剛毛檉柳ThP5CR基因的克隆及抗逆功能分析*

唐緋緋 趙玉琳 王培龍 馮德明 宋 怡 高彩球

(東北林業大學 林木遺傳育種國家重點實驗室 哈爾濱 150040)

剛毛檉柳ThP5CR基因的克隆及抗逆功能分析*

唐緋緋 趙玉琳 王培龍 馮德明 宋 怡 高彩球

(東北林業大學 林木遺傳育種國家重點實驗室 哈爾濱 150040)

吡咯啉-5-羧酸還原酶； 剛毛檉柳； 基因表達； 耐鹽； 抗旱

植物的抗逆性是數量性狀，涉及大量抗性基因的表達與調控作用，有著復雜的分子調控機制。因此，研究植物逆境表達調控網絡對揭示植物抗逆機制至關重要。脯氨酸是植物體內重要的滲透調節物質，在植物抗滲透脅迫過程中起重要作用，主要通過穩定生物膜的完整性、維持蛋白質的高級結構、參與蛋白質的折疊等生理生化過程發揮作用(Verbruggenetal., 2008)。研究表明脯氨酸具有清除活性氧的作用，提高了過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性； 可以調節細胞穩態。在鹽脅迫下植物脯氨酸的合成增加，可以使NADPH/NADP+保持低比值，進而維持光反應中心的電子流，穩定氧化還原態，降低光合機構的光抑制(陳吉寶等， 2010； Chavesetal., 2009)。

脯氨酸生物合成途徑首先在大腸桿菌(Escherichiacoli)上被闡明，目前植物體中存在2種脯氨酸合成途徑： 1)Glu途徑： 谷氨酸首先在γ-谷氨酰激酶(glutamylkinase)的催化下合成谷氨酰磷酸，其被還原成谷氨酸-半醛(GSA)，GSA再自發地環化形成吡咯啉-5-羧酸(P5C)，P5C最后在P5C還原酶(P5CR)催化下還原為脯氨酸(Székelyetal., 2008)。2)Orn途徑(氮素充足途徑)： 精氨酸由精氨酸酶(ARG)轉化為鳥氨酸。鳥氨酸通過δ-轉氨酶(δ-OAT)直接誘導發生轉氨反應失去氨基后形成GSA，GSA再通過谷氨酸途徑最終在P5CR的催化作用下合成脯氨酸(Da Rochaetal., 2012)。表明P5CR在脯氨酸合成途徑中具有重要作用。目前已報道的P5CR有400多種，其中3個蛋白的晶體結構已被成功解析(Mengetal., 2006)。但目前對脯氨酸參與植物抗逆性的研究，多集中于△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(P5CS)，而對P5CR基因的抗逆功能研究非常少。

剛毛檉柳(Tamarixhispida)是生長在干旱沙漠中的樹種，它能吸收到深層的地下水，還有很強的抗鹽堿能力，能在含鹽0.5%～1%的鹽堿地上生長。因此鑒定和分離剛毛檉柳耐鹽抗旱基因并研究這些基因的抗逆功能具有重要意義(張道遠等, 2003)。本研究從剛毛檉柳中克隆獲得ThP5CR基因，利用實時熒光定量RT-PCR分析了ThP5CR基因響應不同非生物脅迫(高鹽、干旱)和激素處理(ABA、GA3、JA)下的相對表達模式，進一步構建了ThP5CR基因過表達載體(pROKⅡ-ThP5CR)，將其在剛毛檉柳中瞬時表達，分析比較轉基因剛毛檉柳和對照剛毛檉柳(轉pROKⅡ空載體)抗逆性差異，以初步鑒定ThP5CR基因功能。該研究為進一步分析檉柳抗逆機制和P5CR基因的抗逆功能以及進一步利用基因工程手段提高植物抗逆性奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料及脅迫處理

