骨軟骨一體化仿生支架的研究現狀與展望

張學亮，劉舒云，郭維民，張雨，陳明學，荊曉光，張增增，張彬，沈師，李建偉，郭全義

骨軟骨一體化仿生支架的研究現狀與展望

張學亮，劉舒云，郭維民，張雨，陳明學，荊曉光，張增增，張彬，沈師，李建偉，郭全義

關節軟骨在日常關節活動中發揮著重要的作用，而隨著社會人口老齡化所導致的退行性軟骨損傷與年輕患者不恰當的運動帶來的運動損傷等，使得關節軟骨損傷的發病率在不斷地上升，且損傷患者也漸趨于年輕化。關節軟骨雖有其相應的代謝活動，但因其缺乏神經、血管及淋巴組織，軟骨一旦破壞便難以自我恢復與再生。如圖 1 所示，常見的關節軟骨損傷中，按其損傷程度大體可以分為三種類型：部分軟骨損傷、全層軟骨損傷與骨軟骨缺損。若部分軟骨損傷與全層軟骨損傷早期未及時發現并做相應的處理，進一步向下惡化便會演變成嚴重的骨軟骨缺損[1]；相應的軟骨下骨損傷后，向上侵襲上層的軟骨層也會造成整體的骨軟骨損傷。因此無論是自上而下所致的骨軟骨損傷還是自下而上導致的骨軟骨損傷，都嚴重影響人體關節的正?；顒?，其不僅給患者的日常生活帶來極大的不便，而且給患者造成巨大的經濟與心理負擔，同時也消耗著大量的社會公共醫療資源。因此，尋求一種有效的骨軟骨修復策略，既是社會的迫切需求與盼望，也是臨床醫生與科學家亟待解決的臨床科學問題之一。

圖1 常見的骨軟骨缺損類型（A：部分軟骨損傷；B：全層軟骨損傷；C：骨軟骨缺損）

近年來，隨著組織工程再生醫學的出現和不斷發展，為骨軟骨損傷后的修復與再生帶來了新的希望。組織工程再生醫學主要包括三個因素：生物支架、種子細胞與生長因子[2]，其中生物支架作為骨軟骨缺損修復再生過程中種子細胞和周圍正常組織滲透募集來的細胞黏附、生長、增殖與分化的基礎，不僅為缺損區的修復與再生提供適宜的生物學環境，而且生物支架的空間結構與機械強度也為骨軟骨損傷后的修復與再生提供有利的力學微環境。因此，利用合適的組織工程骨軟骨一體化仿生多相梯度支架，可以有效地幫助解決骨軟骨損傷后修復與再生的難題，為骨軟骨損傷后的修復再生治療提供一種新的技術與方法。

1 復雜的骨軟骨解剖結構

根據關節軟骨表面到軟骨下骨的纖維走向、細胞形態與密度、糖胺多糖（glycosaminoglycans，GAGs）及各膠原含量、含水量等生物學差異與其相應的力學梯度差異，可將關節骨軟骨大致分為五層：淺表層、中間層（過渡層）、深層（輻射層）、鈣化層、軟骨下骨層，前三層總稱為透明軟骨層，透明軟骨層與鈣化層交界處有一潮線結構，將相對較軟的關節軟骨組織與相對堅硬的鈣化軟骨連接在一起，鈣化軟骨層下方為軟骨下骨平臺，兩層之間交錯結合錨定，交界處形成的結構稱之為粘合線[3]。

