低氧條件下HIF-1α及P-gp在結(jié)腸癌組織及多種細胞系中的表達

楊光磊，胡巖芳，趙 珊，葛國慶，胡延偉，霍彩娟，彭林濤

(1.邢臺市人民醫(yī)院普外科，河北邢臺 054031；2.邢臺市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北邢臺 054031；3.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，石家莊 050000)

2016年度重慶市出版專項資金資助項目

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低氧條件下HIF-1α及P-gp在結(jié)腸癌組織及多種細胞系中的表達

楊光磊1，胡巖芳2，趙 珊3，葛國慶1，胡延偉1，霍彩娟1，彭林濤1

(1.邢臺市人民醫(yī)院普外科，河北邢臺 054031；2.邢臺市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北邢臺 054031；3.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，石家莊 050000)

目的 探討腫瘤低氧環(huán)境對低氧誘導因子1α(HIF-1α)及P-糖蛋白(P-gp)表達的影響及二者的相關(guān)性。方法 選取2013年6月至2015年6月邢臺市人民醫(yī)院58例結(jié)腸癌患者手術(shù)切除后標本，采用免疫組織化學法檢測HIF-1α與P-gp在結(jié)腸癌組織中的表達情況，分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系；采用細胞爬片法檢測常氧與低氧條件下HIF-1α與P-gp在結(jié)腸癌細胞株中的表達情況，并分析HIF-1α與P-gp表達的相關(guān)性。結(jié)果 58例患者結(jié)腸癌組織標本HIF-1α蛋白陽性表達率為58.62%，P-gp陽性表達率為46.55%；HIF-1α與P-gp陽性表達率在Dukes分期C+D期者均明顯高于A+B期者，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；HIF-1α與P-gp的表達呈正相關(guān)(r=0.574，P<0.01)。同一細胞株中，低氧下HIF-1α及P-gp表達水平均高于常氧，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而相同氧環(huán)境下不同結(jié)腸癌細胞株間HIF-1α及P-gp表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 HIF-1α與P-gp在結(jié)腸癌組織中存在過表達和共表達現(xiàn)象，在不同Dukes分期和是否伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素中二者陽性表達率存在明顯差異，且HIF-1α與P-gp表達呈明顯正相關(guān)；低氧可誘導結(jié)腸癌細胞中HIF-1α與P-gp蛋白表達水平的升高。

