去泛素化酶Usp46基因在系統性紅斑狼瘡患者血液中的表達及意義

張 瑋，魏 群，郭惠芳，鄭桂敏，張蓮之，彭媛媛，劉淑霞

(1.河北醫科大學 病理教研室，河北 石家莊 050017；2.河北省人民醫院醫院 a.感染管理科；b.免疫風濕科，河北 石家莊 050051；3.河北醫科大學第二醫院 免疫風濕科，河北 石家莊 050000)

·論著·

去泛素化酶Usp46基因在系統性紅斑狼瘡患者血液中的表達及意義

張 瑋1，魏 群2a，郭惠芳3，鄭桂敏2b，張蓮之1，彭媛媛1，劉淑霞1

(1.河北醫科大學 病理教研室，河北 石家莊 050017；2.河北省人民醫院醫院a.感染管理科；b.免疫風濕科，河北 石家莊 050051；3.河北醫科大學第二醫院 免疫風濕科，河北 石家莊 050000)

目的 研究泛素特異性蛋白酶46 (Usp46)基因在系統性紅斑狼瘡(SLE)患者及健康人外周血中的表達水平，并探討其在SLE發病中的作用。方法 收集73例SLE患者及75 例健康人臨床資料，采用Real-timePCR法檢測外周血中Usp46基因mRNA的表達情況，分析其表達水平與臨床指標的關系。結果 與健康對照組相比，SLE患者血液中Usp46基因的mRNA表達水平明顯升高(Z=-6.98，P<0.01)；在SLE患者中Usp46基因的mRNA表達水平與紅細胞沉降率(ESR)、IgG、IgM和谷丙轉氨酶(ALT)呈正相關(P<0.05)。結論Usp46基因的mRNA表達水平在SLE患者血液中明顯增高，提示Usp46基因可能參與SLE疾病的發生發展過程。

紅斑狼瘡， 系統性；基因；血沉；泛素特異性蛋白酶46

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種復雜的自身免疫性疾病，累及多系統、多器官，以自身抗體產生、補體激活、免疫復合物沉積以及多種組織器官損傷為特征，病死率極高[1]，是一種嚴重危害人類健康的常見病。SLE的病因至今未明，發病機制復雜，已有研究表明SLE的發生和發展與激素水平、環境誘因和遺傳易感性等多種因素有關[2]。其中免疫系統的過度活化可導致自體抗體的產生、免疫復合物的沉積以及致炎因子的釋放，最終引發SLE中各個臟器的損傷[3]。最近研究發現泛素特異性蛋白酶46 (Usp46)基因作為一種去泛素化酶，通過去泛素化PH結構域富含亮氨酸重復蛋白磷酸酶1(PHLPP1)參與調控Akt信號通路[4]，在結直腸癌中發揮著抑癌基因的作用，而且新近研究報道該基因與EB病毒核抗原(EBNA)家族一同參與調控淋巴細胞的生長和分化[5]，可能在免疫系統中發揮重要作用，然而其是否在SLE的發病中發揮作用仍是未知，本研究采用Real-timePCR法檢測SLE患者及健康人外周血中Usp46基因mRNA的表達情況，分析其表達水平與臨床指標的關系，初步探討Usp46基因在SLE患者發病中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2015年1月至2017年1月在河北醫科大學第二醫院免疫風濕科診斷的SLE患者73例，男7例，女66例，年齡(35.0±2.8)歲。SLE診斷均符合美國2009年風濕病學會修訂的診斷標準。選取同期健康獻血者75例作為對照，男10例，女65例，年齡(38.0±1.2)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。研究對象均已簽署知情同意書且已通過倫理委員會批準。

1.2 方法 所有研究對象抽取空腹靜脈血用于紅細胞沉降率(ESR)、IgA、IgG、IgM、C3、C4及丙氨酸轉氨酶(ALT)檢測。

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 用PAXgeneBloodRNATubes(Quagen)保存血液，保證血液中RNA的穩定性，運用PAXgeneBloodRNAKit(Quagen)試劑盒提取總RNA，檢測其純度和濃度后，采用FastQuantRTKit(天根)試劑盒反轉錄合成cDNA，本試驗是在河北省腎臟病重點實驗室完成。

