多肋藻提取物對兩種赤潮微藻的生長抑制作用研究

劉忠曉

摘要：通過測定赤潮微藻細胞密度，分析了微藻細胞內葉綠素、蛋白質和多糖等生理生化指標的變化，研究了多肋藻（Costaria costata）提取物對2種赤潮微藻塔瑪亞歷山大大藻（Alexandum tamarense）和東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）生長的影響。結果表明：當提取物濃度為16g/L時能顯著抑制東海原甲藻的生長，生長抑制率為57.8%，當提取物濃度為32g/L是顯著抑制塔瑪亞歷山大大藻的生長，抑制率為58.8%。同時，2種微藻的葉綠素、可溶性蛋白質和多糖含量顯著降低，比對照組的相應含量低約80.0%。

關鍵詞：赤潮微藻；東海原甲藻；塔瑪亞歷山大大藻；生長抑制；多肋藻提取物

中圖分類號：X55

文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2017）14-0068-03

1 引言

赤潮，又稱為有害藻華，隨著污染物對海洋污染的日趨加重，已成為全球性的海洋災害，，對近海水域生態環境、人類生活和沿海水產業的可持續發展造成了極大的威脅。近20年來，發生在我國的有害赤潮事件達到300多起，僅1998年就發生22起赤潮事件，經濟損失達10億元以上[1]。赤潮產生的毒素由魚類、貝類等生物傳遞給人類[2]，有害赤潮嚴重制約著沿海經濟的發展、破壞海洋生態環境進而威脅人類健康[3]。

近來研究者提出利用黏土礦物，季銨鹽類化合物[4]以及病毒[5]、細菌[6]等方法抑制或滅殺赤潮微藻，這些研究取得一定成果，但是外來添加物質可能對海洋水體產生不可預見的影響，現在利用海洋環境中的生物因子進行赤潮的防控已經越來越引起重視[7].

海藻在代謝過程中可向環境中分泌抑藻物質，抑制赤潮微藻的生長，例如，從墨角藻（Fucus vesiculosus）中分離出的聚酚能抑制陸茲單鞭金藻（Monochrysis）的生長[8]，從空石莼體內也分離鑒定出抑制赤潮異彎藻的9，12，15-十八碳三烯酸等物質[9]。

多肋藻（Costaria costata）隸屬于褐藻門海帶目多肋藻屬，主要自然生長于太平洋北部沿岸、日本海和鄂霍次克海、大彼得灣等海域。多肋藻因富含褐藻膠及多種人體必需的氨基酸，營養價值較高，同時也是海藻工業的重要原料，近年來對其研究逐漸增多。

本實驗采用日本采集的多肋藻，提取水溶性物質，研究其對赤潮微藻塔瑪亞歷山大大藻和東海原甲藻的抑制作用，通過實驗測定藻細胞內葉綠素、蛋白質和多糖等生理指標的變化，分析多肋藻水提物對這2種赤潮微藻的生長影響，以期為進一步研究多肋藻抑藻物質提供實驗基礎和理論依據。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

塔瑪亞歷山大大藻、東海原甲藻來自于中國科學院海洋研究所種庫，在f/2培養液中培養[10].培養溫度為20℃，光照3500lx，光暗比為12∶12。多肋藻采自日本北海道函館惠山，原料經自來水洗滌，除去泥沙，干燥，粉碎后保存備用。

天然海水經過脫脂棉和300目篩娟過濾，煮沸、冷卻。pH值和鹽度分別調節至8.5和30備用。

2.2 多肋藻水提物的制備

稱取100 g多肋藻干粉末，置于500 mL圓低燒瓶中，加水，加熱回流提取8 h，離心去除多肋藻，上清液經旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥成粉末，得到多肋藻提取物22.5 g。

2.3 抑藻實驗

在f/2培養基中，分別添加一定量的多肋藻，濃度為2、4、8、16、32 g/L，接種2種赤潮微藻，培養混合液總體積為250ml。東海原甲藻和塔瑪亞歷山大藻接種密度分別為5×104 cells/mL、6×104 cells/mL，同時設定添加相同體積空白對照組，每個處理3個重復。

培養瓶置于GXZ-260B智能型光照培養箱中培養，溫度26℃，光照強度3500lx，光暗比12∶12。每天定時搖動培養瓶2次。每隔1天從培養瓶中取1 mL培養液，用Lugol′s試劑固定后，計數藻細胞數量的變化。第10 d，測定藻細胞葉綠素、蛋白質和多糖含量。

2.4 微藻的生理指標測定

2.4.1 葉綠素的測定

藻液5000 r/min離心15 min，棄去上清液，加入90%丙酮，4℃抽提24 g，離心后，測定上清液630、645和665 nm吸光度，參照文獻[11]計算葉綠素含量（以細胞干重衡量，mg/g）。

2.4.2 蛋白質和多糖的測定

15 mL藻液2000 r/min離心10 min，棄去上清液，藻泥于-20℃凍融碾碎后，加入3 mL 磷酸緩沖液（PBS，磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉的混合溶液）并充分震蕩，離心10 min。上清液用于測定蛋白質和多糖。

蛋白質含量測定：取1 mL上清液加入3 mL考馬斯亮藍溶液，測定595 nm處的吸光度，根據標準蛋白質曲線，確定蛋白質的含量。

多糖含量測定：取1 mL上清液加入0.1 mL硫酸鋅，沸水浴5min，立即加入亞鐵氰化鉀0.1 mL，離心10 min，取上清液1 mL加到3 mL蒽酮中，沸水浴10 min，用冷水迅速冷卻至室溫，穩定后測定620 nm波長處的吸光度，根據標準葡萄糖溶液曲線確定多糖的含量。

2.5 數據處理

實驗數據采用SPSS11.5軟件包進行獨立樣本檢驗統計分析，p﹤0.05為顯著性差異，p﹤0.01為極顯著性差異。

微藻生長抑制率：I=（1-N/N0）×100%，式中，N為處理組藻細胞密度（×104 cells/mL）；N0為對照組藻細胞密度（×104 cells/mL）。

3 結果與分析

3.1 多肋藻提取物對2種赤潮微藻生長的影響

從圖1、圖2可以看出，多肋藻提取物對東海原甲藻和塔瑪亞歷山大藻2種赤潮微藻的生長表現出較強的抑制作用。生長抑制率最高依次為60.94%、58.8%。

2.2 多肋藻提取物對2種赤潮微藻葉綠素、蛋白質和多糖含量的影響

圖3～5表明，多肋藻提取物對2種赤潮微藻的葉綠素、蛋白質和多糖的合成表現出較強的抑制作用。濃度為32 g/L時，葉綠素、蛋白質與多糖含量比對照組分別下降了86.7%、83.3%與85.7%。

3 討論

本文研究表明，多肋藻提取物對2種赤潮微藻均有不同程度的抑制作用，而且這種抑制效應具有濃度依賴性。多肋藻提取物對2種微藻的抑制作用稍有不同，可能與他們的細胞結構有關，塔瑪亞歷山大藻細胞外涵蓋一層堅硬的外殼[12]，因而對外來生長抑制物質具有一定的抵擋性。

通過對多肋藻提取物的抑藻實驗，可以得出多肋藻提取物中含有抑藻物質，對赤潮微藻的生長有抑制作用，多肋藻提取物不僅可以降低細胞生長濃度，還可以降低赤潮微藻的葉綠素、蛋白質和多糖的含量，但其具體抑藻活性成分以及作用機制還有待于后續進一步的研究。

參考文獻：

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