將剛毛檉柳種子播種于塑料筐中，栽培基質為2∶1(V/V)的泥炭土和砂子混合基質。溫室中培養，溫室平均溫度控制在24 ℃，光暗周期14 h/10 h，相對濕度在70%～75%。2個月生剛毛檉柳幼苗分別用0.4 mol·L-1NaCl、20%(W/V)PEG6000、100 μmol·L-1ABA、50 μmol·L-1GA3和100 μmol·L-1JA溶液進行澆灌處理，處理時間為6，12，24，48，72 h。同時以正常澆水剛毛檉柳材料作為對照。脅迫處理后分別取剛毛檉柳根部和葉部組織。經液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱用于RNA的提取。

1.2 檉柳ThP5CR基因的克隆和序列分析

以“Pyrroline 5 Carboxylate Reductase”作為關鍵詞，對實驗室前期構建的剛毛檉柳7個轉錄組的Unigenes BLAST比對結果進行查找，獲得ThP5CR基因cDNA序列，通過ORF founder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.htmL)程序，綜合BLASTX比對結果確定其開放讀碼框，選擇具有完整ORF的ThP5CR基因，設計引物，引物序列為：ThP5CR-F:GAAGACAGCGATGTGGTTGTAT；ThP5CR-R:CTTC CCAATCGCTCCAAACAAT。以剛毛檉柳cDNA為模板進行RT-PCR，進一步測序確定所獲得的ThP5CR基因序列。對克隆獲得的ThP5CR基因進行序列分析。用ProtParam(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)軟件計算推導ThP5CR基因編碼蛋白質的分子量及理論等電點。在NCBI上對剛毛檉柳ThP5CR基因進行氨基酸序列同源比較，選取與剛毛檉柳ThP5CR基因同源性較高的9種植物的P5CR基因蛋白序列，利用BioEdit軟件進行多序列比較，并利用MEGA軟件鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)預測系統發生樹。這9種植物分別是林煙草(Nicotianasylvestris)、煙草(Nicotianatabacum)、商陸(Phytolaccaacinosa)、番薯(Ipomoeabatatas)、菠菜(Spinaciaoleracea)、胡蘿卜(Daucuscarotasubsp.sativus)、甜菜(Betavulgarissubsp.vulgaris)、陽芋(Solanumtuberosum)和蕪菁(Brassicarapa)。

1.3 實時熒光定量RT-PCR

利用CTAB法提取剛毛檉柳不同組織總RNA，經DNaseⅠ(Promega) 消化處理，去除DNA污染。分別取1 μg總RNA進行反轉錄，反轉錄反應體系和操作參照Primer ScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)(Takara)說明。將反轉錄產物稀釋10倍，用作Real time RT-PCR反應模板。選擇剛毛檉柳β-tubulin、α-tubulin和β-Actin基因作為內參基因。內參和ThP5CR基因的定量PCR引物見表1。Real time RT-PCR 反應體系為20 μL，其中包括模板2 μL、基因特異性上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)和2×Power SYBR Green PCR master mix 10 μL。反應程序為： 95 ℃預變性30 s； 95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，80 ℃讀板1 s，45個循環； 72 ℃延伸7 min。3次重復。反應在MJ OpticonTM2儀器(BioRad Hercules.CA. USA.)上完成。實時定量RT-PCR數據利用2-△△CT法 (Livaketal., 2001)進行分析。

表1 qRT-PCR和載體構建的引物序列

1.4ThP5CR基因植物過表達載體構建

根據植物過表達載體pROKⅡ的多克隆位點及ThP5CR基因特征，設計引物時在ThP5CR基因5′端和3′端分別引入XbaⅠ和KpnⅠ限制性內切酶位點。以剛毛檉柳cDNA為模板，進行ThP5CR基因RT-PCR克隆，RT-PCR反應體系為20 μL，其中包括模板2 μL，基因特異性上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，dNTP Mix (10 mmol·L-1) 0.40 μL，10 ×LATaqPCR buffer 2.00 μL，LATaq(5 U·μL-1)0.25 μL。反應程序為94 ℃預變性3 min； 94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環； 72 ℃延伸7 min。使用膠回收試劑盒對擴增目的片段進行回收。用KpnⅠ和XbaⅠ酶分別對膠回收ThP5CR基因產物和pROKⅡ質粒進行雙酶切，分別回收后用T4連接酶進行連接。將連接產物轉化到大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態細胞，挑取單克隆分別用基因引物(pROKⅡ-ThP5CR-F和pROKⅡ-ThP5CR-R)和載體引物(pROKⅡ-F和pROKⅡ-R)進行PCR驗證。獲得ThP5CR基因過表達載體，命名為pROKⅡ-ThP5CR，轉化根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105。

