探討曠場實驗評價脾氣虛和脾陽虛大鼠“神?！钡目赡苄约俺醪綑C制

劉文俊++高宇婷++竇智++于凱洋+++劉鳳智+++年宇婷+++單德紅

[摘要]目的 探討曠場實驗評價脾氣虛和脾陽虛大鼠“神?！钡目赡苄约俺醪綑C制。方法 選取24只雄性SPF級SD大鼠作為研究對象，隨機分為對照組、脾氣虛組和脾陽虛組，每組8只；采用曠場實驗檢測各組大鼠的運動距離和站立次數；采用電鏡觀察各組的海馬神經元線粒體形態學變化；采用比色法檢測各組海馬組織的ATP水平。結果 脾氣虛組和脾陽虛組在曠場實驗中的運動距離短于對照組，站立次數少于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；脾陽虛組在曠場實驗中的運動距離短于脾氣虛組，站立次數少于脾氣虛組，差異有統計學意義（P<0.01）；脾氣虛組和脾陽虛組大鼠的海馬神經元線粒體均出現腫脹、空泡化，ATP水平均低于對照組（P<0.01）；脾陽虛組的ATP水平低于脾氣虛組（P<0.01）。結論 曠場實驗能夠較客觀地評價和區分脾氣虛和脾陽虛大鼠的“神?！?，其生物學基礎與海馬神經元線粒體損傷有關。

[關鍵詞]神疲；脾氣虛；脾陽虛；曠場實驗；線粒體

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）07（c）-0004-04

Exploration of open field test evaluating the mental fatigue of rats with spleen qi and spleen yang deficiency

LIU Wen-jun1 GAO Yu-ting2 DOU Zhi2 YU Kai-yang2 LIU Feng-zhi2 NIAN Yu-ting2 SHAN De-hong3▲

1.The Teaching Laboratory Center，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine in Liaoning Province，Shenyang 110847，China；2.The First Clinical College，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine in Liaoning Province，Shenyang 110847，China；3.Faculty of Basic Medicine，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine in Liaoning Province，Shenyang 110847，China

[Abstract]Objective To explore the possibility and the preliminary mechanism of open field test evaluating the mental fatigue of rats with spleen qi deficiency （SQD） and spleen yang deficiency （SYD）.Methods 24 SPF male SD rats were selected as objects and they randomly divided into control group，SQD and SYD group，each group had 8 rats.The OFT method was used to detect the motion distance and vertical times.Electron microscope was used to observe the mitochondrial morphology of hippocampal neurons.ATP level in hippocampal tissues of each group were measured by colorimetry.Results Motion distance in open field test of SQD and SYD group was shorter than that of control group，and vertical times in SQD and SYD group was fewer than that of control group，and there was a statistical difference （P<0.05）.Motion distance in open field test of SYD group was shorter than that of SQD group，and vertical times in SYD group was fewer than that of SQD group，and and there was a statistical difference （P<0.01）.Hippocampus neuron mitochondria in SQD and SYD group showed swelling and vacuolization，and ATP level in SQD and SYD group were significantly lesser than that in control group （P<0.01），and ATP level in SYD group was lower than that in SQD group （P<0.01）.Conclusion OFT can be used to evaluate and rank the mental fatigue of rats of SQD，SYD objectively and its biological bases might related to the damage of hippocampus neuron mitochondria.

[Key words]Mental fatigue；Spleen qi deficiency；Spleen yang deficiency；Open field test；Mitochondrion

“神疲”是評價脾氣虛和脾陽虛大鼠模型的重要宏觀表征[1-5]，但其評價方法多為目測，客觀量化不足，不僅影響了模型復制的穩定性和可靠性，還難以區分“神?！钡某潭?。曠場實驗（open field test，OFT）是檢測嚙齒類動物在新環境中自發活動和探索行為的經典實驗，主要用于分析動物的認知能力、緊張度、興趣度，在一定程度上反映了中樞神經系統（central nervous system，CNS）的興奮程度[6-8]。本研究嘗試將OFT用于客觀評價脾氣虛、脾陽虛模型大鼠的“神?！?，并從海馬線粒體方面揭示其可能依據。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組

選取24只SPF級健康雄性SD大鼠，體質量（200±10）g，購于本溪實驗動物中心[許可證號：SCXK（遼）-2010-0001]，隨機分為對照組、脾氣虛組和脾陽虛組，每組8只。適應性飼養1周，自由飲水進食，（20±2）℃，相對濕度45%～55%。

1.2模型復制方法

脾氣虛證模型復制方法參考文獻[9-10]：脾氣虛組大鼠施加飲食不節加力竭游泳刺激，即先飽食1 d，再禁食2 d，自由飲水；每日游泳至力竭，水溫35～37℃，連續15 d。脾陽虛證模型復制方法：取脾氣虛模型大鼠每日灌服20%番瀉葉水浸劑（2 ml/100 g），早晚各1次，連續7 d。

1.3模型評價標準及方法

脾氣虛證的評價標準如下。①消瘦：體質量明顯下降；②食少：代謝籠計量24 h單只進食量和飲水量，均明顯減少為達標；③乏力：雙前肢抓力明顯變小，檢測方法見文獻[10]；④被毛枯槁無華：三人分別觀察且一致認定。脾陽虛證的評價標準如下。前述標準加①畏寒：9～10時測大鼠肛溫，明顯下降為達標；②便?。杭S便含水率明顯升高。

