CBX2-1與p53相互作用的機(jī)制①

劉婷雋

(徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇 徐州 221000)

CBX2-1與p53相互作用的機(jī)制①

劉婷雋

(徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇 徐州 221000)

目的：檢測(cè)CBX2-1與p53是否存在相互作用，并一步檢測(cè)CBX2-1與p53發(fā)生相互作用的結(jié)構(gòu)域。方法：在大腸桿菌中表達(dá)GST-CBX2-1融合蛋白，GST pull down純化出蛋白與細(xì)胞裂解液混合，Western blot檢測(cè)兩個(gè)蛋白相互作用。同樣的方法進(jìn)一步檢測(cè)CBX2-1與p53發(fā)生相互作用的結(jié)構(gòu)域。結(jié)果：Western blot結(jié)果顯示CBX2-1與p53存在直接相互作用，相互作用的結(jié)構(gòu)域是CBX2-1蛋白N端1-288肽段和259-600肽段及p53蛋白的98-292肽段。結(jié)論：CBX2-1蛋白通過(guò)N端1-288肽段和259-600肽段與p53蛋白98-292肽段相互作用，為進(jìn)一步研究研究CBX2-1參與神經(jīng)性列腺癌的機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

CBX2-1；p53；蛋白質(zhì)相互作用

CBX2在發(fā)展性前列腺癌中最為潛在治療目標(biāo)發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移型前列腺癌中CBX2的表達(dá)量持續(xù)增高，CBX2的高表達(dá)與較差的前列腺癌臨床效果具有相關(guān)性。另外，在轉(zhuǎn)移型前列腺癌的細(xì)胞株中，CBX2蛋白的缺失能夠抑制細(xì)胞的存活，并誘發(fā)caspase3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[1]。人類CBX2存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，CBX2-1含有532個(gè)基因，CBX2-2含有211個(gè)基因[2]。前人的研究發(fā)現(xiàn),CBX2-1比CBX2-2表達(dá)量更高，對(duì)CBX2-1的探究更深入，于是本實(shí)驗(yàn)選取CBX2-1作為研究對(duì)象。

新的研究表明[3]，在多種癌癥中，CBX2基因量和mRNA的上調(diào)標(biāo)志著腫瘤遷移和低存活率的發(fā)生。臨床上，通過(guò)抑制CBX2的高表達(dá)作為藥物治療人類癌癥的重要手段。此外，CBX2還參與細(xì)胞周期的調(diào)控。有文獻(xiàn)報(bào)道，CBX2同源家族CBX8可以與p53協(xié)同作用調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌中細(xì)胞的增殖[4]。而p53基因是目前發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤發(fā)病相關(guān)性最大的抑癌基因之一，其功能主要包括細(xì)胞周期停止(分化或衰老)、DNA復(fù)制與修復(fù)及細(xì)胞凋亡[5]。既然CBX2和p53都是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要蛋白，兩者都可以調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞的分化，于是我們猜測(cè)CBX2-1是否與p53存在某種關(guān)系共同調(diào)節(jié)某些生命活動(dòng)。而絕大多數(shù)蛋白都是通過(guò)與其他核酸或者蛋白發(fā)生相互作用來(lái)參與生物代謝過(guò)程的，那么CBX2-1與p53是否存在相互作用，成為本實(shí)驗(yàn)的切入點(diǎn)。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，CBX2-1通過(guò)N端1-288肽段和259-600肽段兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與p53蛋白98-292肽段相互作用。

1 材料方法

1.1 材料

30%聚丙烯酰胺、凝膠上樣緩沖液、半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移緩沖液、Tris-Glycine電泳緩沖液、TBST、GST Resin 購(gòu)于南京金斯瑞公司、兔抗鼠二抗(HRP標(biāo)記)購(gòu)于上海Genetech公司、flag抗體、CBX2抗體購(gòu)于上海Abmart公司、ECL plus購(gòu)于美國(guó)GE公司。

1.2 重組蛋白在原核細(xì)胞中的大量表達(dá)

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜的培養(yǎng)液以1:50轉(zhuǎn)接于含100mL新鮮培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)1.5～2h，使OD值達(dá)0.4～0.6。加入IPTG(終濃度為0.5mM，37℃、250rpm條件下培養(yǎng)8h。

1.3 融合蛋白的純化

誘導(dǎo)后的細(xì)菌在4℃、5000rpm條件下離心15min，用冰PBS洗一次，離心去上清。取沉淀菌體，向沉淀中加入8mlPBS和終濃度為1mM的PMSF，超聲破碎大腸桿菌細(xì)胞，超聲條件為：超10s，停10s，40%功率，15min。整個(gè)超聲過(guò)程需在冰上進(jìn)行，以防超聲過(guò)程中蛋白質(zhì)預(yù)熱變性。

