A20基因缺失對彌漫大B細胞淋巴瘤臨床病理特征和預后的影響及相關分子機制研究

馮江龍，楊文秀，王佳蕊，李 泊

(1.貴州醫科大學病理學教研室，貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院病理科，貴陽 550004)

?

·論 著· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.19.002

A20基因缺失對彌漫大B細胞淋巴瘤臨床病理特征和預后的影響及相關分子機制研究

馮江龍1，楊文秀2△，王佳蕊1，李 泊2

(1.貴州醫科大學病理學教研室，貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院病理科，貴陽 550004)

目的 檢測彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)中腫瘤壞死因子α誘導蛋白3基因(A20基因)缺失情況，探討A20基因缺失對DLBCL臨床過程及預后的影響及其與核因子-κB(NF-κB)通路活化的關系。方法 熒光原位雜交檢測其A20基因缺失情況；免疫組織化學染色檢測腫瘤中A20、Survivin、P65、Ki-67蛋白的表達，TUNEL技術檢測腫瘤細胞凋亡水平，收集臨床病理資料并隨訪，進行統計分析。結果 DLBCL病例A20基因缺失率為21.7%，活化后B細胞樣型(ABC)-DLBCL的A20基因缺失率明顯高于生發中心B細胞樣型(GCB)-DLBCL(30.6%vs. 8.3%，P<0.05)，A20蛋白表達與A20基因缺失呈負相關(r=-0.259，P=0.023)，P65蛋白和Survivin蛋白表達與A20基因缺失呈正相關(r=0.280、0.313，P=0.015、0.007)；腫瘤細胞凋亡在A20基因缺失的DLBCL病例中較低，在A20蛋白表達陽性病例中明顯高于表達陰性病例，在Survivin和P65蛋白陽性表達病例中明顯低于陰性表達病例(P<0.05)，而在ABC-DLBCL和GCB-DLBCL病例間差異無統計學意義(P>0.05)；COX回歸分析結果顯示，年齡、A20基因的缺失、DLBCL類型和Ki67表達是DLBCL獨立的生存相關因素；A20基因缺失者的生存狀況明顯較未缺失者差(P=0.015)。結論 A20缺失可能影響A20蛋白表達，使其對NF-κB活化的負調節作用減弱，使Survivin表達上調而影響腫瘤細胞的增殖和凋亡；A20基因缺失對DLBCL的臨床過程和預后有一定影響。

淋巴瘤；A20基因；NF-κB；Survivin；預后；基因缺失

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是成人淋巴瘤中最常見的一種類型，約占非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)的30%[1]，在我國已達45.8%[2]。它可發生于任何年齡，以中老年人最為常見，中位發病年齡60～64歲。根據腫瘤細胞的基因表達譜，非特指的DLBCL可分為生發中心B細胞樣型(germinal center B-cell-like，GCB)和活化后B細胞樣型(activated B-cell-like，ABC)及原發性縱隔B細胞淋巴瘤型(primary mediastinal B-cell lymphoma，PMBL)。不同亞型的DLBCL無論在發病機制還是在臨床預后方面都顯現出差異，其治療效果也不盡相同。最近研究發現，核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)與DLBCL的發生、發展關系密切，NF-κB信號傳導通路的激活是DLBCL的一個重要特性[3]。在NF-κB通路中，P50/P65是最常見的NF-κB二聚體，與靶基因的啟動子DNA結合，激活基因轉錄。在DLBCL中存在多種與NF-κB異常活化相關的基因異常。腫瘤壞死因子α誘導蛋白3基因(tumor necrosis factor alpha-induced protein 3 gene，TNFAIP3，A20 gene)就是其中之一。凋亡抑制基因Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor apoptosis of protein，IAP)家族成員，它在很多腫瘤的發生、發展中具有作用。Survivin在間變性大細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和DLBCL中的異常及其對上述淋巴瘤臨床過程的影響國內外都有一些報道[4]。Survivin是NF-κB的下游調控基因，主要通過直接作用于凋亡蛋白酶級聯效應因子半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-7而發揮抗凋亡作用[5]。DLBCL中存在的A20基因的缺失是否通過NF-κB信號通路的持續活化而影響Survivin的表達，并影響淋巴瘤的發生、發展尚不清楚。據此，本研究收集了一組DLBCL病例，應用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、TUNEL技術和免疫組織化學方法檢測DLBCL中A20缺失、凋亡和Survivin等相關分子的變化，為完善DLBCL的發生、發展機制，以及發現其預后和治療評估的相關因子提供可靠的試驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集貴州醫科大學附屬醫院病理科2009年6月至2015年6月診斷的DLBCL手術切除后病例，按照2008年版淋巴造血組織WHO分類診斷標準，通過復習組織學和免疫組織化學染色方法，篩選出臨床病理資料相對完整的60例DLBCL患者進行研究，其中男36例，女24例，男女比1.5∶1.0；發病年齡1～83歲，中位年齡57歲，發病高峰年齡55～65歲；ABC-DLBCL 36例，GCB-DLBCL 24例；臨床分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期14例，Ⅲ期13例，Ⅳ期11例。另外，以同期的12例淋巴結反應性增生病例作為對照。本研究通過貴州醫科大學倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 FISH檢測 石蠟包埋腫瘤組織切片，FISH檢測A20探針購自北京金培佳試劑公司，試驗方法如下：石蠟組織切片厚3 μm，常規脫蠟至水，胃蛋白酶消化20 min，每張切片滴加5 μL探針，80 ℃水浴箱進行DNA變性20 min，37 ℃雜交24 h，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染。結果判讀：熒光顯微鏡下觀察，通過Image J合成彩色圖像，隨機計數100個清晰的細胞后，統計Ratio值，A20紅色信號數：6號染色體著絲粒(chromosome 6 centromre probe,CEP6)綠色信號數小于1.8者為缺失陽性結果。

