液相色譜測定單糖與二糖和低聚半乳糖的方法研究

車永進+岳子賀+戚克進

摘 要：目前有多種方法可以測定低聚糖中各種組分的含量，包括毛細管電泳定量分析、氣相色譜法、薄層層析法]和高壓液相色譜法，其中高壓液相色譜法因操作方便、分析速度快而被廣泛應用。高壓液相色譜法又根據檢測器的不同分為：紫外可見光二極管陣列檢測器檢測（UV-DAD）、脈沖安培檢測器定量分析、和示差折光檢測器檢測[等。該研究采用高壓液相色譜分析，示差折光檢測器檢測，嘗試采用Zorbax Carbohydrate柱、Aichrom-NH2和Sugar Pak Ι三種色譜柱同時檢測樣品中的葡萄糖、乳糖和低聚半乳糖中三糖、四糖和五糖，確定最佳的色譜分析柱和色譜操作條件。

關鍵詞：液相色譜 測定 單糖 二糖 低聚半乳糖

中圖分類號：TH86 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2017）07（b）-0108-02

由于人體腸道內不具備分解消化低聚半乳糖的酶系統， 因而低聚半乳糖在體內不能被胃酸和胃酶降解， 故不能被消化吸收， 而是直接進入小腸內被有益菌尤其是雙歧桿菌利用， 對人體發揮獨特的生理功能，因此被定義為“益生元”，它能有效促進體內雙歧桿菌的生長繁殖，改善脂質代謝，促進鈣的吸收和維生素的合成，具有分解致癌物質、提高人體免疫力等功能。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

儀器：高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；電子天平AR3130（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；液相色譜柱分別為Zorbax Carbohydrate（4.6×150 mm，美國安捷倫科技有限公司）、氨基柱Aichrom-NH2（4.6×250 mm，美國Abel工業有限公司）和Sugar Pak Ι（4×300 mm，美國Waters公司）。

材料：葡萄糖、乳糖由美國sigam公司提供，低聚半乳糖（其中含半乳三糖、四糖和五塘）由煙臺華海生物制品有限提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜柱的選擇

各種糖組分的含量分析采用高效液相色譜法。色譜系統為美國安捷倫公司提供的Agilent 1200，色譜柱分別為Zorbax Carbohydrate（4.6×150 mm，美國安捷倫公司）、氨基柱Aichrom-NH2（4.6×250 mm，美國Abel工業有限公司）和Sugar Pak Ι（4×300 mm，美國Waters公司）。如果沒有特別說明，則色譜條件為：G1362A 示差折光檢測器，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，柱溫25 ℃，前面兩種柱子采用乙腈與水的混合液為流動相，調整流動相組成使其達到最佳分離效果；Sugar PakⅠ的流動相為雙蒸蒸餾水。

1.2.2 流動相組成的選擇

流動相為乙腈與水的混合物，體積比分別為65∶35、70∶30和75：25，比較不同流動相組成對分離效果的影響。

1.2.3 洗脫流速的選擇

洗脫流速分別為0.5、1和1.5 mL/min，比較不同的洗脫流速對分離效果的影響。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

Zorbax Carbohydrate、Aichrom-NgH2、Sugar Pak Ι中的三種色譜柱都能夠有效地分離低聚半乳糖中的各種組分，進行定性或定量測定。但Sugar Pak Ι柱在使用一段時間后，柱效很快降低，可能是因為Sugar Pak Ι中的固定相為鈣型陽離子交換樹脂，低聚半乳糖樣品中存在的少量陽離子（原料生產時緩沖溶液中的少量離子，或用少量NaOH調整 pH值時帶入的鈉離子）很容易將固定相樹脂中的鈣離子置換下來，不但嚴重影響測定結果的重現性，而且大大降低色譜柱的使用壽命，并且Sugar Pak Ι的價格約是另外兩種柱子的3倍，因此，該研究中糖溶液不適宜用Sugar Pak Ι進行分析。

氨基柱Zorbax Carbohydrate 和Aichrom-NgH2價格相當，實驗條件下分析低聚半乳糖混合物，Zorbax Carbohydrate柱比Aichrom-NH2出峰快，分析時間短，色譜柱的理論塔板數高。雖然兩種柱子對各種糖組分的選擇性相差不大，但前者分離各種糖組分的分離度明顯高于后者；采用Aichrom-NH2柱分析，只對葡萄糖和乳糖的分離度超過了1.5，其他各種糖組分之間的分離度都小于1.5。因此氨基柱Zorbax Carbohydrate的分離效果更好，故該研究后面的實驗都采用Zorbax Carbohydrate柱對低聚半乳糖進行定性和定量分析測定。

2.2 流動相組成的確定

色譜條件：Zorbax-Carbohydrate色譜柱（4.6×150 mm），柱溫25 ℃，G1362A示差檢測器，流動相流速1 mL/min，進樣量20 μL，流動相為乙腈與水的混合物，體積比分別為65∶35、70∶30和 75∶25，得到不同流動相組成對低聚半乳糖的分離效果。

隨著流動相中乙腈含量的增加，流動相的非極性增強，各種糖組分在柱中的保留時間增加，分離度增大。乙腈與水的比例為65∶35時，分析一個樣品只需要7 min，流動相比例為75∶25時，分析一個樣品需17 min。但從上述結果可以看出，流動相比例為65∶35的選擇性和分離度也最小，只有葡萄糖和乳糖之間的分離度大于1.5，其他各種糖組分之間的分離度都小于1.5，而流動相比例為70∶30和75∶25的分離度都遠遠大于1.5，并且分離度和選擇性相差不大，而前者比后者出峰時間早，分析一個樣品可以節約5 min，故確定最佳的流動相比例為70∶30。

2.3 流動相流速的確定

流動相的流速影響塔板高度，從而影響分離效果。流動相流速太快，柱效降低，但流速太慢，又會因增加擴散而降低分離度。該研究分別考察了流動相流速分別為0.5、1.0和1.5 mL / min的分離效果。

可以看出：流動相的流速越大，出峰越快，色譜峰越窄，分離的理論塔板數越多，同時選擇性越小，分離度也越小。但3個流速下的分離度均大于1.5，這表明各種糖組分都已完全分離。相比之下，流速為1.0和0.5 mL/min時，其分離度和選擇性均優于1.5 mL/min，而且柱壓較低。1.0和0.5 mL/min的分離度和選擇性相差不大，而1.0 mL/min的出峰速度快，分析一個樣品比后者要節約10 min，故取1.0 mL/min為最佳洗脫流速。

3 結語

根據色譜柱同時分離單糖、二糖和低聚半乳糖組分的分離度和選擇性，以及色譜柱的價格和使用壽命，確定安捷倫公司的Zorbax Carbohydrate 柱可以很好地定性分析和定量測定單糖、二糖和低聚半乳糖混合物中各種組分的含量。最佳的色譜分離條件為：采用示差折光檢測器檢測，流動相為乙腈與水的混合物，體積比70∶30；洗脫流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量20 μL。

參考文獻

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