骨髓間充質干細胞對大鼠急性胰腺炎的治療①

石 慧,艾迎春,劉 敏

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

骨髓間充質干細胞對大鼠急性胰腺炎的治療①

石 慧,艾迎春,劉 敏

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:研究骨髓間充質干細胞對大鼠急性胰腺炎的治療效果。方法:實驗分為正常對照組，AP組，移植組。用L-精氨酸建立大鼠急性胰腺炎模型，行骨髓間充質干細胞移植術，運用全自動生化分析儀檢測12h、24h、48h、72h血清脂肪酶含量；標本病理評分分析病變；采用免疫組化法測定胰腺中MMP-9、NF-KB的定位與定量。結果:12h、24h、48h、72h移植組血脂肪酶含量、病理評分、胰腺組織中MMP-9、NF-KB表達均顯著低于AP組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但移植組高于正常組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論:骨髓間充質干細胞對大鼠急性胰腺炎有緩解治療作用，發(fā)病機理闡述不詳盡。

骨髓間充質干細胞； 急性胰腺炎； 血淀粉酶； MMP-9；NF-KB

急性胰腺炎的發(fā)病率呈逐漸上升，死亡率呈穩(wěn)定趨勢。輕者胰腺充血、水腫為主，常自限。重者胰腺出血、壞死，易發(fā)生腹水、休克、腹腔感染、MODS等多種伴發(fā)癥，死亡率高。胰腺的腺泡損傷、被激活的單核巨噬細胞與具有活性胰酶的釋放，促使中性粒細胞產生大量的炎性物質，這些大量的炎性物質能夠引起微循環(huán)的障礙與胰腺血管通透性增高，使得胰腺發(fā)生炎癥及壞死[1]。MMP- 9作為一種炎癥級聯(lián)效應的下游靶分子出現(xiàn),它對許多促炎因子發(fā)揮正反饋調節(jié)功能,是炎癥反應重要的蛋白分子，同時它與胰腺炎的嚴重程度成比例，與病情的預后有著密不可分的聯(lián)系。NF-KB是一種介導炎癥應答的起始因子，在胰腺炎的病理過程中參與全程，對它的研究是應用于每個研究階段。急性胰腺炎屬于一種炎癥性疾病，能夠有效地抑制炎癥反應，是解決本病的重要步驟。骨髓間充質干細胞在組織炎癥損傷與修復的過程在臨床中起到先導的作用。而且，近期大量資料報道，骨髓間充質干細胞具有旁分泌作用，通過分泌的因子，可以有效地減輕胰腺炎的病變程度，對于胰腺炎是一種新的治療治療手段，為本病的治療開辟了一個新的研究渠道，讓我們更深刻的、更綜合的了解、認識細胞的多種功能，從而對疾病有全面的理解。

1 材料與方法

1．1 材料

60只健康級SD雄鼠，體重約200g，選自佳木斯大學動物實驗中心，選擇全自動生化分析儀，MMP-9、NF-KB的相應一抗、二抗試劑。

1．2 方法

將60只大鼠隨機分成3組，每組20只，采用L-精氨酸分別3次腹腔注射，間隔1h，制備AP模型。選取出生14d小鼠，選擇第3代小鼠骨髓間充質干細胞制成單細胞懸液，濃度為1mL/只，造模成功后，在移植組大鼠的尾靜脈處注入細胞懸液，觀察大鼠的一般狀態(tài)如精神狀態(tài)、活動程度、飲食情況，于12h、24h、48h、72h，分別取每組大鼠中5只進行實驗，以10%水合氯醛左下腹皮下注射麻醉，麻醉成功后，在左心室部位采集血液3mL，將血樣離心提取到EP管并在-20℃冰箱中儲存，必要時測定血脂肪酶，同時分離、提取胰腺組織，放于10%甲醛溶液中固定，以備用于HE、免疫組化等相關試驗。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 3組不同階段血脂肪酶

移植組較AP組降低。由表可知，骨髓間充質干細胞對血脂肪酶有一定的影響作用，但是資料顯示，血脂肪酶變化較快，不易檢測，因此，對于胰腺炎的診斷存在困難，不能準確代表胰腺炎的病變，意義不顯著。同時也說明骨髓間充質干細胞對血脂肪酶含量有一定的影響作用，但是機制目前研究不明確，而且意義闡述不明確。見表1。

表1 血脂肪酶含量

2.2 3組不同階段胰腺病理評分

在各個水平時間段移植組均低于AP組P<0.05，差別有統(tǒng)計學意義。但比正常組高，可見移植組未達到正常水平，見表2。

2.3 3組不同階段組織MMP-9、NF-KB

移植組MMP-9、NF-KB的表達較AP組低，AP組較正常組高，移植組比正常組高，見圖1。

表2 病理評分，分)

