人視網膜母細胞瘤Y79細胞依托泊苷耐藥株的建立及其耐藥機制初探

宋文憑，張誠玥，張燕，李毅，曹睿，葉程，張琳，邵榮光，李亮，趙軍陽

人視網膜母細胞瘤Y79細胞依托泊苷耐藥株的建立及其耐藥機制初探

宋文憑，張誠玥，張燕，李毅，曹睿，葉程，張琳，邵榮光，李亮，趙軍陽

目的通過構建人視網膜母細胞瘤 Y79 細胞的依托泊苷耐藥株，比較耐藥株的藥物敏感性和細胞生長情況，觀察耐藥相關基因及細胞信號通路的變化，從而闡釋人視網膜母細胞瘤對依托泊苷的耐藥機制。

方法以不同濃度梯度的依托泊苷處理 Y79 細胞，采用濃度遞增不間斷刺激法構建依托泊苷耐藥株，觀察耐藥株細胞的形態學變化和細胞生長增殖情況以及對依托泊苷細胞毒作用的敏感性；以 caspase 3/7 酶活性來評估耐藥株的細胞凋亡程度，并通過 Western blot 方法研究與細胞增殖和耐藥相關蛋白的表達變化。

結果成功構建耐受依托泊苷的人視網膜母細胞瘤耐藥株Y79/EDR，最大耐藥濃度為 500 nmol/L。和親本細胞相比，耐藥細胞具有較強的生長增殖能力，倍增時間縮短 14.5 h（P＜ 0.001）；且對依托泊苷的敏感性顯著下降，耐藥指數達 29.47。Caspase 3/7 活性檢測結果顯示，給予親本及耐藥細胞不同濃度的依托泊苷后，耐藥細胞中 caspase 3/7 活性明顯低于親本細胞，凋亡減少，且呈藥物濃度依賴性。Western blot 結果表明，耐藥細胞中磷酸化 AKT（p-AKT）表達明顯高于親本細胞，提示其 p-AKT 的活性明顯增強，p-AKT 促進其下游蛋白 MDM2 的磷酸化從而抑制 p53的磷酸化，而凋亡相關蛋白 Bax/Bcl-2 的比值明顯降低。多藥耐藥性蛋白 P-糖蛋白（P-gp）的表達下調，Rb1 蛋白表達水平無明顯變化，提示耐藥株 Y79/EDR 的耐藥并不依賴于 P-gp 而產生，且與 Rb1 蛋白無關，而可能通過增加腫瘤驅動蛋白 AKT 的磷酸化，激活其所介導的下游信號通路，增加靶蛋白 MDM2 的表達，從而抑制抑癌蛋白 p53 的表達；同時增加抗凋亡蛋白 Bcl-2 和降低抑凋亡蛋白 Bax的表達水平；最終導致細胞通過增殖顯著增強和凋亡明顯減少而產生耐藥。

結論成功構建依托泊苷耐藥株 Y79/EDR，初步結果表明，其耐藥細胞株可能通過促進細胞生長與增殖，同時抑制細胞凋亡而導致耐藥，這將為深入研究人視網膜母細胞瘤的病變機制，闡釋其對依托泊苷的耐藥機制，尋找有效的耐藥逆轉方案提供一定的前期實驗基礎。

視網膜母細胞瘤； 依托泊苷； 化療耐藥細胞株； Y79 細胞系

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2017, 12(4):297-302

視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，RB）是一種多發于兒童的眼內惡性腫瘤，病因多為人類首個發現的抑癌基因 RB1 及其等位基因的失活[1]。在全球每年新生兒中，該疾病發病率基本穩定在1/16 000～1/18 000，大約每年新增 8000 例患者[2]。亞洲、非洲等欠發達國家的視網膜母細胞瘤患者死亡率達到 40%～70%，歐美發達國家僅為 3% ～5%；而且欠發達國家包括中國在內的患者多為高風險的 D、E 晚期，常伴有復發轉移，預后差[3]。視網膜母細胞瘤的治療以保住患者性命為第一要務，其次是眼球和視力的保留[4]。

