己烯雌酚對人類高位和低位隱睪睪丸引帶細胞的影響

王冰潔，周君梅，李玲玲，陳方

己烯雌酚對人類高位和低位隱睪睪丸引帶細胞的影響

王冰潔，周君梅，李玲玲，陳方

目的研究外源性雌激素己烯雌酚（DES）在體外對高位和低位隱睪患兒睪丸引帶細胞的影響。

方法以麻醉下未降睪丸的位置位于內(nèi)環(huán)口以上的腹腔型隱睪為高位組，已出內(nèi)環(huán)口但未出外環(huán)口的腹股溝管型隱睪為低位組，分別收集高、低位隱睪患兒術中的廢棄引帶，經(jīng)IV 型膠原酶消化后原代培養(yǎng)、比較其形態(tài)和細胞骨架的差別；將兩組細胞分別培養(yǎng)于溶劑對照組（DMSO）和 DES 濃度梯度為 0.01、0.1、1 及 10 μg/ml 的培養(yǎng)基內(nèi) 24 h。以鬼筆環(huán)肽標記法示 DES 作用前后細胞的形態(tài)學改變；CCK-8 法檢測其增殖能力的變化；熒光定量 PCR 法檢測RXFP2 基因相對表達量的差異。

結果人類高位和低位隱睪睪丸引帶細胞大部分為成纖維細胞樣，其中低位組的細胞可自發(fā)融合成多核肌管樣細胞。高濃度 DES（10 μg/ml）可抑制人類高、低位隱睪的睪丸引帶細胞的增殖、改變細胞的光鏡特征和微絲骨架，但是其對兩組細胞的影響沒有統(tǒng)計學差異。高濃度 DES 上調(diào)兩組細胞 RXFP2 的表達水平。

結論人類高、低位隱睪的睪丸引帶細胞具有不同的形態(tài)特征；高濃度外源性雌激素可改變高位和低位隱睪的睪丸引帶細胞骨架、抑制細胞的增殖活力并上調(diào)人類引帶 RXFP2 基因的表達。

隱睪； 睪丸引帶細胞； 己烯雌酚

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術, 2017, 12(4):310-316

隱睪中高位隱睪約占 10%[1]，臨床發(fā)現(xiàn)，未降睪丸位置越高，其發(fā)育越差[2]，且手術并發(fā)癥發(fā)生率越高[3]，但隱睪未降睪丸位置高低不一的原因目前尚未闡明。人類睪丸引帶發(fā)育異常是隱睪發(fā)生的重要因素之一[4-5]。睪丸引帶主要由細胞外基質(zhì)及間充質(zhì)細胞（主要包括成纖維細胞、少量平滑肌細胞及骨骼肌細胞）構成[6]。已有學者發(fā)現(xiàn)人類高位隱睪及低位隱睪睪丸引帶的細胞基質(zhì)成分中總膠原成分存在差異[7]，提示引帶組織的發(fā)育和功能在人類高、低位隱睪中不盡相同。目前動物研究已發(fā)現(xiàn)外源性雌激素己烯雌酚（DES）可改變小鼠睪丸引帶細胞的微絲骨架并抑制其增殖[8]，其對人類睪丸引帶的影響尚未見報道。DES 是否通過影響睪丸引帶，繼而影響到睪丸的下降和停留位置尚有待研究。

基于以上原因，本實驗擬首先對人類高位及低位隱睪睪丸引帶進行原代細胞培養(yǎng)、觀察其形態(tài)差異，在此基礎上進一步研究外源性 DES 對兩組細胞的作用及其差異，探尋其與高、低位隱睪發(fā)生的關系，以期為隱睪的防治提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 人類睪丸引帶組織來源于上海市兒童醫(yī)院泌尿外科的隱睪患兒，患兒術前均明確診斷為隱睪，未伴發(fā)其他泌尿生殖系統(tǒng)畸形，且未接受內(nèi)分泌治療及其他促進睪丸下降的治療。根據(jù)麻醉后未降睪丸的位置分為 2 組，麻醉下未降睪丸的位置位于內(nèi)環(huán)口以上的腹腔型隱睪為高位組，出內(nèi)環(huán)口但未出外環(huán)口的為低位組。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會的批準（編號：2016R009-F01），標本采集已征得患兒家長的知情同意。