1.5ThP5CR基因瞬時轉化剛毛檉柳及抗逆功能分析

根據Ji 等(2014)方法將構建好的EHA105(pROKⅡ-ThP5CR)和EHA105(pROKⅡ)(空載體，作為對照)分別瞬時侵染剛毛檉柳，分別標記為Con、OX。比較NaCl和甘露醇處理后2種瞬時表達剛毛檉柳的生理染色和生理指標以綜合評定ThP5CR基因的抗逆功能。具體的步驟為： 將生長20～30天剛毛檉柳組培苗放入1.2 mol·L-1甘露醇中浸泡5～10 min(高滲透處理)，再分別迅速轉移至已加有菌種EHA105(pROKⅡ-ThP5CR)和EHA105(pROKⅡ)(空載體，作為對照)的侵染液中，放入恒溫振蕩器24 ℃，120 r·min-1侵染4 h。取出苗后，用無菌水洗滌3～4次，無菌濾紙吸干水分，將剛毛檉柳無菌苗接種于MS培養基上，放置于室溫為(22±2)℃、相對濕度為65%～75%、光強為400 μmol·m-2s-1的組織培養室共培養36 h。36 h后將瞬時侵染剛毛檉柳轉移至含200 mmol·L-1甘露醇、150 mol·L-1NaCl的MS培養基上進行脅迫處理。分別收集脅迫處理12 h、24 h后的剛毛檉柳苗，用于組織化學染色、RNA提取和生理指標分析。同時以正常MS培養基培養侵染后的植株作為對照。生理指標分析包括脯氨酸、H2O2、MDA含量測定，生理染色包括氯化硝基四氮唑藍(NBT)、二氨基聯苯胺(DAB)、伊文思藍(Evans blue)染色(Zangetal., 2015; Silviaetal., 2012)。采用SPSS16.0軟件(SPSS,Chicago,Ⅱ,USA)分析差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1ThP5CR基因的克隆及序列分析

經轉錄組序列查找和進一步的RT-PCR克隆驗證，證實克隆獲得了檉柳ThP5CR基因，其cDNA長度為1 432 bp，其中開放閱讀框長度為822 bp，編碼273個氨基酸，相對分子量(molecular weight)為28.29 kDa； 理論等電點(theoretical pI)為9.22。Pfam分析結果表明，檉柳P5CR基因具有典型P5CR結構域； N端是具有催化功能的NADP結構域，C端是具有二聚體功能的P5CR結構域。此外還有典型的PDH脯氨酸脫氫酶結構域、谷氨酸激酶結構域等。

選擇9種與剛毛檉柳ThP5CR蛋白同源性較高的已知P5CR蛋白序列，利用BioEdit軟件和MEGA軟件分別進行多序列比對并構建進化樹，結果顯示10種植物的P5CR蛋白序列在圖中標記的N端的NADP結構域和C端的P5CR二聚體結構域相對保守，PDH脯氨酸脫氫酶結構域和谷氨酸激酶結構域也相對保守，而在225到230之間部分氨基酸序列不一致，但總體來說10種植物P5CR蛋白的氨基酸序列均較保守且序列長度也較相近(圖1A)，氨基酸序列一致性在75%～ 84%。其中剛毛檉柳ThP5CR蛋白與商陸、菠菜和甜菜的P5CR蛋白的同源性較高，氨基酸序列一致性分別可達84%、81%和80%。進化樹分析結果也顯示，剛毛檉柳與商陸、菠菜和甜菜親緣關系較近，歸為一組(圖1B)。

