自噬相關(guān)蛋白LC3A與Ki67在胃腺癌中的表達①

邱瑞蘋，王彩霞

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

自噬相關(guān)蛋白LC3A與Ki67在胃腺癌中的表達①

邱瑞蘋，王彩霞

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：探討自噬相關(guān)蛋白LC3A在胃腺癌組織中的表達及其與Ki67的關(guān)系。方法：采用免疫組化Elivision方法檢測55例胃腺癌組織及25例正常癌旁組織LC3A和Ki67的表達情況。結(jié)果：(1)LC3A在胃腺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；(2)在胃腺癌組織中LC3A“石頭樣”結(jié)構(gòu)(“stone-like”structure，SLS)與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及Ki67的表達呈正相關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論：胃腺癌組織“石頭樣”結(jié)構(gòu)的高表達提示胃癌預(yù)后不良，LC3A聯(lián)合Ki67的檢測有助于胃腺癌的進展和預(yù)后的評估。

自噬；胃癌；LC3A

胃癌是最常見的消化道腫瘤，根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)發(fā)布的數(shù)據(jù)，在2012年有951600例新發(fā)胃癌病例，其中有723100例死于胃癌[1]，采取合適的治療手段提高患者的生存質(zhì)量是成為目前的熱點[2]。以往研究表明，腫瘤的發(fā)生是正常細胞基因突變后無限增殖與抗凋亡所致,近年來，一種與凋亡相似的生物現(xiàn)象—自噬引起人們的關(guān)注[3]。自噬(Autophagy)是指胞漿內(nèi)大分子物質(zhì)和細胞器被運送到溶酶體中被大量降解的生物學(xué)過程。細胞自噬的發(fā)生以胞內(nèi)出現(xiàn)自噬體(autophagosomes)為主要特征，它是一種雙層膜結(jié)構(gòu)、由胞質(zhì)成分構(gòu)成的細胞器，通過與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體來降解大分子物質(zhì)[4]。通過降解細胞內(nèi)物質(zhì)，一方面使大分子物質(zhì)和細胞器降解為氨基酸、核苷酸及游離脂肪酸，并被重新利用以合成新的大分子物質(zhì)，另一方面，可以減少異常蛋白質(zhì)和受損細胞器的堆積，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。自噬在人類多種疾病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、神經(jīng)退行性疾病、感染、心血管疾病、肺部疾病和人類老化等，在腫瘤方面的研究是近年來的熱點。自噬的發(fā)生過程總是伴隨著自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related gene，ATG)的調(diào)控。迄今為止已發(fā)現(xiàn)36種，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtuble associated protein light chain 3，MAPLC3)簡稱 LC3，是哺乳動物ATG8的同源物，是第一個被發(fā)現(xiàn)的自噬體標記蛋白,定位于自噬體膜上，其含量的多少與自噬泡的數(shù)量正相關(guān)，LC3有三種亞型，即LC3A、LC3B、LC3C。臨床上經(jīng)常運用Ki67作為胃癌惡性程度及評估預(yù)后的指標[5]。本實驗采用免疫組化方法檢測胃癌中LC3A和Ki67的表達，探討其與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，為胃癌的診斷、治療及預(yù)后提供客觀的參考指標，同時為胃腺癌分子靶向治療藥物的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 免疫組化石蠟標本:收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2014-01～2016-04經(jīng)手術(shù)切除的胃腺癌患者的組織蠟塊和HE切片。其中胃腺癌組織55例，癌旁正常組織25例。所有研究對象術(shù)前均未接受任何輔助治療，其中男40例，女15例，年齡35～79歲，術(shù)后病理證實高-中分化腺癌33例，低分化腺癌22例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例，有血管侵犯者29例，無血管侵犯者26例，有遠處轉(zhuǎn)移者17例，無遠處轉(zhuǎn)移者38例。

1.1.2 試劑:兔抗人單克隆抗體LC3A(稀釋比：1:200)購自Cell Signaling Technology公司，兔抗人單克隆抗體即用型Ki67、通用型二抗、DAB顯色液均購自福州邁新公司。采用已知LC3A陽性表達的腦組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2 方法

免疫組化Elivision法：將石蠟脫蠟、水化、自來水沖洗后，進行檸檬酸熱修復(fù)(pH6.0、熱修復(fù)2min)，滴加一抗(LC3A、Ki67)，37℃孵育3h，PBS沖洗后滴加放大劑(試劑A)，常溫孵育20minPBS沖洗后滴加多聚酶結(jié)合物(試劑B)，PBS沖洗后DAB顯色(LC3A、Ki67顯色時間為2～3min),經(jīng)過蘇木素復(fù)染、分化返藍、透明后封片。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 LC3A的判讀

