛塞}脅迫下轉基因107楊具有良好的適應能力，而在高濃度鹽脅迫下，2個株系幼苗均受到較大的鹽害影響。

表1 鹽脅迫下2個株系幼苗生長指標變化①

①小寫字母表示同一株系不同濃度NaCl處理條件下差異，大寫字母表示相同濃度NaCl處理條件下不同株系間差異，顯著性水平為0.05，下同。Lower case letters represent significant differences of same poplar lines at different treatment;capital letters represent significant difference of different poplar lines at same treatment. significant difference test level is at 0.05,the same below.

2.2 鹽脅迫處理對葉片質膜的傷害

大量研究報道，在鹽分脅迫下植物細胞質膜首先受到傷害，導致質膜透性增大，細胞內無機離子大量外滲，外界鹽離子大量進入，破壞細胞內離子平衡，致使細胞代謝失調，影響植物正常的生長發育。而植物則可以通過吸收并積累從外界環境進入的K+、Cl-等無機離子，或自身合成小分子有機類調節劑，如氨基酸類、糖類、多元醇和生物堿等調節滲透勢，抵御鹽脅迫對質膜的傷害，從而提高脅迫環境下的適應能力。圖1結果顯示，在3 g·L-1鹽濃度處理下，107楊相對電導率顯著增加41.23%，轉基因株系呈現小幅度降低，降低5.11%，顯著低于相同濃度處理107楊。在6 g·L-1鹽濃度處理下，2個株系相對電導率均顯著增大，且轉基因株系增幅高于107楊。在低鹽濃度處理下，轉基因株系相對電導率略微降低表明細胞可能通過外源BADH基因的表達，促使細胞內甜菜堿含量增加，避免了鹽脅迫對細胞質膜的傷害。而107楊電導率顯著增加，其質膜受到傷害。高鹽濃度下，轉基因株系質膜透性變化較大，2個株系質膜透性均受到顯著傷害。

圖1 鹽脅迫下質膜透性的變化Fig.1 Changes of plasma membrane permeability under salt stress圖中誤差棒為平均值的標準差； 小寫字母表示同一株系不同濃度NaCl處理條件下差異，大寫字母表示相同濃度NaCl處理條件下不同株系間差異，顯著性水平為0.05，下同。Error in the figure for the standard deviation. Lower case letters represent significant differences of same poplar lines at different treatment;capital letters represent significant difference of different poplar lines at same treatment, significant difference test level is at 0.05, the same below.

2.3 鹽脅迫處理對光合色素的影響

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素。鹽脅迫會對植物細胞產生一定的破壞性，破壞葉綠體結構，造成葉綠素含量降低從而影響植物的光合能力。研究植物鹽脅迫下的響應機制，葉片光合色素的含量可作為植物耐鹽生理研究的重要指標。鹽脅迫下2個株系葉片葉綠素含量測定結果見表2。在3 g·L-1鹽濃度處理下，2個株系葉綠素a、b和葉綠素總量均表現為不同程度增加，相同鹽濃度處理下轉基因株系增幅更大。在6 g·L-1鹽濃度處理下，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均呈現較大幅度降低，轉基因株系降幅較對照小。表明在鹽脅迫處理下轉基因株系耐受性較強。高濃度鹽處理對2個楊樹株系幼苗均產生了較大傷害。

2.4 鹽脅迫處理對光合參數的影響

不同濃度鹽處理下2個株系光合參數的測定結果見圖2。隨著NaCl濃度增加，107楊葉片凈光合速率Pn呈降低趨勢(圖2A)，3 g·L-1濃度鹽處理下光合速率下降22.6%，但未達到顯著水平，6 g·L-1濃度鹽處理下該數值顯著降低； 轉基因株系葉片凈光合速率呈先升高后降低，在3 g·L-1鹽濃度處理下凈光合速率升高18%，顯著高于相同鹽濃度處理107楊。在6 g·L-1鹽濃度處理下降低顯著，與相同鹽濃度處理107楊無顯著差異。說明低鹽濃度下轉基因植株可以通過提高光合速率來適應鹽脅迫條件。