超聲后，12000rpm，離心15min取上清，分別與Glutathione Resin beads孵育，4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜，次日，3000rpm，5min，離心收集珠子。用含有500mM Nacl，1%TritonX-100的PBS洗滌珠子，4℃旋轉(zhuǎn)5min，共5次。離心收集珠子，SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)純化結(jié)果。

1.4 GST pull down檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用

上述實(shí)驗(yàn)中GST pull down后GST Sepharose beads 4℃留存；收集F293細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解1h，4℃條件下12000r/min離心15min，取上清；將上清液與beads混合，4℃孵育過(guò)夜；用含有500mM Nacl，1%TritonX-100的PBS洗beads；SDS-PAGE電泳后WB檢測(cè)相互作用結(jié)果。

上述實(shí)驗(yàn)中GST pull down后GST Sepharose beads 4℃留存，收集誘導(dǎo)表達(dá)His-Flag-CBX2的大腸桿菌，超聲劈碎菌液細(xì)胞，PBS重懸后beads混合，4℃孵育過(guò)夜；用含有500mM Nacl，1%TritonX-100的PBS洗beads；SDS-PAGE電泳后WB檢測(cè)相互作用結(jié)果。

1.5 Western Blot

細(xì)胞經(jīng)一系列處理后經(jīng)裂解液裂解，收取總蛋白(或收集beads，沸水煮沸5min，離心取上清)，等量的蛋白通過(guò)12%的SDS-PAGE膠進(jìn)行跑膠分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；洗滌后，用5%脫脂奶粉封閉，并分別用GST(1:2000)、p53(1:1000)、Flag(1:2000)、CBX2-1(1:500)抗體孵育，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠(1:2000)二抗室溫孵育2h，TBST洗膜；ECL顯色、發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 CBX2-1與p53存在相互作用

由于CBX2與p53的功能存在一定的相似處，兩者都參與腫瘤的發(fā)展，并調(diào)控細(xì)胞分化與細(xì)胞周期。于是我們猜測(cè)CBX2-1與p53在空間上是否存在相互作用。我們純化GST-CBX2-1蛋白，與F293細(xì)胞裂解液進(jìn)行GST pull down，然后用p53抗體檢測(cè)與CBX2-1相互作用。Western Blot結(jié)果表明，CBX2-1與p53存在相互作用(圖1)。

圖1 western blot檢測(cè)P53與CBX2-1相互作用

2.2 CBX2-1與P53存在直接相互作用

圖1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了CBX2-1與p53存在相互作用，但并不能確定兩個(gè)蛋白之間是否可以存在直接相互作用，因此我們接下來(lái)通過(guò)原核表達(dá)的方法檢測(cè)兩個(gè)蛋白是否存在直接相互作用。我們首先通過(guò)PCR的方法將p53擴(kuò)增出來(lái)，然后構(gòu)建含有GST-標(biāo)簽的PGEX質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)化至BL21中誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)我們將CBX2-1構(gòu)建到含有his-flag-標(biāo)簽的pcold-2載體中在BL21中誘導(dǎo)表達(dá)。隨后通過(guò)GST-pull down親和純化GST-p53，純化后的p53與超聲的his-flag-CBX2-1菌液的超聲上清液孵育進(jìn)行GST-pulldown實(shí)驗(yàn)，用flag抗體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CBX2-1與p53存在直接相互作用(圖2)。

圖2 Western blot檢測(cè)P53與CBX2-1存在直接相互作用

2.3 CBX2-1通過(guò)1-288和259-600兩段與p53蛋白相互作用

既然CBX2-1蛋白與P53之間可以存在直接相互作用，那么CBX2-1蛋白通過(guò)哪個(gè)結(jié)構(gòu)域與其相互作用成為我們感興趣的問(wèn)題。根據(jù)CBX2-1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能我們將其分成CBX2-1-1(1-288)、CBX2-1-2(259-600)、(601-1956)三段進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別構(gòu)建進(jìn)帶有GST標(biāo)簽的pGEX載體中，然后誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)GST-pull down純化后，檢測(cè)是哪一段domain與p53發(fā)生作用。首先收集2盤(pán)10cm板的F293細(xì)胞，加入1.6ml的lysis buffer冰上裂解1h后離心取上清，將上清與純化出的GST-CBX2-1 3段蛋白混合過(guò)夜，用p53抗體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CBX2-1主要通過(guò)1-288和259-600兩段與p53蛋白相互作用(圖3)。