2.2 不同處理下剛毛檉柳ThP5CR基因的表達

2.2.1 不同脅迫下ThP5CR基因的表達 為了初步分析ThP5CR基因的功能，利用實時定量 RT-PCR分析了PEG和NaCl脅迫處理后剛毛檉柳ThP5CR基因的表達模式。結果顯示，PEG脅迫下，葉組織中ThP5CR基因表達在脅迫早期變化不明顯，脅迫24 h后表達量才明顯下調，隨后又逐漸增高，脅迫72 h后表達量是對照的2.73倍； 根組織中，ThP5CR基因的表達受PEG脅迫的快速誘導，脅迫6 h時，表達量即為對照的12.7倍， 隨后表達量逐漸被抑制，至72 h表達量最低，僅為對照的4.6%。NaCl脅迫下，檉柳葉組織中ThP5CR基因的表達變化主要表現為下調表達，24 h表達量最低，僅為對照的14.5%； 根中則相反，主要表現為誘導表達，6 h表達量最高，是對照的24.25倍(圖2)。

圖1 檉柳P5CR蛋白與其他植物P5CR蛋白的多序列比對(A)和系統進化樹分析(B)Fig.1 Multiple alignment(A) and clustering analysis(B) of P5CR proteins in Tamarix hispida and other 9 plant speciesNsP5CR： 林煙草Nicotiana sylvestris(XP_009773755); NtP5CR： 煙草Nicotiana tabacum(XP_016465541); PaP5CR： 商陸Phytolacca acinosa(ACT37661); IbP5CR： 番薯Ipomoea batatas(ADY77003); SoP5CR： 菠菜 Spinacia oleracea(KNA12919); DcP5CR： 胡蘿卜Daucus carota subsp. sativus(XP_017255032); BvP5CR： 甜菜Beta vulgaris subsp. vulgaris(XP_010672976); StP5CR： 陽芋 Solanum tuberosum(XP_006365049); BrP5CR： 蕪菁Brassica rapa(XP_009121629).

圖2 非生物脅迫處理下檉柳ThP5CR基因表達分析Fig.2 Expression analysis of ThP5CR in Tamarix hispida under abiotic stresses

2.2.2 不同激素處理下ThP5CR基因的表達 ABA處理后，與NaCl脅迫相似，葉中ThP5CR基因表達主要為下調表達，其中6 h表達量最低，為對照的0.11%； 根組織中，在大部分脅迫時間點都明顯被上調表達，同樣能對ABA處理作出快速應答，在脅迫6 h表達量即最高，為對照的49.66倍。JA處理下，葉中ThP5CR基因在脅迫早期(12 h之前)受明顯抑制，脅迫24 h以后表達上調，但和對照相比，差異不明顯； 根中也主要表現為受抑制(48 h前)，但脅迫72 h表達明顯受誘導，為對照的8.88倍。與其他幾種脅迫相比，GA3處理下，ThP5CR基因表達量變化小一些，但無論根還是葉中，在所研究的5個時間點中，都至少有2個時間點，表達量發生了明顯改變： 葉中脅迫24 h表達被明顯誘導(為對照的3.10倍)，48 h表達明顯被抑制(為對照的18.9%)； 根中6 h和48 h都被明顯誘導，而脅迫72 h，表達量則明顯下調。以上結果表明，ThP5CR基因能對上述5種處理作出應答，但表達模式不完全相同(圖3)。

2.3ThP5CR基因抗逆功能研究

2.3.1 瞬時表達剛毛檉柳的獲得 為了初步探究ThP5CR基因抗逆功能，將構建成功的重組載體pROKⅡ-ThP5CR進行剛毛檉柳瞬時轉化，同時以pROKⅡ瞬時侵染剛毛檉柳作為對照。提取2種瞬時侵染剛毛檉柳總RNA，反轉錄成cDNA，利用qRT-PCR分析瞬時轉基因株系中ThP5CR基因的表達情況。結果顯示，非脅迫條件下，瞬時過表達ThP5CR檉柳中該基因的表達量是對照的1.97倍。而150 mmol·L-1NaCl和200 mmol·L-1甘露醇脅迫12 h后過表達株系中ThP5CR基因的表達量分別是對照的41.2倍和35.5倍。表明成功獲得了瞬時過表達ThP5CR基因剛毛檉柳(圖4)。

