果蠅幼蟲的甘油三酯和蛋白的測定方法①

陳潔茹， 陳曉偉，楊利敏,3

(1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯154007；2.北京大學分子研究所，北京100871；3.大連大學醫學院，遼寧 大連 116600 )

果蠅幼蟲的甘油三酯和蛋白的測定方法①

陳潔茹1， 陳曉偉2，楊利敏1,3

(1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯154007；2.北京大學分子研究所，北京100871；3.大連大學醫學院，遼寧 大連 116600 )

目的：了解果蠅三齡幼蟲甘油三酯和蛋白質的提取方法和操作的注意事項。方法：選取同時間段收集的WT1118果蠅三齡幼蟲雌雄各10只，以自制裂解液PBST進行裂解研磨。取材后，利用甘油三酯測定試劑盒(凍干粉型)GPO-PAP法和BCA蛋白質測定試劑盒，測量果蠅幼蟲體內甘油三酯和蛋白質含量，對雌雄幼蟲的甘油三酯和蛋白質含量進行分析。結果：發現雌性幼蟲體內，無論是甘油三酯或蛋白質含量都高于雄性幼蟲。結論：以果蠅三齡雌性幼蟲各10只為例，雌性幼蟲的甘油三酯和蛋白含量均高于雄性幼蟲。

果蠅幼蟲；提取方法；甘油三酯和蛋白質測試盒測定法；注意事項

果蠅(Drosophila)是生物科學實驗研究中不可缺少的模型，作為經典的模式生物，本身具有自身特異的優勢。首先，它的生長周期快，在25℃條件下，大約10～14d可繁殖一代至成蟲[1,2]。所以，為相同條件下，同時期收集同等大小及數量相同的蟲卵提供了條件。其次，果蠅培養基的制作方法已經成熟，可根據不同實驗條件而改變，在此所述為果蠅基礎培養基的制法：例如制作200mL培養基，(1)瓊脂：3g(2)酵母：16g(3)玉米面：15g(4)葡萄糖：4g(5)加滅菌的超純水或三蒸水補齊，溶質溶劑共200mL。

1 材料與方法

1.1 實驗對象、試劑盒及儀器

野生果蠅WT1118(來自北京大學生命科學院饒毅實驗室)，甘油三酯測定試劑盒(北京普利萊公司)，BCA蛋白質測定試劑盒(Thermo科學公司)，恒溫水浴箱(保恒恒溫技術有限公司)、普通光學顯微鏡(BH-Z日本Olympus公司)。幼蟲和成蟲均可按以下方法對甘油三酯和蛋白質進行提取，但成蟲身體成分和雜質較多，對于測量結果易產生影響，所以以下實驗未涉及果蠅成蟲的提取。

1.2 實驗步驟

(1)果蠅雜交的設計：首先收集25只未交配的WT1118成蟲處女蠅，同15只成蟲雄性果蠅放于同一培養瓶中，放于培養箱中飼養，使它們交配完全。

(2)收集蟲卵：3d后，于中午12時，將全部果蠅轉移到新的培養瓶中，收集時間為2h(研究表明果蠅每天12～16時內，產卵率偏高)，保證蟲卵在一個發育時期。

(3)三齡幼蟲雌雄分裝：將收集兩小時蟲卵的培養瓶置于培養箱，3d后，當幼蟲生長到三齡期，用鉤針或鈍頭鑷子將蟲卵移置裝有滅過的PBS溶液或超純水中，在顯微鏡下區分雌雄，雌性各10只，用1.5mL EP管分裝，注明樣品名稱(由于三齡期幼蟲會在培養基內爬行，蟲體會沾有培養基，會影響測量結果，可在分裝前，可用超純水清洗蟲卵3次，后用無塵紙將蟲卵表面的水分吸干)。(4)貯存方法：入管后立即放入事先準備好的液氮中，凍存于-80℃冰箱(液氮和低溫凍存是為了保證幼蟲樣本體液不失活)。