1.1 透明軟骨層

淺表層占透明軟骨層總厚度的 10%～20%，以膠原纖維走向與軟骨表面平行且膠原纖維較細（4～12 nm），排列密集為特點。該層軟骨細胞分布密度較高，細胞形態多為瘦長的扁平狀細胞[4]。這一區域的軟骨細胞主要負責組織的外加生長，并被稱為持續型軟骨細胞。在淺表層的最上層區域覆蓋著薄薄的一層非細胞結構，通常只有幾百納米，其主要作用為降低關節軟骨表面摩擦力[5]。這一大分子保護層糖蛋白含量較高，也被稱為淺表層黏膜蛋白多糖。淺表層 II 型膠原與含水量最高，I 型膠原與 GAGs 含量最低。由于淺表層的膠原纖維的排列走向與密度、含水量及 GAGs 含量使得該層的滲透率最高，并且能夠有效地優化分散來自關節的剪切應力。

位于淺表層下方的是中間層，也稱為過渡層。中間層占總透明軟骨層厚度的 40%～60%，膠原纖維較粗（9 ～60 nm），走向與關節軟骨表面交叉，排列不整齊。該層細胞為圓形且隨意排列的軟骨細胞，通常稱為增殖型軟骨細胞[6]。從淺表層到深層，II 型膠原與含水量呈遞減趨勢，I 型膠原與 GAGs 含量呈遞增趨勢。由于該層 GAGs 含量較高，組織的滲透率也低于淺表層，因此，中間層可適度調節和支持來自關節的壓縮應力[7]。

關節軟骨的深層，即輻射層，占總透明軟骨層厚度的20%～50%，膠原纖維粗大（60～140 nm）且排列走向與關節軟骨表面垂直。該層軟骨細胞呈伸長型，有的近球狀，細胞密度與淺表層和中間層相比較低[8]。II 型膠原與含水量最少，I 型膠原與 GAGs 含量最高。深層的滲透率很低，幾乎沒有液體流動能通過該層組織。該層承受最大的界面間剪切應力[9]。部分軟骨損傷的深度只涉及關節透明軟骨層，損傷較輕，潮線完整保留。

1.2 潮線與鈣化層

潮線介于深層與鈣化層間，研究發現隨年齡的增長，組織重建時，潮線的數目也相應的增加。鈣化層位于潮線下方，富含磷灰石與堿性磷酸酶，組織礦化明顯，細胞密度較低，多為圓形肥大的軟骨細胞[10]，同時來自深層的部分粗大的膠原纖維透過潮線將鈣化層與透明軟骨層連接起來。潮線與鈣化層作為較軟的透明軟骨層與較硬的軟骨下骨平臺交界面，在生物學上，該層起著抑制來自骨層血管侵入的屏障作用，防止透明軟骨層礦化的發生；在力學上，該層在關節活動時承受極大的、多變的剪切應力，為其連接的上下兩層提供緩沖性的力學性能支撐。另外從關節軟骨淺表層到軟骨下骨平臺，各層之間彈性模量差異巨大，透明軟骨淺表層、深層、鈣化軟骨層與軟骨下骨的壓縮模量大約分別為 0.079、2.1、320 MPa 與 5.7 GPa[11-12]，由此可見，潮線與鈣化層作為骨和軟骨的交界面，在一體化骨軟骨的結構與功能中發揮著重要的作用。全層軟骨損傷深度達到鈣化軟骨層的水平，潮線不同程度的缺失，但損傷尚未傷及粘合線以下部分。

1.3 軟骨下骨層

軟骨下骨層位于粘合線下，主要是由膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白等各類糖蛋白及長度為 20～80 nm，厚度為 2 ～5 nm 的羥基磷灰石組成的一種納米復合材料[13]。依據血管分布多少與孔隙率可將軟骨下骨層分為兩部分：相對位于上層，緊鄰鈣化軟骨下的為骨皮質，有極少的血管分布與較低的孔隙率；位于下層較深的另一部分則為類海綿狀的松質骨，這一部分則包含豐富的血管與隨機排列的骨小梁多孔結構[14]。軟骨下骨層的完整性是否受到破壞是骨軟骨損傷的標志。