根據患者的發病年齡、腫瘤大小、腫瘤所在位置以及腫瘤周邊組織等情況，視網膜母細胞瘤可以采用多種治療手段，如眼球摘除術、放射療法、經瞳孔溫熱療法、激光光凝術、冷凍療法、多種給藥途徑的化學療法等[5]。上述一些治療手段易引發輻射性視網膜病變、白內障、面部畸形以及誘發二次腫瘤等相關并發癥，因此，全身化療是治療視網膜母細胞瘤的最好選擇[6]。目前，我國視網膜母細胞瘤的一線標準療法是眼球摘除后三藥（卡鉑、依托泊苷、長春新堿）聯合靜脈療法[4]。針對復發轉移的晚期高風險視網膜母細胞瘤的治療仍為一大難題，大部分患者由于產生耐藥性而影響療效，進而復發、侵襲外轉移，甚至死亡。

因此，本研究力圖建立人視網膜母細胞瘤細胞Y79 對依托泊苷的耐藥株（Y79 etoposide drug resistant，Y79/EDR），從而探討其可能產生耐藥的內在機制，為后續治療視網膜母細胞瘤，克服對依托泊苷及其他化療藥物所產生耐藥的機制研究提供初步的實驗依據，從而促進針對晚期高風險視網膜母細胞瘤的耐藥復發進行新型靶向藥物的研發。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及藥物 人視網膜母細胞瘤 Y79 細胞購自中國醫學科學院腫瘤醫院；藥物依托泊苷購自美國 Sigma-Aldrich 公司。

1.1.2 實驗試劑 細胞培養用 1640 培養基、胎牛血清、10 000 U/ml 青霉素及 10 000 μg/ml 鏈霉素均購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司；Cell counting kit-8（CCK-8）購自日本 Dojindo 公司；Caspase-glo 3/7 assay 試劑盒購自美國 Promega 公司；蘇木素-伊紅（HE）染色套液、細胞總蛋白的提取及定量所用 RIPA 裂解液和 BCA 試劑購自上海碧云天生物技術研究所；無水乙醇、95% 乙醇、甲醛購自北京化工廠；Western blot 所用一抗購自美國 Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；化學發光液購自美國 Millipore 公司。

1.1.3 實驗儀器 甩片機為美國 Thermo Scientific公司產品；倒置顯微鏡為日本 Olympus公司產品；酶標儀為美國 BioTek 公司產品；化學發光檢測儀為美國 SpectraMax 產品；凝膠成像分析儀為美國 FluorChem HD2 產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及藥物配制 人視網膜母細胞瘤Y79 細胞培養在含 20%（V/V）胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml 鏈霉素的 1640 培養基中，培養條件為：37 ℃、5% CO2。藥物依托泊苷用 DMSO配制成 100 mmol/L 母液，之后處理細胞所用濃度均以無菌 PBS 緩沖液或含血清培養基做相應稀釋。

1.2.2 耐藥細胞株 Y79/EDR 的建立及其形態特征 選用人視網膜母細胞瘤 Y79 細胞進行依托泊苷耐藥株 Y79/EDR 的構建，以三倍濃度梯度增長的依托泊苷處理親本 Y79 細胞，從最低濃度1 nmol/L 直到最大耐受濃度 500 nmol/L 持續作用達 6 個月，得到能在 500 nmol/L 的依托泊苷中穩定生長的細胞株。取細胞密度為 1 × 105個/ml 的親本 Y79 細胞和 Y79/EDR 耐藥細胞各 200 μl，于甩片機中以 1000 r/min 離心 4 min，PBS 緩沖液洗 3 次，4% 多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定30 min，常規 HE 染色，顯微鏡下觀察并比較親本及耐藥細胞株的形態學特征。

1.2.3 細胞生長曲線的測定及倍增時間的計算 利用 CCK-8 觀察細胞的增殖，其原理即通過與活細胞中的去氧脫氫酶反應，生成水溶性的橘黃色甲瓚，根據其 450 nm 處的吸光度（A450）來測定生長速率。將親本及耐藥細胞按照每孔 5 ×103個/200 μl 的密度接種于 96 孔板中，孔板邊緣用無菌 PBS 緩沖液填充，以單加培養基的孔為空白對照，將 11 塊培養板置于 37 ℃、5% CO2的孵箱中，每隔 24 h 取出一塊板，于每孔中加入 20 μl CCK-8試劑，在孵箱中繼續孵育 2 h 后用酶標儀測其A450。空白對照孔校準后，繪制細胞生長曲線。

