“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化

王 佳 石 樂(lè) 趙惠新

(新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 烏魯木齊 830054)

1 前言

“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”實(shí)驗(yàn)是人教版高中生物學(xué)必修1《分子與細(xì)胞》第2章第3節(jié)中的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)有效幫助學(xué)生理解DNA和RNA在細(xì)胞中的分布特點(diǎn)，強(qiáng)化對(duì)基礎(chǔ)知識(shí)的掌握，提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作能力，為學(xué)習(xí)必修2(遺傳與進(jìn)化)的內(nèi)容奠定基礎(chǔ)。

按教材步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，觀察到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均為紫紅色，細(xì)胞核難以染成綠色，影響教學(xué)效果。經(jīng)分析，可能存在以下幾種原因：①染色劑甲基綠中含有甲基紫，甲基紫易遮住甲基綠和吡羅紅所染的綠色和紅色，使整個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)紫紅色[1]；②用酒精燈烘干裝片溫度過(guò)高：酒精燈火焰溫度在400℃～500℃左右，而高溫會(huì)使核酸分子的空間構(gòu)型發(fā)生改變，難以與甲基綠結(jié)合呈現(xiàn)綠色[2]；③水解所用鹽酸溶液濃度較高：鹽酸能改變細(xì)胞膜的通透性，使DNA和蛋白質(zhì)分離，有利于DNA與甲基綠結(jié)合，但也能改變DNA構(gòu)型及細(xì)胞內(nèi)的pH，降低甲基綠與DNA的親和力；④染色劑中甲基綠與吡羅紅的體積比不適宜：如甲基綠所占比例低也可能導(dǎo)致細(xì)胞核中的DNA不被染成綠色。

針對(duì)這些原因，對(duì)該實(shí)驗(yàn)中材料的固定方法、水解所用鹽酸的濃度、染色方法等方面進(jìn)行優(yōu)化，提出與教材比較貼合的實(shí)驗(yàn)方案。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 實(shí)驗(yàn)材料為人的口腔上皮細(xì)胞。主要試劑有生理鹽水、氯仿、2%～8%的鹽酸、2%的甲基綠、1%的吡羅紅。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法 參照教材中“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”的實(shí)驗(yàn)操作步驟，略有改動(dòng)。其中：①烘干方式采用酒精燈外焰烘烤和60℃烘箱作對(duì)比；②水解使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%、6%、4%、2%、0%梯度的鹽酸做對(duì)比；③染色劑甲基綠使用前先用氯仿分液提純，染色時(shí)甲基綠和吡羅紅的體積比分別使用3∶1、4∶1、5∶1和6∶1做對(duì)比。比較實(shí)驗(yàn)效果，提出本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的建議。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 不同烘干方式對(duì)細(xì)胞核染色效果的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在火焰上(上方稍高處)和60℃烘箱內(nèi)對(duì)材料進(jìn)行烘干并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表1的結(jié)果顯示，A、B、E、F、I、J、M、N這8組實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞核被染成了藍(lán)綠色。從A與E、B與F、I與M、J與N為對(duì)照來(lái)看，火焰上方烘烤和60℃烘箱烘干對(duì)染色效果沒(méi)有影響，都把細(xì)胞核染成了藍(lán)綠色。但考慮到用酒精燈進(jìn)行烘干時(shí)，學(xué)生可能因操作不當(dāng)而發(fā)生玻片破碎等危險(xiǎn)情況、或因掌握不好烘烤的距離和時(shí)間使實(shí)驗(yàn)失敗，因此我們建議用烘箱代替酒精燈進(jìn)行烘干操作。

表1 不同條件下人的口腔上皮細(xì)胞染色現(xiàn)象

( -表示不進(jìn)行此操作)

3.2 不同鹽酸濃度對(duì)細(xì)胞核染色效果的影響 如表1所示，水解所用的鹽酸濃度是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵影響因素之一。當(dāng)鹽酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不超過(guò)2%時(shí)，細(xì)胞核顯藍(lán)綠色；當(dāng)超過(guò)2%，雖然能改變細(xì)胞膜的通透性、使DNA和蛋白質(zhì)有效分離，但可能存在沖洗不徹底，細(xì)胞內(nèi)pH低于4.8，甲基綠與DNA親和力低而不結(jié)合等情況。另外，甲基綠與DNA的結(jié)合依賴(lài)于DNA完整的雙螺旋構(gòu)型。甲基綠分子結(jié)構(gòu)中帶2個(gè)正電荷的基團(tuán)只有分別與DNA雙螺旋每一圈的磷酸根結(jié)合，才能使DNA顯綠色，而吡羅紅對(duì)改變構(gòu)型的DNA和聚合度低的RNA有較大的親和力使其顯紅色。因此，當(dāng)使用較高濃度的鹽酸時(shí)，可能因細(xì)胞核中的DNA構(gòu)型發(fā)生改變，使甲基綠與DNA結(jié)合能力降低，不顯綠色。

所以本實(shí)驗(yàn)可選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的鹽酸或不使用鹽酸。但考慮到鹽酸能有利于DNA與蛋白質(zhì)解離，幫助學(xué)生更好地理解DNA在細(xì)胞中存在的結(jié)構(gòu)和分布等知識(shí)點(diǎn)，建議在實(shí)際教學(xué)中可保留鹽酸的使用，采用2%的鹽酸進(jìn)行水解。

3.3 甲基綠純化及兩種染色劑不同的配比對(duì)細(xì)胞核染色效果的影響 染色劑甲基綠中常含有甲基紫，易將細(xì)胞核染成紫紅色。甲基紫能溶于氯仿，而甲基綠不溶，所以在實(shí)驗(yàn)前將溶于水中的甲基綠與氯仿等體積混合，置于分液漏斗中分液，排出含甲基紫的氯仿，以減少其對(duì)染色效果的干擾。

染色劑中甲基綠和吡羅紅的體積比也是一個(gè)關(guān)鍵的影響因素。有研究表明，作為堿性染料的甲基綠和吡羅紅都能與DNA發(fā)生結(jié)合，并存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，但甲基綠與DNA結(jié)合能力更強(qiáng)，也更穩(wěn)定，這是由DNA分子雙螺旋的空間構(gòu)型所決定的[3]。從表1中A、B、E、F、I、J、M、N組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，當(dāng)2%甲基綠與1%吡羅紅的體積比為5∶1或6∶1時(shí)，細(xì)胞核被染成了藍(lán)綠色，效果明顯，而在體積比為3∶1和4∶1時(shí)未能呈藍(lán)綠色，說(shuō)明甲基綠在混合染液中的含量對(duì)染色效果具有重要作用。從C、D、E、F組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比來(lái)看，甲基綠與吡羅紅的體積比為5∶1和6∶1時(shí)細(xì)胞核被染成較明顯的藍(lán)綠色，比值在6∶1時(shí)細(xì)胞核染色更深，但由于在6∶1時(shí)細(xì)胞質(zhì)亦被染成了藍(lán)綠色，所以在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中應(yīng)選用5∶1的比例進(jìn)行染液的配制較適宜。

4 優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件

基于上述的結(jié)果及分析，可對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn)：①使用60℃的烘箱對(duì)材料進(jìn)行烘干；②將教材中水解所用的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的鹽酸換成2%的鹽酸；③對(duì)甲基綠進(jìn)行提純，并使用體積比為5∶1的2%甲基綠與1%吡羅紅配制染色劑進(jìn)行染色。使用優(yōu)化后的方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)效果明顯，且與教材中的步驟基本保持一致，對(duì)該內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)教學(xué)具有一定參考價(jià)值。

(*通訊作者)