2 目前治療骨軟骨缺損方法的優勢與不足

臨床及實驗研究觀察發現，骨軟骨缺損由于傷及軟骨下骨，創面較深，其中嚴重的骨軟骨缺損需進行創傷性較大的全膝關節置換，但是由于受到全膝關節置換假體的使用壽命限制，手術費用較高，術后各項功能恢復活動受限等各因素的影響，無論從患者的心理接受程度上或實際的修復效果上，都尚未令人滿意。除全膝關節置換外，目前其余的方法均為緩和姑息性治療，主要手術技術包括有：關節鏡清創術、微骨折、自體骨軟骨移植與鑲嵌成形術、異體骨軟骨移植及自體軟骨細胞的移植等[15]。如表 1 所示，目前用于骨軟骨缺損的臨床治療技術方案，也各有其相應的優缺點。

表1 目前膝關節骨軟骨缺損的手術治療方法

傳統的骨軟骨修復策略雖然具有其相應的優勢，但其固有的缺陷也很明顯，如關節鏡清創術治療效果不明顯；微骨折術后修復易形成纖維軟骨，而非正常的透明軟骨；自體或異體骨軟骨移植則存在移植組織來源受限，移植物來源區發病率高，缺損區的修復與周圍關節軟骨不吻合等相應的問題，臨床實際修復效果不理想[23]。基于細胞的治療方法，如自體軟骨細胞移植與自體軟骨細胞外基質移植，亦存在修復區可能產生纖維軟骨、修復填充不完整、與周圍組織的整合較差等問題，其實際效果也尚未得到統一認可。因此，目前臨床中骨軟骨損傷尚缺乏切實有效的修復治療手段。

3 組織工程骨軟骨一體化仿生支架

3.1 骨軟骨缺損治療的新思路

組織工程技術的發展為骨軟骨缺損的治療提供了一種新的思路。通過利用組織工程骨軟骨一體化仿生支架，并結合現有治療方法中的相關優勢，優化支架植入時的手術路徑與手術操作，同時制定系統化、個性化的術后康復理療方案，從而獲得更好的遠期修復效果。系統地回顧研究國內外組織工程骨軟骨一體化支架修復材料的現狀，發現目前應用于骨軟骨缺損修復的生物支架主要集中于負載細胞或因子型支架與非負載型支架兩個方面[24-25]。

部分實驗研究發現，由于受到支架為細胞或因子提供的微環境與實驗動物體內的局部微環境相差甚遠，且種植于支架內的細胞極易流失，在其培養與傳代過程中細胞去分化現象嚴重，也易污染等科學性問題的影響；同時受到細胞來源與相應的醫學倫理學等社會性問題的約束，導致負載細胞或因子型支架不僅制備流程復雜煩瑣，而且其實際的修復效果與非負載型支架修復再生的效果相比也無明顯差異，甚至研究發現非負載細胞型支架通過支架的生物學與力學特性，為周圍組織中細胞的滲透和募集來自骨髓腔的細胞提供相應的生物學線索與力學環境，最終其修復的結果更加完整，再生效果亦更加明顯[26-27]。因此，在實驗研究中與實際臨床應用中，非負載細胞型支架修復再生骨軟骨缺損已成為研究應用的熱點性骨科再生醫學問題。

3.2 理想的骨軟骨支架材料特點

生物支架作為骨軟骨缺損后修復再生的框架與暫時性替代物，在后期骨軟骨修復再生的過程中，其對周圍組織細胞的滲透與募集、黏附、生長與繁殖，正常細胞外基質的分泌發揮重要作用[28]。理想的骨軟骨一體化仿生支架應為細胞生長提供良好的微環境，同時在組織工程骨軟骨支架修復再生中主要應具備以下特點：支架材料應安全無毒，不僅材料所含成分安全且其體內修復過程中相應的降解產物也應以不引發炎癥反應和毒性反應為前提；支架在體內的降解速率應與其修復再生的過程盡量保持一致；應具備良好的生物相容性與表面活性，即支架在修復過程中應與周圍組織融為一體，且支架表面應有利于細胞的黏附和生長增殖，同時也不引起機體相應的免疫排斥反應；支架材料應擁有一定的力學特性，均勻的孔徑及相應的孔隙率，拉伸性能、彈性模量都應與天然骨軟骨結構接近，確保其在修復過程中受到復雜的力學刺激時的穩定性[29-30]。