1.1.2 實驗材料 DMEM 基礎培養(yǎng)基、青鏈霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、胎牛血清、IV 型膠原酶、胰酶均購自美國 Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO）、DES 購自美國 Sigma 公司；Trizol 試劑購自美國 Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本 Takara 公司；實時熒光定量 PCR 試劑盒購自瑞士 Roche 公司；引物設計及合成由上海生工生物工程公司承擔；鬼筆環(huán)肽及 CCK-8 試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡購自德國 Leica 公司；生物安全柜購自新加坡 Esco 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱及紅光/紫外分光光度計購自美國 Thermo 公司；酶標儀購自德國BMG Labtech 公司；臺式高速冷凍離心機購自德國Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 睪丸引帶細胞的培養(yǎng) 手術切取睪丸引帶組織后立即放入完全培養(yǎng)基（DMEM 基礎培養(yǎng)基中添加 10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素、L-谷氨酰胺及非必需氨基酸）并密封于冰上，低溫運送至生物安全柜操作。取出組織用 IV 型膠原酶（1 mg/ml）37 ℃ 水浴消化 1 h 后，1000 r/min 離心 4 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸，吹打洗滌，再次1000 r/min 離心 4 min，棄上清。細胞沉淀加入完全培養(yǎng)基，吹勻后接種于 4 孔板中，置于 5% CO2、37 ℃ 飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng)。48～72 h 換液1 次，待細胞生長達 90% 融合后進行傳代。

1.2.2 實驗分組 分別培養(yǎng)高位及低位隱睪的第3 代睪丸引帶細胞用于細胞實驗，高位組及低位組細胞各分為 6 組：正常對照組以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；溶劑對照組在完全培養(yǎng)基中加入 0.1% DMSO；其余 4 組分別以含 DES 終濃度為 0.01、0.1、1 及10 μg/ml 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組細胞于 5% CO2、37 ℃ 條件下培養(yǎng) 24 h 用于實驗。

1.2.3 免疫細胞化學染色 分別取高、低位隱睪的睪丸引帶細胞爬片，PBS 洗 3 次，每次 5 min；加入 4% 多聚甲醛室溫固定 30 min；PBS 洗滌3 次，每次 5 min；加入鬼筆環(huán)肽避光孵育 30 min，然后 PBS 洗滌 3 次，DAPI 復染核后封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖與活力 取對數(shù)生長期的兩組隱睪睪丸引帶細胞，將其接種于 96 孔板，2 × 104個細胞/孔。按 1.2.2 分組，誘導 24 h 后分別加入 CCK-8，避光置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱中孵育2 h，檢測每孔 450 nm 波長下的吸光度（A），計算細胞活力。

細胞活力（%）=（A實驗組–A空白組）/（A對照組–A空白組）× 100%

1.2.5 細胞總 RNA 抽提及 RT-PCR 取對數(shù)生長期的高位及低位隱睪的睪丸引帶細胞，Trizol 法抽提總 RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量 PCR 檢測：①增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）基因表達水平，引物正向序列5' TCTGAGGGCTTCGACACCTA 3'，反向序列5' CGCG TTATCTTCGGCCCTTA 3'；②松弛素/胰島素樣家族肽受體 2（RXFP2）基因表達水平，引物正向序列 5' ACTCAACTGGGTGGATTTGGA 3'，反向序列 5' TGTCTTCTCTGGAACAAAACCAA 3'；③內(nèi)參基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），其正向序列 5' GCACCGTCAAGGCTGAGAAC 3'，反向序列 5' TGGTGAAGACGCCAGTGGA 3'。實驗中所用引物濃度均為 10 μmol/L，擴增條件為：95 ℃ 預變性 10 min；95 ℃ 變性 10 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，40 個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用 SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，高位及低位組組間比較采用獨立樣本t檢驗；高、低位組內(nèi)各濃度組之間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05 即認為差異有顯著性。