彌漫性的胞漿表達為定位于胞漿內(nèi)彌漫的棕黃色顆粒樣著色，采用半定量積分法[4]，即陽性腫瘤細胞比例：小于10%為0分，10%～50%為1分，大于50%為2分，陽性腫瘤細胞強度：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分，兩者相乘，0～3分為低表達，4～6分為高表達；石頭樣表達：主要表現(xiàn)為胞漿內(nèi)球形深褐色的暈染結(jié)構(gòu)，隨機選取十個400倍腫瘤視野計算總的“石頭樣”結(jié)構(gòu)的個數(shù),取中位數(shù)(median value)為截斷值[5]，高于中位數(shù)(包括中位數(shù))的為高表達，低于中位數(shù)的為低表達。

1.3.2 Ki67的判讀:Ki67定位于細胞核棕黃色的表達，采用半定量積分法判讀。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件, 不同分組間蛋白的表達差異及各蛋白與臨床病理因素之間的關(guān)系采用χ2檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LC3A在胃癌組織中LC3A有兩種表達方式，即彌漫性胞漿表達(diffuse cytoplasmic)，見圖1、圖2、石頭樣表達(“stone-like”structure，SLS)，而在癌旁正常組織(見圖1)中只有少量彌漫性胞漿表達，在胃癌組織中，彌漫性胞漿表達方式陽性率為80%(20/25)，明顯高于對應(yīng)的癌旁組織(陽性率為36%)，見表1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 癌旁正常組織LC3A的表達 (Elivision法×200)(左上方為正常組織、 右下方為胃癌組織)

圖2 胃癌組織LC3A彌漫性胞漿表達 (Elivision法×200)表1 胃癌組織與癌旁組織LC3A彌漫性胞漿表達方式的比較

高低高表達率(%)χ2值P胃癌組織20580癌旁組織916369.9<0.05

2.2 “石頭樣”結(jié)構(gòu)僅見于胃癌組織內(nèi)，見圖3,經(jīng)分析后得出，每個400倍視野“石頭樣”結(jié)構(gòu)范圍為0～11個，中位數(shù)為5，胃癌組織中“石頭樣”結(jié)構(gòu)高表達率為70%(39/55)，與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki67的表達，見圖4，呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.3 彌漫性胞漿表達(高表達率為80%)與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、血管侵犯及Ki67的表達等無相關(guān)性，見表2。

圖3 胃癌組織LC3A石頭樣結(jié)構(gòu)(箭頭所示) (Elivision法×400)

圖4 胃癌組織Ki67胞核陽性表達 (Elivision法×200)表2 胃癌組織不同表達方式與臨床病理之間的關(guān)系

石頭樣結(jié)構(gòu)高低χ2值P彌漫性胞漿表達高低χ2值P分化程度 高-中分化249276 低分化1570.132>0.051750.17>0.05浸潤深度 T1～T3910154 T43067.79<0.052970.02>0.05淋巴結(jié)侵犯 陽性327336 陰性798.06<0.051151.78>0.05血管侵犯 陽性218263 陰性1880.06>0.051883.57>0.05遠處轉(zhuǎn)移 有152134 無24144.19<0.053170.19>0.05Ki67 高296269 低10109.32<0.051821.92>0.05性別 男2614346 女1322.48>0.051052.29>0.05年齡(歲) >60289316 ≤601171.25>0.051351.01>0.05

2.4 在胃癌組織中，高表達的石頭樣結(jié)構(gòu)伴隨著高表達的彌漫性胞漿表達，見表3，可能提示彌漫性胞漿表達反應(yīng)自噬的基礎(chǔ)水平。

表3 LC3A在胃癌組織中不同表達方式的關(guān)系

3 討論

自噬通過清除細胞內(nèi)受損的蛋白質(zhì)、細胞器、細胞內(nèi)病原體，限制炎癥反應(yīng)及自噬性細胞死亡等方式抑制腫瘤的發(fā)生；另一方面，自噬通過為腫瘤細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)、抑制凋亡作用、降低腫瘤細胞的敏感性、幫助癌細胞度過休眠期等方式促進癌組織的發(fā)展。綜上，自噬在腫瘤的發(fā)生和進展過程中起著雙刃劍的作用。大量文獻報道，LC3A在大部分惡性腫瘤中是高表達的，如卵巢癌、肝細胞性肝癌、皮膚鱗癌[6]、非小細胞型肺癌[7]和尿路上皮癌等，在我們的研究中，與癌旁組織(9/25)相比，胃癌組織LC3A表達(39/55)在是明顯升高的，表明自噬水平在惡性腫瘤中是升高的；在本實驗中，胃癌組織存在兩種表達方式，即彌漫性胞漿表達和“石頭樣”表達，但是彌漫性胞漿表達這種方式與臨床病理參數(shù)無統(tǒng)計意義，且石頭樣結(jié)構(gòu)的高表達與彌漫性的胞漿表達正相關(guān)，這些研究結(jié)果可能提示LC3A彌漫性胞漿表達反映了癌細胞基礎(chǔ)的自噬水平。