表2 鹽脅迫下葉片光合色素含量的變化

圖2 鹽脅迫下2個株系光合有關參數的變化Fig.2 Changes of photosynthetic parameters under salt stress

不同濃度鹽處理下2個株系氣孔限制值(Ls)與胞間CO2濃度(Ci)變化見圖2B、2C。低鹽濃度下，107楊葉片Ci降低，但未達到顯著水平，而氣孔限制值Ls大幅度增加，凈光合速率下降，表現為氣孔限制。轉基因株系氣孔限制值小幅度降低，胞間CO2濃度降低，但未達到顯著水平，凈光合速率增加，表明低鹽濃度下轉基因株系可以通過降低氣孔限制以適當提高光合速率，表現出較好的適應性。在高鹽濃度下，2個株系幼苗氣孔限制值顯著增加，Pn下降且Ci升高，這可能是由于高濃度鹽脅迫導致大量鹽離子在細胞中累積，破壞了葉綠體結構，造成葉綠素含量降低、葉片光合器官損傷，從而導致葉肉細胞光合活性下降，說明此時非氣孔限制已成為促使光合速率降低的主要因子。

鹽脅迫處理下2個株系幼苗蒸騰速率Tr(圖2D)變化趨勢與Pn相同。隨鹽濃度增加，對照107楊Tr逐漸降低，轉基因株系呈先升高后降低。在低鹽濃度下轉基因株系Tr顯著高于107楊，高鹽濃度處理下差異不顯著。植物在鹽脅迫下葉片氣孔限制值增大，導致水分蒸發和CO2傳輸受阻，從而抑制葉片的蒸騰作用和光合作用，而轉基因株系在低鹽濃度下氣孔限制值小幅度降低，氣孔導度增加，Ci升高，其Pn與Tr表現出一定程度的增大且顯著高于107楊。說明在低鹽濃度下轉基因株系可以通過降低氣孔限制以增強光合速率和蒸騰速率，提高轉基因株系的耐鹽性。

2.5 鹽脅迫處理對葉綠素熒光誘導動力學的影響

最大光量子產量Fv/Fm反映PSⅡ初始最大光能利用效率。Fv/Fm下降越多，代表PSⅡ受到的損傷程度越大。由圖3A可知，2個株系幼苗Fv/Fm均呈現先升高后降低的趨勢。在3 g·L-1鹽濃度脅迫下，轉基因107楊Fv/Fm增幅較大，說明轉基因楊樹具有較大光合作用潛力。6 g·L-1鹽濃度處理下2個株系Fv/Fm均下降明顯，說明該鹽濃度下2個株系均受到較大影響。

初始熒光Fo(圖3B)和最大熒光Fm(圖3C)分別表示PSII反應中心處于完全開放和關閉時的熒光產量。2個株系均表現出在低鹽濃度下Fo小幅度降低、高鹽濃度下升高的趨勢，對照107楊升幅較大。對照107楊最大熒光Fm隨鹽濃度增加逐漸降低，轉基因株系在低鹽濃度下無變化，在高鹽濃度下急劇下降。

Y(Ⅱ)反映光系統Ⅱ實際光合效率。PSⅡ反應中心在部分關閉狀態下，實際光能轉換效率可作為光合電子傳遞速率快慢的評測指標。從圖3D可知，無鹽脅迫和低鹽濃度下轉基因株系均保持較高的電子傳遞速率。低鹽濃度下107楊和轉基因株系Y(Ⅱ)分別降低7.41%、4.62%，轉基因株系顯著高于107楊，高鹽濃度下兩者均降低且無顯著差異。證明在低鹽濃度下轉基因楊樹光系統II能夠保持較高的電子傳遞速率，且受鹽害影響較小。高鹽濃度下2個株系電子傳遞速率均降到較低水平，受傷害程度較大。

圖3 鹽脅迫下2個株系葉綠素熒光參數的變化Fig.3 Changes of chlorophyll fluorescence parameters under salt stress

2.6 鹽脅迫下轉基因株系外源Bt毒蛋白含量的變化

外源Bt基因的導入可以使目標植物表達抗性蛋白從而獲得對靶標害蟲的抗性，但環境因素會對外源基因表達產生影響。鹽脅迫下轉基因株系外源Bt毒蛋白含量如表3所示。隨著NaCl濃度增大，Bt毒蛋白含量呈現增加趨勢。 在3 g·L-1鹽濃度處理下，Cry1Ac、Cry3A毒蛋白含量分別增加40.15%、50.49%；在6 g·L-1處理濃度下，Cry1Ac、Cry3A毒蛋白含量分別增加158.84%、144.04%。結果表明，鹽脅迫對外源Bt基因的表達起到促進作用，隨鹽濃度增加，毒蛋白含量增幅變大。