圖3 不同激素處理下檉柳ThP5CR基因表達分析Fig.3 Expression analysis of ThP5CR in Tamarix hispida under different hormone treatments

圖4 非生物脅迫下檉柳ThP5CR基因的表達Fig.4 Expression analysis of ThP5CR in Tamarix hispida after abiotic stressCon: pROKⅡ空載對照; OX:pROKⅡ-ThP5CR過表達植株。下同。Con: Plants transformed with empty pROKⅡ; OX: Plants transformed with overexpression of pROKⅡ-ThP5CR. The same below.

圖5 非生物脅迫下剛毛檉柳轉基因植株和對照NBT、DAB和Evans blue染色比較Fig.5 NBT, DAB and Evans blue staining comparisons between transgenic and control Tamarix hispida under abiotic stress1: DAB, NBT和 Evans blue沒有進行脅迫處理的Con, OX的染色結果; 2∶150 mmol·L-1NaCl 和200 mmol·L-1 甘露醇12 h脅迫處理后Con, OX的染色結果。1: NBT, DAB and Evans blue staining of Con, OX plants without treatment; 2: The staining of Con, OX plants treated with 150 mmol·L-1 NaCl and 200 mmol·L-1mannitol for 12 h.

圖6 非生物脅迫下轉基因剛毛檉柳和對照剛毛檉柳的生理指標比較Fig.6 The comparison of physiological indicators between transgenic Tamarix hispida and control under abiotic stresses

2.3.3 生理指標的測定 為了探究ThP5CR的抗逆功能，進一步分析比較了NaCl和甘露醇脅迫后過表達ThP5CR基因剛毛檉柳和對照的脯氨酸含量、H2O2含量和MDA含量。結果(圖6)顯示，非脅迫處理條件下，OX株系的脯氨酸含量略高于對照，H2O2含量和MDA含量略低于對照，但差異不顯著。而在150 mmol·L-1NaCl和200 mmol·L-1甘露醇脅迫后，瞬時過表達ThP5CR植株的脯氨酸含量明顯高于對照植株，H2O2含量和MDA含量明顯低于對照植株，表明脅迫條件下，瞬時過表達株系的膜脂氧化程度降低，抗逆能力提高。提示ThP5CR基因可能是一個抗旱耐鹽能力優良的候選基因。

3 討論

3.1P5CR基因的結構與逆境脅迫下的表達

P5CR(吡咯啉-5-羧酸還原酶)是植物乃至生物體內的一種保守蛋白，其作用是催化脯氨酸生物合成的最后一步，即在NAD(P)H的作用下，將吡咯啉-5-羧酸轉化為脯氨酸。本研究從剛毛檉柳中克隆得到ThP5CR基因，該基因C端含有典型的P5CR二聚體結構域，N端含有NADP結構域，此外還有典型的PDH脯氨酸脫氫酶結構域、谷氨酸激酶結構域等。選取胡蘿卜等10種植物的P5CR氨基酸序列進行多序列比對與進化樹分析，結果顯示，P5CR蛋白氨基酸序列保守性較高，NADP結構域和P5CR二聚體結構域都是高度保守的結構域，這與Nocek等(2005)報道的結果一致。Ruszkowski等(2015)對蒺藜苜蓿 (Medicagotruncatula) MtP5CR蛋白的十倍體晶體結構和其產物NAD+、NADP+和L-Proline進行X射線研究表明，NADPH被認為是MtP5CR在體外的唯一輔酶。