圖3 Western blot檢測(cè)CBX2-1與p53蛋白相互作用的domain

2.4 p53通過(guò)98-252肽段與CBX2-1蛋白相互作用

同樣的，為了進(jìn)一步研究p53蛋白與CBX2-1相互作用的結(jié)構(gòu)域，我們根據(jù)p53蛋白的空間結(jié)構(gòu)將其分為p53-1(1-97)，p53-2(98-292)，p53-3(293-393)三段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建成帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白，隨后GST pull down純化后與F293細(xì)胞裂解液混合，檢測(cè)是哪一段domain與CBX2發(fā)生作用。WB結(jié)果顯示p53蛋白主要通過(guò)98-292肽段與CBX2-1相互作用。

圖4 Western blot檢測(cè)p53與CBX2-1蛋白相互作用的domain

3 討論

多梳家族(PcG)蛋白可以作為組蛋白修飾激酶，通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)參與基因表達(dá)的調(diào)控。研究表明，PcG成員參與不同的細(xì)胞過(guò)程，例如干細(xì)胞分化、細(xì)胞命運(yùn)決定、衰老、哺乳動(dòng)物或腫瘤形成過(guò)程中調(diào)節(jié)X染色體的失活[6～8]。CBX2，是Pc家族同系物，N端含有染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域，C端含有高度保守的Pc盒。在人類CBX2基因座上，含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄體，一個(gè)轉(zhuǎn)錄體是由5個(gè)外顯子組成含有532個(gè)基因的亞體CBX2-1，另一個(gè)轉(zhuǎn)錄體CBX2-2由4個(gè)外顯子組成包含211個(gè)基因。

p53是重要的腫瘤抑制因子，p53基因編碼的蛋白P53是一種轉(zhuǎn)錄因子，主要分布于細(xì)胞核漿，在正常情況下其功能就好似“基因衛(wèi)士”，監(jiān)測(cè)基因組的完整性，一旦發(fā)現(xiàn)損傷將激活一系列信號(hào)通路，包括細(xì)胞周期停滯、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡，細(xì)胞衰老等[8，9]。

既然CBX2和p53都是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要蛋白，兩者都可以調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞的分化，于是我們猜測(cè)CBX2-1是否也可以與p53共同作用調(diào)節(jié)某種生命活動(dòng)。

首先運(yùn)用GST pull down原理發(fā)現(xiàn)CBX2-1與p53存在相互作用，為了檢測(cè)兩者之間是否可以存在直接相互作用，我們嘗試在大腸桿菌中分別誘導(dǎo)表達(dá)兩個(gè)蛋白進(jìn)行pull down實(shí)驗(yàn)。因此我們分別誘導(dǎo)表達(dá)了GST-P53和His-flag-CBX2進(jìn)行pull down實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)兩者之間可以存在直接相互作用。進(jìn)一步分析兩者之間的相互作用機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)CBX2-1主要通過(guò)1-288肽段和259-600肽段與p53相互作用，并且p53通過(guò)98-292肽段與CBX2-1相互作用。

但這種相互作用對(duì)于CBX2-1功能具有何種意義，CBX2-1是否能和p53協(xié)同作用共同調(diào)節(jié)結(jié)腸癌中細(xì)胞的的增殖，其是否與神經(jīng)性前前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系，還需我們進(jìn)一步證實(shí)。本文為研究CBX2-1參與神經(jīng)性前列腺癌的機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

[1]Clermont PL.Identification of the epigenetic reader CBX2 as a potential drug target in advanced prostate cancer[J]. Clin Epigenetics,2016,8:16

[2]Katoh-Fukui.Male-to-female sex reversal in M33 mutant mice[J]. Nature,1998,393(6686):688-692

[3]Clermont.Genotranscriptomic meta-analysis of the Polycomb gene CBX2 in human cancers: initial evidence of an oncogenic role[J]. Br J Cancer, 2014,111(8):1663-1672

[4]Tang J.Paradoxical role of CBX8 in proliferation and metastasis of colorectal cancer[J]. Oncotarget, 2014,5(21):10778-10790

[5]Horn H.F. and K.H. Vousden, Coping with stress: multiple ways to activate p53[J]. Oncogene, 2007,26(9):1306-1316

[6]Kennison JA.The Polycomb and trithorax group proteins of Drosophila: trans-regulators of homeotic gene function[J]. Annu Rev Genet, 1995,29:289-303

[7]Ringrose L. and R Paro. Epigenetic regulation of cellular memory by the Polycomb and Trithorax group proteins[J]. Annu Rev Genet, 2004,38:413-443

[8]Sparmann A and M van Lohuizen.Polycomb silencers control cell fate, development and cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2006,6(11):846-856

[9]Sun T and J Cui.Dynamics of P53 in response to DNA damage: Mathematical modeling and perspective[J]. Prog Biophys Mol Biol, 2015,119(2):175-182

江蘇省高校自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目，編號(hào)：13KJD180003。

劉婷雋(1990～)女，江蘇徐州人，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師。

Q812

A

1008-0104(2017)04-0084-02

2017-03-19)