我們的研究表明，“石頭樣”結(jié)構(gòu)只表達在胃癌細胞中且與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、Ki67的表達呈正相關(guān)，提示預(yù)后不良，在55例胃腺癌組織中，高表達的石頭樣結(jié)構(gòu)有39例，高表達率為70%，在17例遠處轉(zhuǎn)移的病例中有15例LC3A“石頭樣結(jié)構(gòu)”高表達，腫瘤惡性程度越高，LC3A“石頭樣”結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的頻率越高，腫瘤細胞增殖活性相應(yīng)的越高。在其他惡性腫瘤中也可以看見相似的現(xiàn)象，例如，在肝細胞性肝癌中，“石頭樣”結(jié)構(gòu)數(shù)目與血清AFP、分化程度、血管侵犯等正相關(guān)，在前列腺癌中，“石頭樣”結(jié)構(gòu)與Gleason評分正相關(guān)，綜上表明高表達“石頭樣”的癌細胞代表了更高侵襲性和轉(zhuǎn)移性的癌細胞。

傳統(tǒng)手術(shù)切除是胃癌根本的治療方法，但是由于胃癌早期臨床癥狀不明顯，所以大部分患者發(fā)現(xiàn)時已到中晚期，腫瘤細胞對藥物的獲得性耐藥是癌癥治療的主要障礙，自噬可能在惡性腫瘤細胞的治療抵抗上扮演著重要的角色。已有研究證明，5-FU(5-氟尿嘧啶)可以使腫瘤細胞發(fā)生凋亡，也能使腫瘤細胞發(fā)生自噬，這種自噬可以對抗腫瘤細胞發(fā)生凋亡，在結(jié)腸癌細胞中運用自噬抑制劑3-MA(三甲基腺嘌呤)后，細胞凋亡作用增強[8]，運用自噬調(diào)節(jié)劑可能是癌癥靶向治療的新思路，而什么樣病人運用自噬調(diào)節(jié)劑可以對臨床治療有幫助呢？在胃癌患者中，LC3A“石頭樣”結(jié)構(gòu)的高表達可能提示這類患者運用自噬抑制劑會有好的臨床效果。對自噬水平明顯升高的患者運用自噬阻斷劑可能為胃癌的治療指出新思路。

綜上所述，LC3A“石頭樣”結(jié)構(gòu)可能是監(jiān)測胃癌預(yù)后理想的指標，高表達的“石頭樣”結(jié)構(gòu)預(yù)后差，腫瘤侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力強，在以后的研究中，聯(lián)合檢測ATG5、ATG9、ATG12等自噬相關(guān)蛋白，運用多種方法檢測可能更好的了解自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用。

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Highlights: Objective: Purpose To investigate the expression of autophagy-related gene LC3A in gastric carcinoma tissue and the relationship with Ki-67. Methods: Immunohistochemical method was used to determine the expression of LC3A and Ki67 in 85 cases of gastric adenocarcinoma tissue and 45 cases of normal tissue adjacent to carcinoma. Results：The expression of LC3A was significantly higher in gastric adenocarcinoma than normal tissue adjacent to carcinoma(P<0.05); Stone-like”structure (SLS) counts were closely associated with lymph node metastasis, depth of tumor invasion, metastases distant, and were positively related to the expression of Ki67(P<0.05). Conclusion: The increased number of SLS in gastric carcinoma was related to poor prognosis; it was useful to evaluate the development and the prognosis of the gastric adenocarcinoma by detecting the expression of LC3A and Ki67.

The expression and significance of sutophagy related gene LC3A and Ki67 in gastric adenocarcinoma

QIURui-ping，WANGCai-xia

(Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

autophagy;gastric carcinoma;LC3A

黑龍江省教育廳科研項目，編號：12541825。

邱瑞蘋(1988～)女，山西大同人， 在讀碩士研究生。

王彩霞(1966～)女，黑龍江綏化人，學(xué)士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。 E-mail：wcx19641027@163.com。

R735.2

B

1008-0104(2017)04-0008-03

2016-12-01)