表3 鹽脅迫下轉基因株系Bt毒蛋白含量

2.7 鹽脅迫下葉片甜菜堿含量的積累

甜菜堿是一種天然無毒的小分子有機化合物。在植物受到環境脅迫時作為滲透調節物質在植物葉片中大量積累以降低滲透勢，維持細胞水分平衡，保護一些關鍵酶類，維持生物大分子的結構和完整性，維持植物正常的生理功能。不同濃度鹽處理下轉基因107楊幼苗葉片甜菜堿含量如圖4所示，隨鹽濃度增加，葉片甜菜堿含量逐漸增大，轉基因株系葉片甜菜堿含量顯著高于107楊。在無鹽處理條件下，轉基因株系葉片甜菜堿含量為107楊的2.97倍，6 g·L-1鹽濃度處理下上升到6.22倍，表明BADH基因的導入導致轉基因株系葉片甜菜堿含量大幅增加。隨鹽濃度增加，2個株系葉片的甜菜堿含量在3 g·L-1鹽濃度處理下增幅較大。在6 g·L-1鹽濃度處理下含量最高，2個株系甜菜堿含量分別為無鹽處理條件下的1.3倍與2.8倍。結果證明，低鹽濃度脅迫下，甜菜堿的積累量迅速上升，隨著鹽濃度增加，甜菜堿積累量增幅減緩，鹽脅迫在一定程度上可以誘導外源BADH基因表達加強。

圖4 鹽脅迫下2個株系葉片中甜菜堿的含量The content of betaine in leaves of two lines under salt stress

3 討論

本研究中，轉復合多基因(BtCry1Ac+BtCry3A+BADH)107楊中的耐鹽基因為BADH基因。BADH基因是合成甜菜堿醛脫氫酶的基因，而甜菜堿醛脫氫酶則是合成甜菜堿的關鍵酶。大量研究表明，甜菜堿的積累可以提高植物對環境脅迫的耐受性。李敏等(2013)研究指出耐鹽柳樹(Salix)L0911BADH基因的表達受鹽脅迫條件的誘導，說明鹽脅迫與BADH基因存在著緊密關聯。王亮(2006)在利用BADH基因轉化107楊的研究中，BADH基因的導入使得相同鹽脅迫條件下轉基因植株的相對電導率降低，轉基因植株受到傷害較小。此外，在鹽脅迫條件下部分轉基因株系葉綠素含量顯著高于對照株系，表明轉基因株系能夠更好地抵御鹽害影響。本研究中，在低鹽脅迫下轉基因株系相對電導率小幅度降低且顯著低于對照，而葉綠素含量均高于對照，表明導入BADH基因的株系受鹽害影響程度較小，這與前人研究結果相同。張士功等(1999)研究表明鹽脅迫下一定濃度的甜菜堿可以增加葉綠素含量，提高葉綠體對光能的吸收利用，從而降低鹽脅迫對光合作用的影響。另外，甜菜堿的積累還可以保護多種抗氧化酶的活性，降低活性氧的積累，維持膜的有序性和完整性，保護類囊體膜上蛋白復合體的功能，減輕脅迫對類囊體膜的破壞，維持較高水平的PSII活性及CO2同化速率，提高光合活性(梁超等， 2007)，最終提高轉基因植物的耐鹽性。本研究中，轉復合多基因107楊株系在無鹽脅迫條件下，甜菜堿積累量較低，此時BADH表達量較低，轉基因株系與對照生長及生理指標無顯著差異，而鹽脅迫處理可以誘導外源BADH基因加強表達，使轉基因株系葉片中甜菜堿獲得大量積累。在3 g·L-1低鹽濃度下甜菜堿含量迅速積累，并通過滲透調節維持細胞膜良好的穩定性，可以增加葉綠素含量，且能夠維持較高的PSII活性，增大氣孔導度、蒸騰速率，提高轉基因株系鹽脅迫下的凈光合速率，因此鹽脅迫下轉基因株系保持了相對較高的生長量。BADH基因的導入提高了轉基因株系對鹽脅迫適應能力。