低氧誘導因子1α；P糖蛋白；結(jié)腸腫瘤

結(jié)腸癌是常見的臨床惡性腫瘤之一，主要治療手段有手術(shù)治療、化學治療及放射治療等[1]。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的藥物流出蛋白，其在癌細胞中的作用類似于排出泵，通過把癌細胞中化學治療藥物外排而降低藥效[2-3]。P-gp對不同大小多種分子產(chǎn)生作用，其大多為疏水分子，部分存在于細胞膜上。在傳統(tǒng)的惡性腫瘤治療中，P-gp既能和藥物結(jié)合，又能和腺苷三磷酸(ATP)相結(jié)合，過表達的P-gp蛋白會使腫瘤細胞產(chǎn)生對多種化學治療藥物的耐藥現(xiàn)象，導致藥物的效應減弱甚至消失。有資料報道，復發(fā)和難治的白血病P-gp會增加。結(jié)腸癌中腫瘤細胞的缺氧現(xiàn)象非常常見，在腫瘤細胞缺氧的條件下，體內(nèi)氧調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因低氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)起重要作用。HIF-1在人和哺乳動物細胞內(nèi)普遍存在，在常養(yǎng)下也會有表達，但合成的HIF-1蛋白很快就會被降解，只有在缺氧條件下HIF-1才能夠穩(wěn)定表達。HIF-1α與腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切，且缺氧還可導致腫瘤細胞化療療效減低[4-5]。HIF-1α亞基在翻譯后就會被降解，因此，在正常氧飽和下不能檢測到亞基的表達，但在缺氧情況下，亞基的降解會被抑制。目前，關(guān)于HIF-1α與P-gp相互作用參與結(jié)腸癌發(fā)生及治療過程的研究較少。故本研究通過免疫組織化學技術(shù)觀察結(jié)腸癌組織標本中HIF-1α與P-gp的表達和分布情況，研究HIF-1α與P-gp在結(jié)腸癌組織及細胞系中的表達及相關(guān)性，進而探討腫瘤低氧環(huán)境對HIF-1α及P-gp表達的影響及二者表達的變化關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸癌發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年6月至2015年6月邢臺市人民醫(yī)院58例結(jié)腸癌患者手術(shù)切除后標本，其中男30例，女28例；年齡25～80歲，平均(54.23±1.27)歲；左半結(jié)腸30例，右半結(jié)腸28例；Dukes分期：A期12例，B期19例，C期18例，D期9例；分化程度：高分化9例，中分化26例，低分化23例；其中19例伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有患者均確診為結(jié)腸癌，術(shù)前均未接受放化療等治療。HCT-116、HT-29、LoVo、SW480均為本室保存人結(jié)腸癌傳代細胞系。本研究通過該院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 HIF-1α與P-gp在結(jié)腸癌組織中的表達檢測 免疫組織化學法[6-7]：組織標本滴加3%過氧化氫，在37 ℃下孵育15 min，滴加1∶100比例稀釋的一抗，4 ℃下孵育過夜；然后滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，以陽性顯色充分而背景無雜色干擾為標準，顯微鏡下觀察顯色。結(jié)果判定：每張切片在高倍鏡(×400)下隨機選5個觀測點，每個觀測點計數(shù)200個細胞，計算顯色棕黃色顆粒的陽性細胞百分率，陽性細胞百分率大于或等于1%判為陽性片，陽性細胞數(shù)百分率小于1%判為陰性片。

1.2.2 HIF-1α與P-gp在結(jié)腸癌細胞株中的表達檢測 細胞爬片法[8-9]：取生長狀態(tài)良好的細胞，進行常規(guī)培養(yǎng)，1 d后對照組繼續(xù)在常氧下培養(yǎng)，實驗組更換新鮮培養(yǎng)基后進行低氧處理；滴加3%過氧化氫，在37 ℃下孵育15 min，滴加1∶100比例稀釋的一抗，4 ℃下孵育過夜；然后滴加DAB顯色液。結(jié)果經(jīng)圖像分析軟件Image-Pro Plus鑒定，得到蛋白陽性信號平均吸光度(A)值用來比較表達差異。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸癌組織中HIF-1α與P-gp表達的免疫組織化學結(jié)果 HIF-1α蛋白主要在結(jié)腸癌細胞細胞質(zhì)及細胞核中表達，見圖1。P-gp主要在結(jié)腸癌細胞細胞質(zhì)及細胞膜中表達，見圖2。58份標本中，HIF-1α蛋白陽性表達率為58.62%(34/58)，P-gp為46.55%(27/58)，二者陽性表達率在Dukes分期C+D期者均明顯高于A+B期者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HIF-1α、P-gp陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；二者表達均不受患者年齡、性別、腫瘤分化程度及腫瘤位置的影響(P>0.05)，見表1。

2.3 HIF-1α與P-gp在結(jié)腸癌細胞株中表達的免疫細胞化學染色結(jié)果 HIF-1α與P-gp在結(jié)腸癌HCT-116、HT-29、LoVo、SW480等4種細胞株中均有表達。常氧下二者表達都很弱，低氧處理后二者表達明顯增強；同一細胞株中，低氧下HIF-1α及P-gp表達水平均高于常氧，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而相同氧環(huán)境下不同結(jié)腸癌細胞株間HIF-1α及P-gp表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 結(jié)腸癌組織中HIF-1α與P-gp表達的相關(guān)性 HIF-1α與P-gp表達呈正相關(guān)(r=0.574，P<0.01)，見表2。