1.4 OFT方法

采用成都泰盟TM-Vision行為學實驗系統進行檢測。將大鼠放入箱體中心，主要觀察5 min內大鼠的運動距離、站立次數等。徹底清潔箱體后，檢測下1只大鼠。

1.5海馬神經元線粒體結構觀察

大鼠腹腔注射20%烏拉坦（0.4 ml/100 g）麻醉后，在4℃下將海馬切成約1 mm3小塊，2.5%戊二醛固定，PBS漂洗后1%鋨酸固定，乙醇、丙酮梯度脫水，環氧樹脂包埋聚合，LKB-1型超薄切片機切片（50～60 nm厚），3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染，日本電子JEM-1011透射電鏡觀察并拍片。

1.6海馬組織ATP水平

采用比色法，試劑盒購自南京建成生物技術有限公司（A095）。應用Bio-Rad美國伯樂iMark酶標儀，嚴格按照說明書操作。

1.7統計學處理

采用SPSS 17.0軟件分析數據，計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義[11]。

2結果

2.1 模型評價

對照組大鼠體格健壯，反應靈敏，被毛緊密有光澤；脾氣虛組大鼠消瘦，反應遲鈍，被毛蓬起枯槁無光澤；脾陽虛組大鼠消瘦，反應遲鈍，被毛枯槁無光澤，肛周污穢，墊料潮濕。由表1可見，脾氣虛組前4項均明顯低于對照組（P<0.05），說明該組大鼠出現消瘦、食少和乏力；脾陽虛組除大便含水率顯著升高（P<0.01）外，其余指標均顯著低于對照組（P<0.01），表明該組大鼠出現消瘦、食少、乏力、畏寒和便稀。以上結果表明二證大鼠模型復制成功。

2.2 OFT結果

由圖1和表2可見，對照組大鼠的活動區域以角落和四周為主，脾氣虛組大鼠在中心活動增多，但其運動距離和站立次數均顯著低于對照組（P<0.05）；而脾陽虛組活動范圍最小，甚至沒有形成閉合運動軌跡，其運動距離和站立次數均顯著低于對照組和脾氣虛組（P<0.05），表2亦顯示了后兩組和對照組的相對值。

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與脾氣虛組比較，△△P<0.01

2.3大鼠海馬神經元線粒體形態及ATP含量

由圖2可見，對照組大鼠海馬神經元內線粒體形態基本正常，數量較多，而脾氣虛和脾陽虛組線粒體均出現腫脹、空泡化，數量較少。三組大鼠海馬組織ATP水平分別是（1.32±0.60）、（0.81±0.38）和（0.28±0.13）pmol/mg，后兩組顯著低于對照組（P<0.05），且脾陽虛組顯著低于脾氣虛組（P<0.01）。

3討論

正常動物進入曠場后，因畏懼開闊、未知和存在潛在危險的環境而“貼墻”活動，適應后再進行探索，嘗試通過中心區域，并不時站立[12-13]。因為OFT能夠較好地反映CNS的興奮程度，所以本實驗將其用于評價大鼠的“神?！?。本實驗結果顯示，對照組大鼠活動范圍大，運動距離遠，站立次數多，反映其CNS較為興奮；脾氣虛組大鼠的活動區域雖然也較大，但其運動距離和站立次數均顯著低于對照組，提示其CNS興奮度較低，出現了“神?！睜顟B；而脾陽虛組大鼠的活動范圍明顯變小，且運動距離和站立次數不僅低于對照組，也低于脾氣虛組，表明該組大鼠的CNS興奮性明顯下降。

由于神疲與脾虛所致氣血虧虛、神失所養有關，而脾陽虛多源于脾氣虛，故脾陽虛之神疲要甚于脾氣虛之神疲，但臨證對此并不詳查，蓋因區分此二證主要看是否有寒象。不過對于實驗研究，特別涉及神經科學，還是有必要量化區分。本實驗觀察到，后兩組的運動距離分別為對照組的51.83%、8.79%，站立次數分別是對照組的73.94%、24.24%，表明脾陽虛之“神?！币跤谄馓撝吧衿！?，這與中醫理論一致。由此可以認為，OFT可以用來較為客觀地評價和區分脾氣虛和脾陽虛的“神?！?。

由于大鼠行為學表現與海馬關系密切，本文進一步從海馬線粒體方面探討“神?！钡陌l生原因[14-17]。結果顯示，后兩組大鼠海馬神經元的線粒體均出現結構損傷和數量減少，且ATP水平明顯下降，提示在脾氣虛和脾陽虛時海馬能量不足，這種可能是氣血不足、神失所養的一個表現。而脾陽虛組海馬線粒體損傷和ATP水平下降要甚于脾氣虛組，則可能是該組大鼠“神?！背潭戎赜谄馓摻M的原因之一[18-19]，因此，海馬線粒體損傷可能是OFT能夠較好地評價脾氣虛和脾陽虛大鼠“神?！钡纳飳W基礎。

綜上所述，本實驗認為曠場實驗能夠較好地評價和區分脾氣虛和脾陽虛大鼠的“神?！?，其生物學基礎與海馬神經元線粒體損傷有關。

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（收稿日期：2017-05-22 本文編輯：許俊琴）