細胞倍增時間的計算公式為：

tD= t × lg 2/（lgNt– lgN0），其中，tD為倍增時間，t 為培養時間，N0、Nt分別代表接種后及接種t 小時后的細胞數。

1.2.4 藥物敏感性檢測 取對數生長期的親本Y79 細胞和 Y79/EDR 耐藥細胞，按照每孔 2.0 ×104個/180 μl 密度接種于 96 孔板中，培養 24 h后加入不同濃度的依托泊苷 20 μl，使其終濃度分別為 0.1、1、10、100、1000、10 000、100 000、1 000 000 nmol/L，對照孔加入相同體積的無菌 PBS緩沖液，以單加培養基的空白孔為調零孔，不同處理組分別對應 3 個副孔。藥物作用 48 h 后加入20 μl 的 CCK-8 試劑于孵箱中繼續培養 2 h，測其A450。計算依托泊苷對 Y79 和 Y79/EDR 的半數抑制率（IC50）。

細胞抑制率（%）=[（對照組A450– 調零孔A450）–（實驗組A450– 調零孔A450）]/（實驗組A450– 調零孔A450）× 100%

耐藥指數（RI）= IC50（Y79/EDR）/IC50（Y79）

1.2.5 Caspase 3/7 酶活性測定 取對數生長期的親本 Y79 細胞和 Y79/EDR 耐藥細胞，按照每孔 1.0 × 104個/90 μl 細胞密度接種于 96 孔酶標板中，培養 24 h 后加入 10 μl 不同濃度的依托泊苷，使其終濃度分別為 1 μmol/L 和 10 μmol/L，對照孔加入相同體積的無菌 PBS 緩沖液，單加培養基的孔作為調零孔。藥物作用 48 h 后，取caspase-glo 3/7 assay 試劑盒，放置到室溫后，將caspase 3/7 底物及緩沖液混合均勻，吸取 100 μl加入上述酶標板孔中，室溫下混合孵育 1 h 后，化學發光檢測儀檢測其熒光強度，確定 caspase 3/7酶的活化程度。

1.2.6 Western blot 檢測 收集對數生長期的Y79 和 Y79/EDR 細胞，用含 1% 苯甲基磺酰氟（PMSF）的 RIPA 裂解液提取細胞中的總蛋白，冰上裂解 30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心 20 min后取上清，并用 BCA 試劑進行蛋白定量。各取25 μg 總蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，電泳完成后，將凝膠中的蛋白轉印至 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉；一抗（1∶1000）4 ℃ 過夜孵育，PBST（含 0.1%吐溫 的 PBS 緩沖液）洗滌 3 次，每次 5 min；加入 1∶5000 稀釋的 HRP 標記的二抗，室溫孵育2 h，PBST 洗滌 3 次，每次 5 min；化學發光液顯色，凝膠成像儀掃描拍照。

1.3 統計學處理

實驗數據以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜ 0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 耐藥細胞株 Y79/EDR 的建立及其形態學特征

利用人視網膜母細胞瘤細胞 Y79 進行依托泊苷耐藥細胞株的構建，藥物濃度從 1 nmol/L 開始三倍濃度遞增，經過 6 個月的誘導，得到能在 500 nmol/L 依托泊苷中穩定生長的耐藥株Y79/EDR。如圖 1 所示，與親本 Y79 細胞（1A）比較，Y79/EDR 耐藥細胞（1B）的形態學特征發生明顯變化，細胞體積增大，且分裂相細胞數明顯增多，說明細胞增殖加快。

2.2 耐藥細胞株 Y79/EDR 的生長增殖速率明顯加快

經過 CCK-8 試驗得到的兩種細胞體外生長速率顯示（圖 2），親本 Y79 細胞在培養 9 d 后達到生長增殖的高峰，而 Y79/EDR 耐藥細胞在第7 天就達到生長增殖高峰。Y79 的體外倍增時間為（31.80 ± 2.54）h，而 Y79/EDR 的倍增時間為（17.24 ± 0.81）h。與 Y79 相比，Y79/EDR 的倍增時間縮短 14.5 h（P＜ 0.001），表現出較強的生長增殖能力。

2.3 耐藥細胞株 Y79/EDR 對依托泊苷的敏感性明顯減弱

圖1 Y79（A）和 Y79/EDR（B）的形態學特征（40 ×）Figure 1 Morphological characteristics of Y79 (A) and Y79/EDR (B) (40 ×)

圖2 Y79 和 Y79/EDR 細胞的生長曲線（***P＜ 0.001）Figure 2 Growth curve of Y79 and Y79/EDR cells (***P＜0.001)

圖3 Y79 和 Y79/EDR 細胞對依托泊苷的劑量-存活率曲線Figure 3 The dose-survival curves of Y79 and Y79/EDR exposed to etoposide