3.3 常見的骨軟骨一體化支架材料的分類

組織工程骨軟骨一體化仿生支架依據層次結構與成分的不同，可以分為單相支架、雙相支架、三相或多相支架，支架每層均由不同性能的材料或結構類型組成[31]。目前實驗研究與臨床實際應用中常見的骨軟骨支架材料[30,32-34]如表 2 所示。

表2 常見的骨軟骨生物支架材料

3.4 不同支架材料的生物學與力學性能

3.4.1 天然生物支架材料 各類組織工程骨軟骨支架因成分及結構不同，其相應的生物學與力學性能也不同。如天然生物支架材料雖具有生物相容性好，細胞親和力與可降解程度高，有利于后期滲透和募集的細胞黏附與增殖的優勢，但其也有力學性能較差，降解速度過快，來源有限等缺點[35]。

膠原作為動物組織中含量最為豐富的蛋白質之一，其主要作用為提供和維持細胞外基質的結構完整性，而軟骨與骨的細胞外基質中又富含膠原，因此膠原成為骨軟骨組織工程的理想生物支架材料[43]。實驗研究表明，在 3D 膠原凝膠中軟骨細胞能較好地維持其正常軟骨細胞表型，同時在組織修復與傷口愈合過程中膠原也發揮著重要作用。然而，由于膠原較差的力學性能也限制了其在負重區組織修復中的應用。目前，膠原與生物陶瓷的復合材料已被廣泛研究用來提高膠原的力學性能，但其免疫原性、大規模生產和純化仍然是限制膠原臨床應用的主要問題。

殼聚糖是骨軟骨組織工程中另外一種正在被廣泛研究的天然生物材料，其化學結構類似于在軟骨細胞外基質中發現的 GAGs 化學結構，這種仿生的化學結構性質使其非常有利于軟骨細胞的形態發育、分化與增殖[37,44]。

3.4.2 人工合成支架材料與生物陶瓷材料 人工合成支架材料與生物陶瓷材料具有較好的力學特性，可塑性較強，降解率可控及來源廣泛，不受限制等優勢，而其相應的缺點即生物相容性較差，細胞親和力低，部分支架材料缺乏親水性，其降解產物可能存在一定的毒性等。

Shafiee 等[45]通過將親水性的聚乙烯醇（PVA）與疏水性的 PCL 用靜電紡絲技術混紡，來提高人工合成支架材料的親水性與細胞黏附率。并且其通過體外實驗和兔子的體內實驗已證明 PVA 和 PCL 混紡確實可以提高間充質干細胞（MSCs）向軟骨分化與增殖的能力。生物陶瓷中生物玻璃、羥基磷灰石（HA）和磷酸三鈣（TCP）因其較強的力學強度，已成為骨組織工程中常見的支架材料，但其也有材料屬性較脆的相應缺點。

3.4.3 復合材料 隨著組織工程的發展，人們為克服各單一材料的缺點，而將兩種或者兩種以上的材料，依據其特性優勢互補的原則，按一定比例或方式進行搭配復合，設計出能夠滿足骨軟骨組織工程所需的理想支架。復合材料支架結合了各組成單項支架材料的優勢：如降解速率可控，細胞相容性好，支架良好的親水性，生物力學強度適宜等特點。