2 結果

本實驗高位組招募 7 例患兒，低位組招募22 例患兒分別進行睪丸引帶原代細胞培養(yǎng)，其中高位組成功培養(yǎng)出 5 例，低位組成功培養(yǎng)出 16 例；兩組各取 3 例進行引帶細胞 DES 刺激實驗。

2.1 DES 作用下隱睪睪丸引帶細胞的光鏡特征

研究發(fā)現(xiàn)，高位組引帶細胞光鏡下細胞形態(tài)為成纖維樣細胞，胞體呈梭型或不規(guī)則多邊形，胞質(zhì)有突起，胞核圓（圖 1A）；高位組引帶細胞在溶劑對照組及低濃度 DES（0.01、0.1 和 1 μg/ml）作用下未見明顯形態(tài)改變；而在高濃度 DES（10 μg/ml）作用下，細胞開始從蓋玻片表面脫離，死亡明顯增多，存活細胞胞體皺縮（圖 1B）；低位隱睪睪丸引帶細胞的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)部分細胞自發(fā)出現(xiàn)細胞融合現(xiàn)象，表現(xiàn)為多核肌管樣細胞，胞體大而長，多個胞核并排于胞質(zhì)中（圖 1C 白色箭頭）；低位溶劑對照組及低濃度 DES（0.01、0.1 和1 μg/ml）作用下未見明顯形態(tài)改變；低位組細胞在高濃度 DES（10 μg/ml）作用下發(fā)生了類似高位組的變化（圖 1D）。

2.2 己烯雌酚可改變?nèi)祟惛摺⒌臀浑[睪睪丸引帶細胞的微絲骨架

圖1 DES 對高、低位隱睪睪丸引帶細胞形態(tài)的影響（白色箭頭示多核細胞）Figure 1 Effects of DES on morphology of cryptorchidism testis gubernaculum cell in high and low position (White arrows show multinucleated cells)

圖2 鬼筆環(huán)肽標記的 DES 對高、低位隱睪睪丸引帶細胞骨架的影響（白色箭頭示多核細胞）Figure 2 Effects of DES on cytoskeleton of cryptorchidism testis gubernaculum cell in high and low position (White arrows show multinucleated cells)

鬼筆環(huán)肽標記的肌動蛋白絲（F-actin）熒光染色顯示，高位隱睪引帶細胞微絲骨架（綠色）清晰，肌動蛋白分布均勻（圖 2A）；高位組引帶細胞在溶劑對照組及低濃度 DES（0.01、0.1 和 1 μg/ml）作用下未見明顯細胞骨架改變；而在高濃度 DES（10 μg/ml）作用后，鏡下觀察可見死細胞增多，存活細胞肌動蛋白纖維排列紊亂，細胞骨架重塑（圖 2B）；低位組隱睪引帶細胞骨架清晰，肌動蛋白骨架舒展且分布均勻，多個細胞核（藍色）位于一個細胞內(nèi)（圖 2C 白色箭頭）；低位組引帶細胞在溶劑對照組及低濃度 DES（0.01、0.1 和1 μg/ml）作用下未見明顯形態(tài)改變；而在高濃度DES（10 μg/ml）作用后，鏡下觀察低位引帶細胞骨架也發(fā)生與高位組類似重塑改變（圖 2D）。