實時定量RT-PCR分析ThP5CR基因在不同的脅迫處理后剛毛檉柳葉和根中的表達情況，結果表明5種不同處理均能產生不同程度的影響，尤其是PEG、NaCl和ABA處理后，根和葉中ThP5CR基因表達在大部分脅迫時間點都發生了明顯改變。此外，ABA激素處理下的基因表達趨勢與NaCl脅迫下表達趨勢相似，且ABA激素處理下的基因表達變化更為明顯，表明剛毛檉柳ThP5CR基因可能參與ABA信號途徑相關的NaCl脅迫應答。以往研究也表明P5CR基因的表達受PEG、NaCl和ABA等處理的影響，如Cao等(2015)對多年生黑麥草(Loliumperenne)進行PEG、NaCl和ABA處理，發現黑麥草LpP5CR基因的表達明顯受3種處理影響，且影響最為明顯的時間點均為上調表達。在日中花(Mesembryanthemumnodiflorum)中，在400 mmol·L-1NaCl處理后P5CR的活性是未處理的4倍(Lalibertéetal., 1989)。

3.2P5CR基因的抗逆功能

脯氨酸不僅是一種滲透調節物質，還是一種非常有效的抗氧化劑，并且可以調節細胞穩態(Rodriguezetal., 2005)。P5CS和P5CR是合成脯氨酸途徑的重要基因，但在P5CR基因方面研究的甚少，但目前發現P5CR是合成脯氨酸過程中重要的中間酶，催化P5C(吡咯啉-5-羧酸)轉化為脯氨酸，且可以通過Glu、Orn 2種途徑轉化為脯氨酸； 最近發現植物P5CR基因是通過輔酶的實用性、抑制產物和離子效應等復雜機制進行調控，這些機制可以使植物酶廣泛響應由任一P5CS同工酶或OAT合成的P5C，而無需一個轉錄控制，大大提高了合成脯氨酸的轉化效率(Gibertietal., 2014)。因此P5CR基因具有非常高的研究價值和廣闊的研究前景。

對剛毛檉柳ThP5CR基因表達分析發現，0.4 mol·L-1NaCl處理下，葉中ThP5CR基因的表達明顯低于對照。對2種瞬時侵染剛毛檉柳的ThP5CR基因表達分析也顯示150 mmol·L-1NaCl處理下，對照剛毛檉柳中ThP5CR基因的表達也低于非脅迫處理，而脅迫后脯氨酸含量無明顯差異。但甘露醇脅迫后ThP5CR基因的表達趨勢與NaCl脅迫類似，而脯氨酸的含量明顯低于對照。這可能由于剛毛檉柳對NaCl和甘露醇脅迫的響應機制不同，ThP5CR基因可能在蛋白水平應對2種脅迫的調控機制不同。NaCl脅迫不僅是滲透脅迫而且還會產生離子毒害，以往研究表明，P5CR基因受輔酶的實用性、抑制產物和離子效應等復雜機制的調控，這些機制可能對2種脅迫產生的作用也會有所不同(Gibertietal., 2014)。

此外，脯氨酸作為20種蛋白氨基酸之一，如果能抑制其合成，則能從一定程度上抑制植物的生長甚至致死。在抑制方面的研究，如Forlani等(2013)報道了26個氨基甲叉基雙膦酸類衍生物對P5CR具有抑制作用。還有研究表明，由于在MtP5CR結構的活性中心發現了一些丙磺酸分子，提出了4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)也可作為P5CR的抑制劑。在后期研究中會進一步構建抑制表達載體，進而全面研究P5CR基因功能。

4 結論

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(責任編輯 徐 紅)

Cloning and Stress Tolerance Analysis ofThP5CRfromTamarixhispida

Tang Feifei Zhao Yulin Wang Peilong Feng Deming Song Yi Gao Caiqiu

(StateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreedingNortheastForestryUniversityHarbin150040)

pyrroline 5-carboxylate reductase；Tamarixhispida； gene expression； salt tolerance； drought resistance

10.11707/j.1001-7488.20170701

2016-08-15；

2016-12-27。

國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2013AA102701)。

S718.46

A

1001-7488(2017)07-0001-09

*高彩球為通訊作者。