Lee 和 Wu[46]用纖維蛋白、PCL 與磷酸三鈣（TCP）分層制造了兩種雙相支架，并在培養基中培養了適量的成軟骨和成骨細胞，相應的種植于雙相支架上下層，最后用纖維蛋白膠將兩層黏合成一整體。然而由于通過黏合的方法并無法將兩層緊密結合在一起，最終兩層組織間出現了分離。Wang 等[47]通過液相合成擴散（LPCI）技術、改良熱致相分離（TIPS）等技術，利用豬的軟骨細胞外基質與 nano-HA 制得雙相骨軟骨支架，其中骨層由兩者按比例混合構成，軟骨層則由單獨的取向性豬軟骨細胞外基質組成。由于軟骨細胞外基質富含膠原和 GAGs，且其具有取向性結構，作為軟骨層非常有利于軟骨細胞的生長與增殖，相應的比例混合nano-HA 作為骨層可以縮小骨層結構的孔徑，增強骨層的力學結構，同時防止軟骨層的鈣化。

Vindas 等[48]用 3D 打印的磷酸鈣作為骨層基礎，由馬的軟骨細胞外基質構成軟骨層，通過冷凍干燥與紫外線交聯技術制得雙相骨軟骨支架，但其在修復大動物馬的骨軟骨缺損實驗中由于觀察時間較短，實驗動物特殊，最終未達到預期的再生修復效果。Su 等[49]利用 Col II 與 CS 為材料制備了孔徑約 100 μm 的軟骨層，PLGA 作為骨層，孔徑為500 μm，并在此雙相支架上種植了納米磁性粒子標記的軟骨細胞，觀察其在支架上的生長增殖與分布情況，從而進一步研究此方法對骨軟骨修復再生的效果，實驗結果顯示其支架結構與新技術標記的細胞結合使用在修復再生骨軟骨缺損中具有很好的應用前景。Harley 等[50]制備的骨軟骨一體化支架中軟骨層由 Col I 與 GAGs 混懸液構成，骨層由Col I、GAGs 與 CaP 三者混懸液構成，兩混懸液之間互相滲透結合，再通過物理化學交聯與冷凍干燥成型技術，形成了界面結合錨定緊密，不易分離的雙相骨軟骨支架。Zhang等[51]利用 3D 打印技術制備了軟骨層由 PEG 組成，骨層由 β-磷酸三鈣（β-TCP）構成的雙相骨軟骨一體化支架，由于利用了特殊的制備方法使得雙相支架兩層間錨定結合相當緊密，然后將其植入兔子膝關節骨軟骨造模缺損處，觀察52 周后發現缺損區修復再生效果明顯。

采用反復冷凍干燥技術與物理化學交聯法，制得多層以膠原為基礎的骨軟骨一體支架，其中骨層由 Col I 與 HA混合而成，鈣化層由 Col I、Col II 和 HA 組成，軟骨層由 Col I、Col II 和 HyA 構成，并在大動物山羊的膝關節負重區與非負重區修復再生骨軟骨缺損取得令人滿意的結果[52-54]。有研究用醫用級的 PCL 材料通過熔融沉積成型技術（FDM）與電紡絲（ES）技術，制備了孔隙間互相連接，孔隙率為 70% 的雙相骨層支架，再將 2% 的 Alg 水凝膠按壓在其上方作為軟骨層，最后制得一體化的多相骨軟骨支架[55-56]。將 Col、HA 與 Mg 材料按不同比例混合制備了三相骨軟骨一體化支架，其中軟骨層由 100% 的 Col I組成，鈣化層由 40% 的 Mg-HA 和 60% 的 Col I 構成，骨層則由 70% 的 Mg-HA 和 30% 的 Col I 構成，其支架已在實驗中成功修復綿羊膝關節的骨軟骨缺損，且相關產品已獲歐盟臨床認證并在 145 例的臨床試驗中取得很好的再生修復效果[57-58]。上述實驗結果證明組織工程骨軟骨一體化仿生支架具有較高的臨床試驗研究價值，其在骨軟骨缺損修復再生領域有巨大的應用前景。