2.3 己烯雌酚可抑制人類高、低位隱睪睪丸引帶細胞的增殖并上調(diào) RXFP2 表達量

高、低位溶劑對照組與正常對照組相比沒有顯著性差異，高位組 DES 作用 24 h 后的細胞增殖活力數(shù)值分別為（98.47 ± 6.58）%、（99.68 ±3.48）%、（99.42 ± 3.20）%、（98.41 ± 2.11）%、（72.07± 5.71）%，但是只有高濃度 DES（10 μg/ml）與對照組相比存在統(tǒng)計學差異（P= 0.0005）；低位組DES 的細胞增殖活力數(shù)值分別為（95.44 ± 3.97）%、（96.53 ± 3.01）%、（91.15 ± 8.59）%、（83.16 ±6.11）%、（67.77 ± 3.01）%，也呈現(xiàn)下降的趨勢，但只有 10 μg/ml 濃度組與對照組存在統(tǒng)計學差異（P= 0.038）（圖 3A）。為此，我們分別檢測了高、低位組細胞在高濃度 DES 組的 PCNA 表達量，發(fā)現(xiàn)高濃度 DES 組處理后兩組細胞的 PCNA均下降（P= 0.002，圖 3B），差異均有統(tǒng)計學意義；而在高濃度 DES 處理后高、低位引帶細胞的 INSL3 受體 RXFP2 表達量均呈現(xiàn)上升趨勢（圖 3C）；但 DES 對高、低位兩組的細胞增殖的抑制影響、PCNA 及 RXFP2 的表達水平改變均沒有顯著性差異。

圖3 DES 對高、低位隱睪睪丸引帶細胞增殖活力及相關基因表達量影響（*P＜ 0.05，**P＜ 0.01）（A：DES 作用 24 h 后高、低位隱睪睪丸引帶細胞增殖力變化；B：10 μg/ml DES 作用 24 h 后高、低位隱睪睪丸引帶細胞 PCNA 相對表達量的變化；C：10 μg/ml DES 作用 24 h 后高、低位隱睪睪丸引帶細胞 RXFP2 相對表達量的變化）Figure 3 Effects of DES on proliferation vitality and related gene expression of cryptorchidism testis gubernaculum cell in high and low position (*P＜ 0.05,**P＜ 0.01) (A: The change of cell proliferation vitality after exposure to DES for 24 h in the high and low group; B: The change of PCNA relative expression after exposure to DES 10 μg/ml for 24 h in the two groups; C: The change of RXFP2 relative expression after exposure to DES 10 μg/ml for 24 h in the two groups)

3 討論

隱睪睪丸位置高低與睪丸發(fā)育和手術效果密切相關[1,9]，目前針對高、低位隱睪的研究多集中于手術方式的改良，而高位和低位隱睪的發(fā)病機制有何差異仍有待研究，睪丸引帶異常是引起隱睪的重要病因，其與高、低位隱睪發(fā)生的關系有待研究。

我院兒童專科醫(yī)院特色生物樣本庫的建立為隱睪等先天性疾病的研究提供了實驗平臺[10]。隱睪是出生后才可明確診斷的以臨床癥狀命名的疾病，在胚胎期尚無法推測其出生后睪丸能下降的最終位置，且人類胚胎睪丸引帶采集涉及備受爭議的倫理問題，故本研究采集的標本系隱睪形成后的引帶而不是形成過程中的引帶。Robbins 等[11]在大鼠的胚胎睪丸引帶中培養(yǎng)出長條的多核肌管細胞，提示正常胚胎睪丸引帶應具有向肌細胞分化的潛能。本研究發(fā)現(xiàn)，人類低位隱睪睪丸引帶原代培養(yǎng)的部分細胞在體外可自發(fā)融合成多核肌管樣細胞，考慮到原代細胞培養(yǎng)存在一定細胞損耗，因而并非所有低位隱睪引帶均可培養(yǎng)出肌管細胞。這與 Robbins 等對大鼠胚胎睪丸引帶－提睪肌復合體原代培養(yǎng)出的間充質(zhì)細胞融合成多核肌管細胞的現(xiàn)象相一致。而在人類高位睪丸引帶原代培養(yǎng)的細胞均未觀察到多核肌管細胞形成。以上結果提示，人類隱睪睪丸引帶在發(fā)育過程中具有肌肉樣細胞的成分差異，該差異可能會影響下降睪丸的最終停留位置，其具體機制仍有待進一步研究。