1.3 裂解液的配置

通過查閱文獻，可以自制研磨蟲體的裂解液PBST(PBS+0.05%Tween20，二者比例4:1)[3，4]，配置好后，通過濾膜過濾雜質，將裂解液放于4℃冰箱貯存。

2 試劑盒測定原理

2.1 甘油三脂(TG)診斷試劑盒

對于凍干粉型甘油三酯測試盒，實驗原理如下：1)甘油三脂+水在脂肪酶催化下生成甘油+脂肪酸 2)甘油+ATP在甘油激酶的作用在生成甘油-3-磷酸+ADP 3)甘油-3-磷酸+氧氣在甘油磷酸氧化酶催化下生成磷酸二羥丙酮過氧化物酶+雙氧水 4)雙氧水+4-氨基安替比林+對氯苯酚在過氧化物酶作用下生成醌染料+水+氯化氫，醌染料在波長500nm有最大光吸收，顏色的強度與血清中甘油三酯含量成正比。

反應液可按照說明書進行配置，一般條件是向干粉瓶中加入10mL R1原液，室溫手動勻速搖瓶10min即可。標準品用所配置的PBST裂解液按照1:4的比例進行稀釋，單獨用EP管進行分裝，以免對原裝校準品造成污染，結束后立即放入4℃貯存。

2.2 BCA蛋白濃度測定試劑盒

BCA法是應用較廣的測定蛋白質濃度的方法。原理為雙縮脲反應，即在堿性環境下蛋白質將二價酮離子還原成一價酮離子，產生一種紫藍色復合物，這種復合物在一定波長處有較高的吸光值，同時反應產物量與蛋白質的濃度成正比。試劑盒中所提供的蛋白標準品(BSA)為實驗者設置標準曲線提供了便捷。試劑盒可室溫保存，但蛋白標準品(BSA)需負20℃保存。

2.3 配制蛋白標準品和工作液

(1)配制BSA標準液：1)向30mg BSA標準品中加入1mL蛋白標準品配制液，充分溶解后配制成30mg/mL的蛋白標準母液，配置后應立即稀釋使用。2)取適量濃度為30mg/mL的蛋白標準母液，稀釋至終濃度為2mg/mL。標準品稀釋液為蛋白樣品的裂解液，原則上是：蛋白樣品在什么溶液中，標準品也宜用該溶液稀釋(也可用0.9%的Nacl或PBS溶液進行稀釋)。

(2)配制BCA工作液：1)計算實驗中所需要的BCA工作液總體積公式：BCA工作液總體積=(標準品+待測樣品)×重復數×每個樣品所需要的BCA工作液。2)配制BCA工作液：在50體積的BCA試劑A中加入1體積的BCA試劑B(比例為A:B=50:1)，使其充分混勻。BCA試劑B加入BCA試劑A中后，立即渾濁，搖勻后則立即變澄清。

3 提取方法

待一切準備就緒，正式開始實驗前，預冷4℃離心機，準備好足夠冰盒、冰袋或者鋁塊(鋁塊傳導溫度快)，將負80℃樣本取出，用長鑷子夾住EP管，置于鋁塊或冰上。

(1)加入200μL事先配制的裂解液進行勻速研磨，盡量降低研磨過程中摩擦產熱，研磨速度為10次/分(研磨器可使用成品，需事先將研磨棒進行滅菌，一種樣本用一根，切勿混淆；若沒有成品研磨器，可用干凈的1000μL槍頭制作簡易的研磨棒。用酒精燈灼燒槍頭尖部，塑料制品遇火融化，槍頭融為閉塞狀，可用1.5mL EP管測試與管底契合程度，按照實驗需求制作，滅菌備用)。所有的研磨都要在冰上進行，防止樣本降解。

(2)待裂解樣本溶液呈均勻渾濁樣，于4℃離心機瞬離30秒，將管壁上殘留的樣品溶液輕輕彈下，后置于冰上。將離心好的樣品溶液，取出100μL上清液到另一個1.5mL EP管后置于冰上或負80℃貯存，待測甘油三酯；剩余100μL用來測定蛋白含量(鑒于蛋白成分易受溫度影響，建議先做蛋白濃度測定)。