4 總結與展望

骨軟骨缺損是近年來臨床廣泛可見且較為嚴重的骨關節疾病，有效的修復與再生骨軟骨缺損一直是組織工程領域迫切需要解決的臨床科學難題。本文系統綜述了目前傳統的骨軟骨缺損治療手段所面臨的問題及組織工程骨軟骨一體化仿生支架的研究現狀。組織工程骨軟骨一體化支架不僅在結構上仿生正常的骨軟骨結構，同時在成分上也仿生天然的骨軟骨成分，達到結構與成分的雙重仿生，最終實現有效地修復與再生骨軟骨缺損。但是，由于正常骨軟骨的解剖結構與成分含量相當復雜，同時在其修復與再生過程中，再生區時間與空間上發生的動態變化，使得骨軟骨缺損區的修復再生不僅僅是簡單的新生組織的“填充”，而是需要既可再生支持透明軟骨的軟骨下骨，又可再生與骨緊密結合的透明關節軟骨，實現軟骨-骨界面一體化的形成及軟骨、骨的并發性再生。

組織工程骨軟骨一體化支架雖然較好地解決了目前傳統治療手段中存在的一些問題，但也有其相應的不足之處。如尚未進行較為深入的骨軟骨一體化支架修復再生的機制性研究，無法從更為微觀的細胞分子水平闡明缺損區的修復再生機制。并且雖然骨軟骨一體化支架進行了結構與成分的雙重仿生，但其無論在生物學水平還是力學水平，都無法與正常骨軟骨結構相比，也無法找到類似天然骨軟骨結構的特殊材料。另外，鈣化層與潮線在骨軟骨結構中發揮著重要作用，而一體化仿生支架尚難完全對其進行仿生，因此，目前還未能較好地解決軟骨層鈣化問題與雙相、多相支架的兩層間易分離的問題。盡管如此，相信組織工程骨軟骨一體化仿生支架能夠通過利用新的制備技術與方法，如 3D 打印技術與靜電紡絲技術，發現或合成新的支架材料，同時結合多學科、多領域進行醫工合作，綜合利用材料學、生物結構學、生物力學等專業，最終解決骨軟骨缺損這一臨床科學難題。

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科技部印發《“十三五”健康產業科技創新專項規劃》

按照《中華人民共和國國民經濟和社會發展第十三個五年規劃綱要》、《“十三五”國家科技創新規劃》、《“健康中國2030”規劃綱要》等的總體部署，為加快推進健康產業科技發展，打造經濟發展新動能，促進未來經濟增長，引領健康服務模式變革，支撐健康中國建設，特制定《“十三五”健康產業科技創新專項規劃》。詳情請登錄國家科學技術部網站http://www.most.gov.cn/mostinfo/xinxifenlei/fgzc/gfxwj/gfxwj2017/201706/t20170614_133528.htm 查閱。

科技部印發《生物技術研究開發安全管理辦法》

為規范生物技術研究開發活動，促進和保障生物技術研究開發活動健康有序發展，有效維護國家生物安全，科技部制定了《生物技術研究開發安全管理辦法》。詳情請登錄國家科學技術部網站 http://www.most.gov.cn/mostinfo/xinxifenlei/fgzc/gfxwj/gfxwj2017/201707/t20170725_134231.htm 查閱。

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.010

國家自然科學基金（81472092）；國家重點研發計劃（2017YFC1104100）；北京市科技專項（Z161100005016059）

100853 北京，中國人民解放軍總醫院骨科研究所/骨科再生醫學北京市重點實驗室/全軍骨科戰創傷重點實驗室（張學亮、劉舒云、郭維民、張雨、陳明學、荊曉光、張增增、張彬、沈師、李建偉、郭全義）；030012 太原，山西省中醫藥研究院（張學亮、李建偉）

郭全義，Email：doctorguo_301@163.com；李建偉，Email：519951700@qq.com

2017-03-29