近年來，越來越多的證據(jù)表明，環(huán)境因素可影響人類健康[12]，其中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)（endocrine-disrupting chemicals，EDCs）與隱睪的發(fā)生相關，其代表因子 DES 可通過影響機體內(nèi)分泌系統(tǒng)進而干擾生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能[13]，使動物及人類后代隱睪發(fā)病率升高[14-15]。動物實驗中已經(jīng)發(fā)現(xiàn) DES 可致小鼠睪丸引帶細胞骨架重塑、細胞周邊肌動蛋白絲帶模糊、應力纖維增加[16-17]。細胞骨架是由細長的蛋白質(zhì)聚合物纖維形成的網(wǎng)絡，肌動蛋白細胞骨架纖維的組裝和拆解存在一個動態(tài)平衡，其重組的調(diào)節(jié)對細胞內(nèi)運輸、收縮、運動、分裂和增殖的過程至關重要[18]。DES 對小鼠引帶細胞的影響提示其可致 F-actin 發(fā)生解聚、形成應力纖維，導致胞質(zhì)內(nèi)細胞骨架排列紊亂，繼而可能降低細胞的收縮、影響其分裂和增殖。綜上所述，DES 可改變小鼠引帶細胞骨架形態(tài)并影響其增殖功能，但目前尚沒有針對其他種屬的睪丸引帶細胞做相關的研究驗證工作，故本研究在睪丸引帶動物實驗研究的基礎上進行 DES 對人類引帶細胞的骨架及增殖功能研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度 DES（10 μg/ml）影響人類高位和低位隱睪睪丸引帶細胞、導致細胞 F-actin骨架重塑、細胞死亡增多，這與之前在小鼠睪丸引帶細胞中觀察到的結果相似[16-17]；此外，隨著 DES暴露濃度的增加，僅見高濃度 DES 對高位和低位隱睪睪丸引帶細胞的增殖均具有明顯抑制作用，且兩組細胞在高濃度狀態(tài)下的 PCNA 表達均顯著下調(diào)也進一步證實了該現(xiàn)象，而低濃度亞組均未見明顯統(tǒng)計學差異。以上結果提示，DES 可能通過濃度依賴的方式改變高、低位隱睪睪丸引帶細胞的細胞骨架、影響 F-actin 組裝和拆解的動態(tài)平衡、繼而導致細胞肌動蛋白骨架重塑，由此阻礙了細胞分裂的過程、導致細胞增殖能力的下降和收縮力的改變、繼而影響到睪丸引帶的發(fā)育、導致隱睪的發(fā)生。本研究未發(fā)現(xiàn)各濃度組的 DES 對高位和低位引帶細胞的作用具有明顯差異，其原因可能在于 DES對于各個階段的細胞均具有毒性作用，一旦不同發(fā)育階段的胚胎接觸到 DES，即會對該階段的細胞產(chǎn)生影響，根據(jù)受 DES 影響時的不同胎齡而導致不同結果，出生后表現(xiàn)為高位或低位隱睪。

此外，已有研究證實，RXFP2 與引帶發(fā)育密切相關[19]。目前有學者以小鼠胚胎期宮內(nèi)暴露于DES 后雄性后代的睪丸引帶為研究對象檢測RXFP2 的受體表達水平的改變，以期探尋 DES 對睪丸引帶作用的內(nèi)分泌通路。該課題組發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)暴露于 DES（50 μg/kg·d）RXFP2 表達水平較對照組升高[20]。此外，李建宏等[21]在體外用 DES（10 μg/ml）刺激小鼠引帶原代細胞后，其 RXFP2 表達呈現(xiàn)上調(diào)，與胚胎期宮內(nèi)暴露引帶的結果相一致。上述結果均與本實驗中人類高、低位引帶細胞在體外暴露于 10 μg/ml DES 的激素相關受體基因表達的結果相一致，說明人類高位隱睪睪丸引帶細胞在 DES毒染的作用下呈現(xiàn)出與小鼠引帶細胞相似的激素受體水平改變，推測 DES 可能是通過 RXFP2 通路影響人類引帶細胞的生長，具體機制仍有待進一步研究。