圖3 為親本 Y79 細胞和 Y79/EDR 耐藥細胞對依托泊苷的劑量-存活率曲線。其中，Y79 的IC50為（1.20 ± 0.02）μmol/L，而 Y79/EDR 表現出對依托泊苷較強的耐受性，IC50為（35.36 ±3.41）μmol/L，耐藥指數為 29.47。

2.4 耐藥細胞株 Y79/EDR 經依托泊苷誘導所致的 caspase 3/7 酶活性明顯降低

圖4 Y79 和 Y79/EDR 細胞依托泊苷處理后的 caspase 3/7 活性（**P＜ 0.01，***P＜ 0.001）Figure 4 Activities of caspase 3/7 in Y79 and Y79/EDR cells after exposure to etoposide (**P＜ 0.01,***P＜ 0.001)

與對照組相比，在給予不同濃度的依托泊苷后，親本 Y79 細胞和 Y79/EDR 耐藥細胞中的caspase 3/7 酶活性均升高，但兩者存在顯著性差異（1 μmol/L：P＜ 0.001；10 μmol/L：P＜ 0.01）；相較 Y79，在相同濃度的依托泊苷作用下，Y79/EDR的 caspase 3/7 酶活性明顯降低，提示其細胞的凋亡程度減少，且呈濃度依賴性（圖 4）。

2.5 耐藥細胞株 Y79/EDR 的相關功能蛋白的表達變化

Western blot 結果（圖 5）表明，相較親本 Y79細胞，Y79/EDR 耐藥細胞中 p-AKT 的表達顯著升高，促進 MDM2 蛋白的磷酸化，進而抑制 p53 的磷酸化，且細胞凋亡相關蛋白 Bcl-2 增加，Bax 降低，Bax/Bcl-2 比例明顯降低，揭示 Y79/EDR 的耐藥可能是通過 p-p53 的表達水平降低，進而增加抗凋亡蛋白 Bcl-2 和降低促凋亡蛋白 Bax 的表達，抑制細胞凋亡的產生。此外，與親本 Y79 細胞相比，Y79/EDR 耐藥細胞中 Rb1 蛋白的表達無變化，P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表達無增反降，提示該耐藥機制并非通過 Rb1 和 P-gp介導的細胞耐藥來完成，而有可能通過對 AKT 磷酸化的增強，AKT 活性增加，從而促進下游靶蛋白 MDM2 的磷酸化，降低抑癌蛋白 p53 的磷酸化，使凋亡相關蛋白 Bcl-2 增加和 Bax 降低而導致耐藥。

3 討論

圖5 Y79 和 Y79/EDR 細胞中增殖、凋亡及多藥耐藥相關蛋白的表達情況Figure 5 Expressions of proteins associated with proliferation,apoptosis and multi-drug resistance in Y79 and Y79/EDR cells

依托泊苷是從鬼臼脂中分離出來的木脂體類有效成分，是一種細胞周期特異性抗腫瘤藥物，作用于細胞分裂 S 晚期或 G2 期，它通過與 DNA拓撲酶 II 相結合從而抑制其活性，導致受損的DNA 不能得到修復[7]。依托泊苷廣泛用于多種腫瘤的治療，如霍奇金病、肺癌、卵巢癌、骨髓瘤、胃癌、乳腺癌等[8-11]。已有研究表明，化療藥物耐藥可能產生的主要原因是藥物的細胞滲透性比較差，與多藥耐藥相關蛋白相互作用而導致耐藥[12-14]。由MDR1 基因表達的 P-gp 相當于一個藥物泵，能將藥物排出到細胞外，從而導致耐藥；此外，MDR 相關蛋白的表達也在化療耐藥中起著重要作用[15-18]。而本研究成功構建的依托泊苷耐藥株 Y79/EDR，Western blot 結果顯示，P-gp 的表達并沒有升高，說明此耐藥株不是通過高表達 P-gp 而耐藥。