1.2.2 引物設計 根據Usp46(NM_022832.3)和內參基因GAPDH(NM_002046)基因序列設計引物，由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3Real-timePCR檢測Usp46基因表達水平 用熒光定量PCR檢測儀(AgilentMX3000P，美國)進行PCR擴增，Real-time反應體系由SYBRGreenMix10μl、上游引物和下游引物各0.5μl(終濃度為12.5μM)、cDNA1μl、無RNA酶的去離子水8μl構成20μl體系。反應條件為95 ℃ 2分鐘預變性，95 ℃ 5秒，55 ℃ 30秒，72 ℃ 30秒共40個循環，同時檢測熔解曲線。確定循環閾值(Ct)后，目標基因Usp46相對于內參基因GAPDH進行相對定量，采用2-△△Ct法計算相對表達量，并比較兩組間的基因表達水平的差異[6-7]。PCR擴增產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳以檢測基因特異性。

1.3SLEDAI評分對SLE病情的判斷依據 0～4分，基本無活動；5～9分，輕度活動；10～14分，中度活動；≥15分，重度活動。

2 結 果

2.1 臨床指標SLE患者SLEDAI評分為中度活動；患者存在血液系統、腎臟、皮膚及神經系統損傷；ESR明顯加快，高于正常水平；補體C3、C4低于正常水平，見表2。

表2 73例SLE患者臨床資料

2.2 血液標本RNA健康對照組RNA濃度為(48.50±5.28)g/L，純度OD比值為(1.89±0.05)，SLE組RNA濃度為(85.60±7.06)g/L，純度OD比值為(1.98±0.03)，采用1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示18s和28s條帶清晰，28s的亮度是18s的2倍左右，說明完整性良好。

2.3 實時熒光定量PCR實時熒光定量RCR結果顯示擴增良好(圖1a)；溶解曲線均為單峰(圖1b，左側為Usp46基因，右側為GAPDH基因)，將PCR產物進行2.5%瓊脂糖電泳結果顯示條帶單一、大小正確(圖1c)。

2.4Usp46基因mRNA表達水平Real-timePCR結果顯示，兩組均表達Usp46基因mRNA，SLE組Usp46基因的表達水平4.22 (1.30，17.02)健康對照組1.00(0.84，1.11)，兩組比較差異有統計學意義(Z=-6.98，P<0.01)。

2.5 相關性分析SLE患者Usp46基因的mRNA表達水平與ESR、IgG、IgM和ALT呈正相關(P<0.05)，與SLEDAI評分、IgA、C3、C4無相關性。見圖2。

圖1 GAPDH和Usp46基因實時熒光定量PCR結果 a.擴增曲線；b.融解曲線；c.熒光定量PCR產物的瓊脂糖電泳結果

圖2 SLE患者Usp46基因表達水平與臨床指標的相關性

3 討 論

SLE是目前臨床上最常見的自身免疫性疾病，患者血清中常含有多種自身抗體，病變可以累及體內泌尿、神經、循環、運動、呼吸、血液、消化等多個系統，導致患者出現狼瘡性腎炎、狼瘡性腦病、狼瘡性心臟病等多種并發癥，嚴重影響患者的生存質量，如不控制甚至可以威脅患者的生命，然而SLE缺乏早期發現和早期診斷的分子標記物，病情往往進展到并發癥階段，有明顯臨床癥狀后才就醫，嚴重影響患者的預后及生活質量，因而尋找早期分子標記物是早診斷、早治療，提高患者生存質量的關鍵。

研究發現泛素-蛋白酶體通路[8]通過特異性地降解細胞內的蛋白質參與調控多種細胞進程，包括細胞周期[9]、腫瘤生長[10]及炎癥[11]等，而且還參與免疫反應的調控[12-13]，去泛素化酶是該通路中重要的質量控制因子，通過對底物蛋白的去泛素化來調控蛋白質的壽命[14]，去泛素化酶表達水平、基因突變及功能異常與多種自身免疫性疾病的發生發展有關，如腫瘤壞死因子α誘導蛋白3(TNFAIP3)基因突變與SLE、風濕性關節炎等自身免疫性疾病、淋巴瘤及哮喘等疾病[15-16]，Usp18通過調控轉化生長因子β激活激酶 1(TAK1)及TAB(TAK1 結合蛋白1)在輔助性T細胞17(Th17)分化和自身免疫反應中發揮作用[17]，另外Usp7表達水平增加及活性增強使多種抑癌基因P53、第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)穩定性下降[18]，而且Usp7還參與調控核因子κB(NF-κB)信號通路[19-20]。