許多研究表明： 在高鹽、干旱、低溫等脅迫誘導下，BADH基因表達量的增加在不同植物之間存在顯著差異(Nakamuraetal., 2001； 劉佳琪等， 2012)。在非脅迫條件下，基因工程使得轉基因植株在體內積累甜菜堿的含量為0.05～5 μmol·g-1FW(段曉光等， 2004)，耐鹽性強的胡楊(Populuseuphratica)受到鹽脅迫后甜菜堿含量顯著提高，特別是葉中甜菜堿含量達到1.90 μmol·g-1，提高約243倍(陳少良等， 2001)。本研究中轉基因株系在6 g·L-1鹽濃度脅迫下甜菜堿積累量最大，但僅相當于0.02 μmol·g-1，約為對照處理2.8倍，表明該基因的表達效果不強。在鹽脅迫下對各項生長指標與生理參數綜合性分析表明，轉基因株系3 g·L-1較低濃度鹽脅迫下，表現出良好的適應性，耐鹽能力強于非轉基因對照，然而在6 g·L-1較高鹽濃度脅迫下，雖然甜菜堿與Bt毒蛋白積累量繼續增加，但轉基因株系與107楊的各項生理指標對比并沒有表現出明顯差異，受鹽害程度較大。從而進一步證明，BADH基因表達能力較弱，在6 g·L-1較高鹽濃度脅迫下，同時超出轉基因株系幼苗對鹽害的耐受能力。當然，本研究僅為人工氣候室條件下盆栽幼苗試驗結果，轉基因株系在田間條件下的耐鹽性表現還需作進一步研究。

Ren等(2015)將多基因表達載體BtCry1Ac+BtCry3A+BADH轉化煙草(Nicotianatabacum)，每個外源基因均為CaMV35S啟動子，結果顯示BADH基因表達水平較低。本研究中轉基因株系所用植物表達載體與之相同，而外源BADH基因表達效果同樣較差，分析其原因可能是多基因排列順序或者多基因間由于啟動子相同而相互作用，導致多個外源基因不能同時高效表達。多基因表達載體的構建和轉化仍面臨一系列技術難題(袁飛榮等， 2011； Untergasseretal.， 2012)。在今后研究中，應考慮從以下幾方面進行改善，以期達到多個外源基因在轉基因植株中同時高效地表達： 首先，在構建轉化載體時，根據不同外源基因使用不同特異性啟動子，降低序列的重復性； 其次，構建載體時在外源基因兩側添加增強序列或者核基質結合區MAR，促使外源基因穩定高效地表達； 第三，可以通過優化起始密碼周邊序列，對基因編碼區進行修飾改造等方式增強翻譯效率，例如對基因進行修飾，使其更接近植物中GC含量，以提高其表達量。

有研究提出，鹽脅迫條件可以抑制或誘導多種cDNA克隆子、mRNA和特異蛋白質的合成，通過代謝產物的誘導或阻遏作用，影響相關基因表達，以適應脅迫條件下細胞內的特殊代謝反應(孫靜等， 2006； 趙鳳云等， 2007)。韓會景等(2007)將發根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)Ri質粒T-DNA轉入雙抗蟲基因‘741楊’[Populusalba×(P.davidiana+P.simonii)×P.tomentosa]株系Pb29后，生長素(IAA)和赤霉素(GA)含量升高，Bt毒蛋白表達受抑制，提出可能是發根基因促使激素含量提高，導致代謝發生變化，促進植物發根，但抑制了某些結構蛋白質的表達，從而使Bt毒蛋白的表達也受到抑制。經過鹽脅迫處理后，激素含量呈降低趨勢，Bt毒蛋白的表達上升。這可能是由于鹽脅迫使轉基因楊樹生長素和細胞分裂素類物質表達受到抑制，而誘導產生一些特異抗鹽蛋白，從而緩解對Bt毒蛋白的表達抑制。本研究中Bt毒蛋白的含量隨鹽處理濃度增加呈現升高趨勢，其原因可能是正常條件下外源基因表達受到植物的某種抑制，但隨著鹽處理濃度的增大，細胞內代謝發生變化，某類代謝產物的積累或者減少緩解了Bt基因的表達抑制。

4 結論

在人工氣候室控制條件下，通過盆栽澆施不同濃度NaCl溶液進行鹽脅迫處理，25天時對轉多基因107楊及未轉基因對照107楊生長性狀、生理指標的測定結果表明，鹽脅迫下轉基因107楊幼苗生長受鹽害影響較小； 在3 g·L-1低鹽濃度處理下，轉基因株系質膜透性顯著低于107楊，葉綠素含量升高幅度較大，蒸騰速率與凈光合速率增加且顯著高于107楊； Y(Ⅱ)小幅度降低但顯著高于對照，光系統II能夠保持較高的電子傳遞速率；Fv/Fm上升幅度較大，表明轉基因株系具有較大光合作用潛力。在6 g·L-1高鹽濃度處理下，轉基因株系葉綠素含量降低，而質膜透性、凈光合速率均顯著降低，Fv/Fm、Y(Ⅱ)均呈現較大幅度下降，光系統Ⅱ電子傳遞受到較大影響，光合能力下降，變化趨勢與對照無顯著差異，2個株系幼苗均受到較大程度的傷害。轉多基因107楊在3 g·L-1低鹽濃度處理下表現出良好的適應性，耐鹽性優于107楊； 在6 g·L-1高鹽濃度處理下轉基因株系與對照107楊均受到較大影響，轉基因株系并未顯示其優勢。對轉基因株系中外源基因表達產物積累量的研究結果表明，隨鹽濃度的增加，Cry1Ac毒蛋白、Cry3A毒蛋白及甜菜堿的含量逐漸增加，在高鹽濃度脅迫下積累量顯著增加，鹽脅迫在一定程度上可以誘導外源Bt基因、BADH基因表達加強。