已有研究證實，PI3K-AKT 信號通路在調節腫瘤細胞的增殖和存活中起著至關重要的作用[19]。本研究結果表明，相較親本 Y79 細胞，Y79/EDR 耐藥細胞的倍增時間明顯縮短，而且進一步實驗結果顯示，耐藥株中 p-AKT 表達上調，促進細胞增殖及存活。p53 作為一個抑癌基因，能通過促進細胞凋亡來達到抑制腫瘤的作用[20]，本研究發現，與親本 Y79 細胞相比，Y79/EDR 耐藥細胞中促凋亡基因 p53 的磷酸化水平下調。線粒體凋亡途徑在細胞凋亡過程中起著至關重要的作用，而作為 Bcl-2家族主要成員的 Bcl-2 和 Bax 在調節細胞線粒體凋亡途徑中作用巨大。Bcl-2 通過抑制 Cyt C 從線粒體釋放阻止凋亡，與之相反的是，Bax 能夠促進凋亡，因此，Bax/Bcl-2 的比值是公認的與細胞凋亡相關的指標[21]。本研究結果顯示，相較親本 Y79細胞，Y79/EDR 耐藥細胞中 Bcl-2 表達上調而Bax 表達下調，且實驗結果也證實其下游 caspase 3/7 活性降低，說明耐藥細胞株通過調節 Bcl-2、Bax 的表達，從而抑制 caspase 3/7 的活性，起到抗凋亡的作用。綜上，初步研究結果表明，耐藥細胞 Y79/EDR 是通過促進自身增殖及存活同時抑制細胞凋亡達到耐藥目的。

本研究初步探索了視網膜母細胞瘤細胞株Y79 對依托泊苷耐藥的分子機制，但對耐藥株停止給藥后，耐藥性是否發生變化及其耐藥的深層機制有待進一步探索。本研究將為未來深入研究人視網膜母細胞瘤對依托泊苷耐藥的機制和尋找有效的耐藥逆轉方案奠定基礎。

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Generation of etoposide-resistant subline of human retinoblastoma Y79 cells and preliminary study on the mechanism of drug resistance

SONG Wen-ping, ZHANG Cheng-yue, ZHANG Yan, LI Yi, CAO Rui, YE Cheng, ZHANG Lin, SHAO Rong-guang, LI Liang,ZHAO Jun-yang

ObjectiveTo generate etoposide-resistant cell line of human retinoblastoma Y79 cells (Y79 etoposide-drug-resistant, Y79/EDR)and explore the underlying mechanism of etoposide resistance.

MethodsThe etoposide-resistant subline of human retinoblastoma Y79 cells were selectedin vitroby prolonged exposure to 3-fold stepwisely increasing concentrations of etoposide.Y79/EDR cells were finally maintained in culture with 500 nmol/L of etoposide,followed by cell counting kit (CCK-8) and caspase-glo 3/7 assays for testing the growth rate, cytotoxicity and apoptosis induced by etoposide in both Y79 and Y79/EDR cells, respectively.Western blot assay was performed to determine if any cell signaling pathways might be involved in etoposide resistance in Y79/EDR cells.

ResultsY79/EDR cells were obtained after 6 months constitutive treatment at the concentration of 500 nmol/L.The growth rate of Y79/EDR significantly increased and its doubling time was shortened by 14.5 h as compared to Y79 parental cells (P＜ 0.001) with the resistance index of 29.47.The activity of caspase 3/7 in Y79/EDR cells was significantly decreased as compared to Y79 cells in a manner of etoposide concentration dependent (P＜ 0.01).The results from Western blot assay indicated that AKT and p53 mediated cellular proliferation signaling pathways might be involved in etoposide resistance of Y79/EDR cells, whereas the expression levels of Rb1 and P-glycoprotein (P-gp) genes had no alteration.

ConclusionOur preliminary results suggested that the mechanisms of acquired resistance to etoposide in human retinoblastoma Y79 cells might be involved in the promotion of cellular proliferation and inhibition of cell apoptosis mediated by AKT signaling pathway.

Retinoblastoma; Etoposide; Chemoresistance resistant cell line; Y79 cell line

s:LI Liang, Email: liliang@imb.pumc.edu.cn; ZHAO Jun-yang; Email: zhaojunyang@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.002

國家自然科學基金（81472787）

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所腫瘤室（宋文憑、李毅、曹睿、葉程、邵榮光、李亮）；100045北京，首都醫科大學附屬北京兒童醫院眼科（張誠玥、張燕、趙軍陽）；100075 北京聯合大學特殊教育學院（張琳）

李亮，Email：liliang@imb.pumc.edu.cn；趙軍陽，Email：zhaojunyang@163.com

2017-06-06

Author Affiliations:Department of Oncology, Institute of Medicinal Biotechnology of Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (SONG Wen-ping, LI Yi, CAO Rui, YE Cheng, SHAO Rong-guang, LI Liang); Ophthalmology Department, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045, China (ZHANG Cheng-yue, ZHANG Yan, ZHAO Jun-yang); Beijing United University Special Education College, Beijing 100075, China (ZHANG Lin)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(4):297-302