Usp46基因為人類100多種去泛素化酶[21]中的一種，屬于泛素特異性蛋白酶亞家族，Usp46基因的生理功能目前仍不明確，有研究表明Usp46基因為小鼠“行為抑郁”的責任基因[22-23]，且通過去泛素化谷氨酸受體α-氨基-3 羥基-5 甲基-4 異惡唑受體(AMPAR)調控大腦的興奮性突觸傳遞[24]，提示Usp46基因很可能參與神經系統疾病的發生發展。此外研究發現其在組蛋白H2A和H2B的去泛素化[25]和大腸癌細胞的Akt信號轉導[4， 26]等方面發揮重要作用，而且該基因與EB病毒核抗原3(EBNA3)家族中的EBNA3A和EBNA3C相互作用發揮著調控淋巴細胞的生長和分化的作用[5]，提示該基因很可能在免疫系統中也發揮重要作用，然而其是否在SLE中發揮作用，仍無報道，本研究發現與健康人比較，SLE患者外周血中Usp46基因mRNA表達水平明顯升高，提示該基因可能與SLE的發病有關。

那么該基因能否作為SLE早期診斷的分子標記物呢？本研究發現該基因的表達水平與SLE患者多項臨床指標存在相關性。ESR是反應炎癥的非特異性指標，一般在風濕熱、類風濕關節炎、血管炎等結締組織病的活動期升高，可以作為判斷疾病活動及預后的指標，以往研究表明大多數活動期SLE患者ESR增高，而臨床緩解期SLE患者ESR基本正常，提示ESR檢測可以動態觀察SLE患者病情活動的變化[27]。本研究顯示Usp46基因mRNA與ESR呈正相關，提示該基因與SLE疾病進展有關。然而其與SLEDAI評分無相關性，可能是樣本量較少的原因。

此外，SLE患者早期或活動期會出現血清免疫球蛋白及補體的異常變化[28-30]，當自身抗體與組織有免疫反應出現時，免疫復合物增多，補體系統活化并與免疫復合物結合，在此過程中補體消耗較多，血液中補體成分降低，下降程度與患者病情活動程度相符，因而免疫球蛋白和補體常與自身抗體一起被用于SLE的臨床診斷及病情療效評估。本研究發現Usp46基因的表達水平與IgG、IgM呈正相關，進一步提示Usp46基因可用于SLE患者的病情評價。本研究還發現Usp46基因表達水平與ALT呈正相關，該基因是否與狼瘡性肝損傷有關仍有待進一步研究。

總之，本研究發現Usp46基因mRNA表達水平在SLE患者中明顯升高，約為健康人群的4.22倍，提示Usp46基因可能與SLE的發病有關，而且與ESR、IgG、IgM呈正相關，進一步提示Usp46基因與SLE的病情進展有關，然而其是否能作為SLE輔助診斷的分子標記物，仍需要進一步擴大樣本量進行研究。

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Roleofubiquitin-specificproteases46geneinbloodofpatientswithsystemiclupuserythematosus

ZhangWei1，WeiQun2a，GuoHuifang3，ZhengGuimin2b，ZhangLianzhi1，Pengyuanyuan1，LiuShuxia1

1.DepartmentofPathology，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050017，China; 2a.DepartmentofNosocomialInfectionControl；2b.DepartmentofRheumatology，HebeiGeneralHospital，Shijiazhuang050051，China; 3.DepartmentofRheumatology，theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China

LiuShuxia，Email:susanliu1976@163.com

ObjectiveToinvestigatetheroleofubiquitin-specificproteases46 (Usp46)inthebloodofsystemiclupuserythematosus(SLE)patientsandhealthypopulation.MethodsRealtimepolymerasechainreactionanalysiswasusedtodeterminetheUsp46expressioninthebloodof73patientswithSLEand75healthycontrols.ResultsThemRNAexpressionlevelofUsp46wassignificantlyincreased，about4.22(1.30，17.02)folds，insamplesfromSLEpatientscomparedtohealthypopulation(Z=-6.98，P<0.01).Inaddition，therewassignificantlypositivecorrelationbetweentheexpressionlevelofUsp46andESR，IgG，IgMandALT(P<0.05).ConclusionThemRNAexpressionlevelofUsp46wassignificantlyhigherinSLEpatientsthaninhealthypopulation，whichindicatesthatUsp46mayparticipateinthedevelopmentofSLEprocess.

lupuserythematosus，systemic；genes；bloodsedimentation；ubiquitinspecificprotease46

河北省自然科學基金(H2015206449)；河北省衛生廳重點科技研究計劃(ZD20140034)；河北省大學生創新創業訓練計劃(201510089038)

劉淑霞，Email:susanliu1976@163.com

R

A

1004-583X(2017)08-0686-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.08.010

2017-07-06 編輯:王秋紅