A:細胞質(zhì)；B：細胞核

圖1 HIF-1α蛋白在結(jié)腸癌細胞細胞質(zhì)及細胞核中的表達

A:細胞質(zhì)；B：細胞核

圖2 P-gp在結(jié)腸癌細胞細胞質(zhì)及細胞膜中的表達

*：P<0.05，與Dukes分期C+D期比較；#：P<0.05，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較

表3 常氧及低氧條件下HIF-1α與P-gp在結(jié)腸癌細胞中的表達

*：P<0.01，與常氧下相同結(jié)腸癌細胞比較

3 討 論

結(jié)腸癌的發(fā)病主要和高脂肪、低膳食纖維飲食相關(guān)，其慢性炎癥會使腸癌的發(fā)生率比一般人群高。而缺氧的結(jié)腸癌，會使腫瘤細胞發(fā)生改變，不僅自身存活率增加，還會對其他藥物產(chǎn)生耐藥性，影響結(jié)腸癌的治療效果。HIF-1在1992年被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于哺乳動物和人體細胞中，由HIF-1α和HIF-1β兩個亞單元構(gòu)成[10]。HIF-1β主要存在于細胞核和細胞質(zhì)中，而HIF-1α僅在缺氧條件下出現(xiàn)在細胞核中，常氧下則迅速降解，因此HIF-1α成為細胞缺氧情況下調(diào)控基因表達的主要轉(zhuǎn)錄因子之一[11-12]。目前來看，相當多的HIF-1α抑制藥物效果比較弱，只能抑制腫瘤暫時的生長。據(jù)報道，用一種小分子抑制劑把前列腺癌細胞中的HIF-1α表達阻止后，它對細胞毒性藥物的化療效果提高[13]。因此，研究HIF-1α對腫瘤細胞的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移和治療的意義重大。P-gp蛋白是一個比較常見的保護細胞免受外來有害分子入侵的分子泵，是一種跨膜糖蛋白，具有能量依賴性“藥泵”功能，又能和其他藥物有效結(jié)合，通過把癌細胞中化學治療藥物外排而降低藥效[13-14]。本課題通過研究HIF-1α與P-gp在結(jié)腸癌組織及細胞系中的表達及相關(guān)性，探討腫瘤低氧環(huán)境對HIF-1α及P-gp表達的影響及二者表達的變化關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸癌發(fā)生中的作用。

本研究結(jié)果顯示，HIF-1α蛋白主要在結(jié)腸癌細胞細胞質(zhì)及細胞核中表達，P-gp亦主要在結(jié)腸癌細胞細胞質(zhì)及細胞膜中表達。在58例患者結(jié)腸癌組織標本中，HIF-1α蛋白陽性表達率為58.62%，P-gp為46.55%，二者陽性表達率在Dukes分期C+D期者均明顯高于A+B期者(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HIF-1α、P-gp陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。表明可能由于P-gp的高表達，引起腫瘤化學治療療效降低，可導致腫瘤具有較強的浸潤與轉(zhuǎn)移能力[15]。因此，在臨床監(jiān)測結(jié)腸癌進展及轉(zhuǎn)移時，可以把HIF-1α與P-gp的表達情況作為的一個重要指標[16]。