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(責任編輯 王艷娜 郭廣榮)

Growth and Physiological Responses of TransgenicPopulus×euramericanacv. ‘74/76’ with Multiple Genes Under Salt Stress

Chen Panfei1Zuo Lihui1Wang Guiying2Wang Jinmao1Ren Yachao1Yang Minsheng1

(1.CollegeofForestry,AgriculturalUniversityofHebeiBaoding071000; 2.LangfangAcademyofAgriculturalandForestrySciencesLangfang065000)

【Objective】 This paper aimed to comprehensively evaluate the adaptability of transgenicPopulus×euramericanacv. ‘74/76’ with multiple genes (Abbreviation：Transgenic poplar 107) under salt stress through measurements of growth traits, membrane permeability and photosynthesis and other physiological parameters of the transgenic polar 107 under different salt stresses, as well as of the change in the accumulation amount of exogenous gene expression products. 【Method】 The transgenic polar 107 was used as test material, which had been verified successful transformation. The transgenic materials were propagated by tissue culture, and then the obtained seedlings were transplanted in pots when their heights were up to 10 cm. The seedlings were cultured in growth chamber and treated with NaCl solutions which concentrations were 0, 3, and 6 g·L-1, with the nontransgenic poplar 107 served as the control (CK). The growth indexes and physiological parameters, as well as accumulation of betaine and Bt toxin proteins of two lines were measured in 25 days after treatment. 【Result】 The results showed that under low salt concentration treatment, the height of transgenic poplar 107 was significantly higher than that of poplar 107, and the diameter of the transgenic lines was greater than that of poplar 107. Under high salt concentration, the height and the ground diameter of the seedlings of the two lines all were significantly affected by salt stress. Under low salt concentration, membrane permeability of transgenic poplar 107 was significantly lower than that of polar 107, chlorophyll content increased more greatly, and both net photosynthetic rate and transpiration rate increased and were significantly higher than that of polar 107. The actual photosynthetic efficiencyY(Ⅱ) of photosystem Ⅱ decreased slightly, but significantly higher than that of the control, indicating that photosystem Ⅱ was able to maintain higher electron transfer rate.Fv/Fmhad a relatively greater increase, suggesting increased photosynthetic capacity. Under high salt concentration, the chlorophyll content of transgenic lines decreased slightly. However, both the plasmalemma permeability and net photosynthetic rate decreased significantly,Fv/FmandY(Ⅱ) had a sharp decline, electron transfer rate of photosystem Ⅱ was affected greatly and photosynthetic capacity decreased. The all change trends were the same as that of control, and the seedlings of two lines suffered to a great degree salt damage. The accumulation amount of exogenous genes expression in transgenic lines, detected by ELISA, showed that with the salt concentration increasing, the contents of Cry1Ac toxin protein, Cry3A toxin protein and betaine all had an increasing trend. The accumulation of exogenous genes products significantly increased under the stress of high salt concentration. 【Conclusion】 Transgenic polar 107 displayed strong adaptability under low concentration salt stress, and its salt tolerance was stronger than the polar 107. Both transgenic polar 107 with multiple genes and control polar 107 were to a great degree impacted under high concentration salt stress, and transgenic line did not show any advantage. Salt stress induced an expression enhancement of the exogenousBtgene andBADHgene, suggesting that the transgenic poplar 107 would show a good salt tolerance and insect resistance potential under salt stress.

transgenic with multiple genes；Populus×euramericanacv. ‘74/76’； salt tolerance；BADHgene；Btgene

10.11707/j.1001-7488.20170705

2016-04-22；

2017-02-21。

國家自然科學基金項目(31370663)； 國家高技術研究發展計劃(“863”計劃)項目(2013AA102703)。

S718.43

A

1001-7488(2017)07-0045-09

*楊敏生為通訊作者。