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組織生物樣本庫標準化培訓將在青島舉辦

2017年 9月 7 – 9日，“標準化理論與國家標準制修訂培訓班、生物樣本庫崗前培訓和生物樣本庫質(zhì)量達標檢查培訓”將在青島舉辦。本次培訓班由中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會組織生物樣本庫分會、全國醫(yī)藥生物樣本標準化技術委員會和中國生物樣本庫聯(lián)盟主辦。

中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會組織生物樣本庫分會于 2009年，經(jīng)衛(wèi)生部、民政部批復成立，分會秉承“珍惜樣本、執(zhí)行標準、充分應用、維護產(chǎn)權”的宗旨，充分發(fā)揮行業(yè)規(guī)范、學術交流、教育培訓、國際交流、科研服務的主要職能。自成立以來，組織舉辦九屆中國生物樣本庫標準化建立與應用研討會、四屆中國生物樣本庫院長高峰論壇，與國家 863 分子分型項目組、癌癥基因組共同編寫了《中國生物樣本庫與數(shù)據(jù)庫建立指南》，編譯《ISBER 最佳實踐 2012》，制定《中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會生物樣本庫標準（試行）》，為我國近 100 家醫(yī)院提供培訓，為全國數(shù)十家醫(yī)院提供質(zhì)量控制。同時，全國生物樣本標準化技術委員會于 2015年 6月經(jīng)國家標準化管理委員會批復成立。

會務組聯(lián)系電話：021-51320288-5307。聯(lián)系人：徐艷萍。

The effect of diethylstilbestrol on high and low gubernaculums cells from cryptorchid patients

WANG Bing-jie, ZHOU Jun-mei, LI Ling-ling, CHEN Fang

ObjectiveTo explore the effect of diethylstilbestrol (DES) between the primary cells cultured from gubernaculum testis of cryptorchid patients whose undescend testis located in high position and low position.

MethodsThe gubernaculum testis were collected from cryptorchid patients during orchidopexy.Two groups named high group and low group were divided depending on the position of undescended testis after anesthesia.The position which was higher than the inner ring or between the inner ring and the outer ring was named the high group or the low group, respectively.The primary cells were cultured through type IV collagenase digestion and their morphology and cytoskeleton differences were compared.Then we cultured cells of the two groups in solvent control group (DMSO) and DES concentration gradient of 0.01, 0.1, 1 and 10 μg/ml and compared them with the control group respectively.Meanwhile the morphology, cell proliferation changes and the relative expression level of gene RXFP2 were detected.

ResultsHuman gubernaculum testis cells were mostly fibroblast-like and no difference was found between them in cytoskeleton.The morphology of high group cells did not change significantly while some low group cells spontaneously fused into multinucleated myotubes during culture.Additionally, high concentration of DES (10 μg/ml) changed the morphology and microfilament cytoskeleton of human cryptorchidism gubernaculum testis cells and inhibited their proliferation in both groups, but there was no statistical differences in the effects on the cells of two groups.The expression of RXFP2 was up-regulated by high concentration of DES at high concentration (10 μg/ml) in both groups.Meanwhile the expression level of PCNA was significantly lower in the DES group than that in the control group in both high and low groups.

ConclusionHigh concentration exogenous estrogen can remodel the microfilament cytoskeleton of human cryptorchidism gubernaculum cells and inhibits their proliferation in both groups, but no significant difference is found between the two groups.DES of high concentration (10 μg/ml) up-regulates the expression level of human RXFP2 gene.

Cryptorchidism; Gubernaculum testis cells; Diethylstilbestrol

ZHOU Jun-mei, Email: junmei_zhou@139.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.004

國家自然科學基金（81270742、81370700、81470911）；上海交通大學醫(yī)工交叉研究基金（YG2016MS32）

200040 上海交通大學附屬兒童醫(yī)院/上海市兒童醫(yī)院泌尿外科（王冰潔、陳方），中心實驗室（周君梅、李玲玲）

周君梅，Email：junmei_zhou@139.com

2017-03-23

Author Affiliation:Department of Urology (WANG Bing-jie, CHEN Fang), Central Laboratory (ZHOU Jun-mei, LI Ling-ling),Shanghai Children’s hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200040, China