為進一步明確HIF-1α與P-gp在結(jié)腸癌中所起到的作用，本研究通過免疫細胞化學染色在常氧及低氧培養(yǎng)條件下檢測4種結(jié)腸癌細胞株中HIF-1α與P-gp的表達情況，探討腫瘤低氧環(huán)境對HIF-1α及P-gp表達的影響及二者表達的變化關(guān)系。結(jié)果顯示：HIF-1α與P-gp在結(jié)腸癌HCT-116、HT-29、LoVo、SW480細胞株中均有表達。常氧下二者表達都很弱，低氧處理后二者表達均明顯增強。同一細胞株中，低氧下HIF-1α及P-gp表達水平均高于常氧(P<0.01)；而相同氧環(huán)境下，不同結(jié)腸癌細胞株間HIF-1α及P-gp表達水平無明顯差異(P>0.05)。說明低氧可以誘導結(jié)腸癌細胞株HIF-1α與P-gp的表達水平上升[17]。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HIF-1α與P-gp表達呈正相關(guān)(r=0.574，P<0.01)，說明HIF-1α與P-gp共同參與了結(jié)腸癌的生長、轉(zhuǎn)移，可能存在一定的相互作用關(guān)系[18]。

綜上所述，HIF-1α與P-gp在結(jié)腸癌組織中存在過表達和共表達現(xiàn)象，在不同Dukes分期和是否伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素中二者陽性表達率有明顯差異，且二者表達呈明顯正相關(guān)；低氧可以誘導結(jié)腸癌細胞中HIF-1α與P-gp蛋白水平表達升高，HIF-1α可能通過與P-gp直接或間接地相互作用而參與結(jié)腸癌的發(fā)生。

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Expressions of HIF-1α and P-gp in colon carcinoma tissues and cell lines under hypoxic conditions

YangGuanglei1，HuYanfang2，ZhaoShan3，GeGuoqing1，HuYanwei1，HuoCaijuan1，PengLintao1

(1.DepartmentofGeneralSurgery,XingtaiPeople′sHospital,Xingtai,Hebei054031,China；2.DepartmentofNeurology,XingtaiPeople′sHospital,Xingtai,Hebei054031；3.DepartmentofOncology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050000,China)

Objective To investigate the effects of hypoxic conditions on expressions of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) and P-glycoprotein (P-gp),and the relationship between HIF-1α and P-gp.Methods Tumor tissues from 54 cases of patients with colonic neoplasm in Xingtai People′s Hospital were selected after operation from June 2013 to June 2015.The expressions of HIF-1α and P-gp in colonic tumor tissues were detected by using immunohistochemistry,and their correlations to clinical and pathologic features were analysed.The expressions of HIF-1α and P-gp in colonic tumor cell lines under normoxia and hypoxia conditions were detected by using cell smear method,and correlation between HIF-1α expression and P-gp expression was analysed.Results Among tumor tissues from 58 cases of patients with colonic neoplasm,the positive rate of HIF-1α expression was 58.62%,and that of P-gp expression was 46.55%.The positive rates of HIF-1α and P-gp expressions of patients on the Dukes stage C+D were significantly higher than those of patients on A+B phase (P<0.05).Additionally,the positive rates of HIF-1α and P-gp expressions of patients with lymphatic metastasis were significantly higher than those of patients without lymphatic metastasis (P<0.05).The HIF-1α expression was positively correlated with the P-gp expression (r=0.574，P<0.01).For the same cell lines,the expression levels of HIF-1α and P-gp under hypoxia condition were significantly higher than those under normoxia condition,there were statistically significant differences (P<0.01).While,under the same oxygen conditions,no statistically significant difference was found in expression levels of HIF-1 and P-gp among different colonic tumor cell lines (P>0.05).Conclusion Overexpression and coexpression of HIF-1α and P-gp exist in colon cancer.The expression levels of HIF-1α and P-gp in patients with different Dukes stages and patients with or without lymph node metastasis are significantly different,and positive correlation is observed between the expression of HIF-1α and P-gp.Hypoxia condition can induce an increase in expressions of HIF-1α and P-gp in colonic tumor cells.

hypoxia-inducible factor 1α；P-glycoprotein；colonic neoplasms

2016年度重慶市出版專項資金資助項目

楊光磊(1982-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事結(jié)腸癌化療耐藥和抗凋亡機制方面的研究。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.19.020

R735.4

A

1671-8348(2017)19-2659-03

2017-02-19

2017-04-24)