圖1 3組不同階段組織MMP-9、NF-KB：移植組MMP-9、NF-KB的表達

3 討論

實驗從三個方面探究骨髓間充質干細胞對大鼠急性胰腺炎的治療作用，從三大方向進行分析，在這些方面(P<0.05)，差別有統(tǒng)計學意義，移植組可以顯著降低血酶學指標、炎癥因子和減輕病變，有一定保護治療作用。最新研究顯示，血脂肪酶的特異性優(yōu)于血淀粉酶，更能進一步反應胰腺炎的病理變化，本蛋白酶隨著病情的發(fā)展能穩(wěn)定的表達，不僅可以反應病變的程度，更是評判胰腺炎發(fā)生的首選指標，具有易測性、特異性。實驗中移植組可以顯著降低它的含量，說明細胞可以將其抑制，減輕胰腺的過度損傷。病理分析見在每個階段移植組病理評分低于AP組(P<0.05)，差別有統(tǒng)計學意義，移植組可明顯減低病理評分，說明它對胰腺的破壞效應微弱，甚至起到保護修護作用，但機理不詳盡。MMP-9可以有效的評估急性胰腺炎的病變程度，此指標在胰腺炎的炎癥反應中發(fā)揮重要的作用，對以后胰腺炎的發(fā)生、發(fā)展意義不可忽視，有著重要的實用價值，而且是近幾年研究的新因子，其本質是炎癥性因子，對胰腺炎的炎癥反應病程中扮演著重要的角色。因此，有效的抑制MMP-9的表達，可抑制炎癥反應，可能在全身炎癥反應中起到一定的應用價值。近年的研究發(fā)現(xiàn)在心衰大鼠中MMP-9表達增加，間充質細胞移植可降低MMP-9在心衰大鼠心肌中表達[2，3]。可能間充質干細胞分泌多種細胞因子影響炎性細胞因子生成, 改變基質金屬蛋白酶-9分泌和活性阻止膠原蛋白網被降解,促進細胞外基質的合成,增加膠原沉積和纖維化,改變基質重構,有利于心功能改善[4]。同時，本實驗移植組的MMP-9在胰腺組織中的定位表達及含量均明顯低于急性胰腺炎組，說明骨髓間充質干細胞對MMP-9 有調控、抑制作用，可以減輕炎癥反應，避免對胰腺組織、細胞、間質的進一步損害，阻礙疾病的快速進展，發(fā)生機制可能與細胞的旁分泌有關系，但是具體是何種細胞因子、介質，何種復雜細胞網絡的建立相關文獻報道少見，將是我們接下來研究的重點課題。NF-KB在胰腺炎中呈現(xiàn)高度表達，并與一系列細胞因子相互作用，在胰腺炎的發(fā)生、發(fā)展中占據著主導地位，國內外文獻報道見，在骨髓間充質干細胞干預對高氧肺損傷新生大鼠核轉錄因子-KB和血小板內皮細胞黏附分子-1表達的影響的文章中提示 BMSCs 可抑制 NF-κB 的活化，減輕炎癥反應，促進高氧肺損傷的修復[5]。實驗證明，骨髓間充質干細胞可分泌IL-10、白介素-1受體拮抗劑和可溶性腫瘤壞死因子受體等多種抗炎介質。NF-KB是被公認的IL-10的主要胞內受體，同時IL-10支配著它的激活。目前文章顯示，IL-10可以有效降低NF-KB的含量，對其有控制效果，由此可見，骨髓間充質干細胞通過旁分泌發(fā)揮治療作用毋庸置疑。綜上所述，骨髓間充質干細胞對大鼠急性胰腺炎有一定的治療作用，可引起該指標明顯降低，上述指標在炎癥發(fā)展中起著至關重要的作用，可以有效將其抑制，阻斷了炎癥進展，減少組織及周圍鄰近器官的損傷，起到保護修復作用，預防發(fā)生全身炎癥反應綜合征，避免發(fā)生多器官功能障礙甚至衰竭，降低病人死亡率。骨髓間充質干細胞對上述指標的影響，可能是因為其特有的旁分泌作用機制，分泌的因子發(fā)揮其抑制作用，使指標明顯降低，其發(fā)病機制仍是今后研究的重點內容。圖3見AP時MMP-9、NF-KB易定位于胰腺細胞及間質，胞質中棕褐色呈強陽性，移植組有所變淡、含量減少。說明移植組的陽性率表達較AP組明顯降低，但尚未恢復正常水平。間充質干細胞除了很強的自我增殖及多向分化潛能而具有促進損傷組織再生修復能力外，還顯示出較強的抗炎能力。間充質干細胞的旁分泌作用，說明了此細胞的另一作用機制，調控免疫炎癥反應，但機制闡述不明。干細胞易發(fā)生癌變，細胞的移植存在免疫排斥反應，存在倫理道德問題等一系列的約束與限制，因而用于臨床受到極大挑戰(zhàn)，骨髓間充質干細胞治療炎性疾病技術仍處于動物研究層面，而且它的旁分泌作用目前成為研究的熱點，可以有效地解決細胞移植等一系列問題，在未來的日子里將是治療急性胰腺炎的一種最優(yōu)選擇，但是存在一些弊端仍需要解決，是以后日子里遇到的最大挑戰(zhàn)。

[1]田樺，邵艷艷，卓越.急性胰腺炎患者血清IL-1β和TNF-α的水平變化的研究[J]．黑龍江醫(yī)藥科學,2008，31(3):72

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[3]Spinale FG, CokerML, HeungLJ,et al. A matrix metalloproteinase induction/activation system exists in the human left ventricular myocardium and is upregulated in heart failure[J]. Circulation，2000,102:1944-1949

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[5]Ortiz LA，Dutreil M，F(xiàn)attman C，et al． Interleukin 1 receptor antagonist mediates the antiinflammatory and antifibrotic effect of mesenchymal stem cells during lung injury[J]． Proc Natl Acad Sci USA，2007，104: 11002-11007

佳木斯大學研究生科技創(chuàng)新項目，編號：YM2016_034。

石慧(1990～)女，黑龍江牡丹江人，在讀碩士研究生。

艾迎春(1960～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師。E-mail：haiyan7416_ncmc@163.com。

R576

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1008-0104(2017)04-0063-02

2016-10-10)