4 甘油三酯和蛋白質濃度測量

4.1 甘油三酯的測定

將用于測定甘油三酯的100μL樣本的EP管，置于70℃水浴鍋煮10min。待到時間，按照下列表格(表1)加好樣品，37℃水浴鍋加熱30min后加樣。

表1 甘油三脂加樣表

很多甘油三酯測試盒說明上都以水為背景作為空白對照組，但考慮到果蠅無血液且數據的嚴密，所以將裂解液作為背景。30min后，取出用指腹輕彈管壁，充分混勻。按照上述列表順序加樣，盡量減少加樣產生的氣泡；如果為了測量的準確，可同一種樣本分別三次加樣，取平均值。根據說明書要求的波長進行設置，完畢后進行讀取數據進行分析。

計算公式：

圖1 WT1118雌性與雄性幼蟲甘油三酯含量

4.2 蛋白質濃度測定

將用于測定的蛋白的100μL樣品溶液4℃ 12000rpm離心10min，吸取BSA反應液于酶標板，定好點樣圖，做好標記。吸取離心后樣品上清溶液(上樣量根據預實驗在標準曲線可測范圍顯色而定于反應液。設置標準曲線6個點，分別是0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0(mg/mL),加5μL標準品溶液于反應。將盛有混合液的酶標板置于37℃水浴10min后取出放于室溫。然后微孔板加樣，加樣方法如下：1)各取25μL標準品和待測樣品加入到微孔板中 2)每孔加入200μL BCA工作液，振蕩30秒充分混勻，37℃放置30min 3)冷卻到室溫，在酶標儀上的562nm波長處檢測吸光度 4)根據BSA標準品的吸光度，繪制標準曲線。依據標準曲線和樣品的稀釋倍數計算樣品蛋白濃度。置于酶標儀測定，記錄分析。見圖2。

圖2 WT1118 雌性與雄性幼蟲蛋白含量

使用BCA蛋白測定法測量時，顏色會隨著時間延長而不斷加深，且顯色反應的速度和溫度相關，所以在實驗過程中需注意保持定時和定溫，以確保定量精確。每次測定時，都需重新做相應的標準曲線。

5 討論

根據以上兩項結果顯示：雌性果蠅三齡幼蟲體內甘油三脂和蛋白含量均高于雄性幼蟲，這與雌性幼蟲體內雌激素有關。希望通過本實驗的提取方法和操作步驟為日后其他人對果蠅的實驗和學習提供技術支持與幫助[5,6]，本人的提取方法和實驗操作尚有不足，我會在日后的實踐操作中繼續探索解決實驗的瑕疵之處，努力提高實驗技術水平。

[1]饒友生,柴學文,王障鳳.果蠅—打開生命科學之門的金鑰匙[J].生物學通報,2008,43(12):8-10

[2]萬永奇,謝 維.生命科學與人類疾病研究的重要模型——果蠅[J].生命科學，2006,(5):425-429

[3]Justin R，DiAngelo and Morris J. Birnbaum.Regulation of Fat Cell Mass by Insulin in Drosophila melanogaster[J].Molecular and Cellular Biology,2009,6341-6352

[4]Laura Palanker,Musselman, Jill L Fink,et al.Baranski.A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila[J].Disease Models & Mechanisms，2011，4：842-849

[5]王桂梅,王彩霞.CBL教學法在臨床病理學教學中的實踐和探索[J].黑龍江醫藥科學,2016, 39(2):50-51

[6]欒倩,劉蕾.靈芝酸對癇樣放電海馬神經元2磷酸化ERK1/2水平的影響[J].黑龍江醫藥科學,2014,37(2):1-3

國家自然科學基金項目,編號：31571087和31200839。

陳潔茹(1989～)女，黑龍江雙鴨山人，在讀碩士研究生。

楊利敏(1973～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導師。E-mail：lmyang@jmsu.edu.cn。

R392；R446.5

A

1008-0104(2017)04-0003-02

2017-04-15)