1.2.2 免疫組織化學染色 石蠟包埋組織切片厚3 μm，脫蠟、水化、消除內源性過氧化物酶，采用乙二胺四乙酸(EDTA)pH 9.0高壓熱修復，EV二步法，3,3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色，Harris蘇木精復染，脫水，透明，封片。Survivin (福州邁新生物技術開發有限公司，1∶50)和Ki-67(美國Abcam公司，1∶100)為多克隆抗體，A20(美國Abcam公司，1∶300)、NF-κB(P65，美國Abcam公司，1∶100)均為單克隆抗體。陽性對照：A20蛋白為胎盤組織，P65蛋白為乳腺癌組織，Survivin蛋白為正常胃組織，用pH 7.0、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為空白對照。結果判讀：陽性信號Survivin蛋白位于細胞核或細胞質，A20蛋白位于細胞質，P65和Ki-67位于細胞核。每張切片隨機觀察10個高倍視野(×400)，計數陽性細胞百分比，取10個高倍視野的百分比均數為其陽性率。A20、P65、Survivin蛋白表達陽性率小于20%判為陰性，≥20%判為陽性。Ki-67蛋白表達分為低表達(<40%)和高表達(≥40%)兩個等級。

1.2.3 凋亡檢測 顯色法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，具體步驟按說明書進行：石蠟包埋組織切片3 μm厚，脫蠟水化，用不含脫氧核糖核酸酶(DNase)的蛋白酶K進行消化，3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶，依次滴加生物素標記dUTP、辣根過氧化物酶(HRP)標記鏈霉親和素工作液，37 ℃水浴箱孵育，DAB顯色，Harris蘇木精復染。結果判定：棕色陽性細胞占總細胞數的百分比，細胞凋亡可以劃分為低凋亡率(<2%)和高凋亡率(≥2%)兩個組。

1.3 隨訪 主要通過信訪和電話隨訪完成，以首次明確病理診斷為隨訪開始時間，2016年1月31日為隨訪結束時間。

1.4 統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行統計分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用四格表χ2檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析，生存分析采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，生存曲線的比較采用對數秩檢驗(Log-rank test)，影響生存的多因素分析采用COX回歸分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 A20基因的缺失檢測 60例DLBCL中A20 缺失陽性(圖1)13例，陽性率為21.7%，12例淋巴結反應性增生中未檢測出A20缺失。

圖1 DLBCL A20缺失突變(FISH，×1 000)

2.2 淋巴瘤中A20、P65、Survivin蛋白的表達 DLBCL和淋巴結反應性增生中均見A20、P65和Survivin蛋白表達(圖2)。淋巴結反應性增生患者中A20蛋白陽性表達率為83.3%(10/12)、P65蛋白為8.3%(1/12)，Survivin蛋白為16.7%(2/12)；DLBC組中A20蛋白陽性表達率為28.3%(17/60)，P65蛋白為58.3%(35/60)，Survivin蛋白為55.0%(33/60)。兩組間A20、P65、Survivin蛋白陽性表達率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 A20基因缺失與A20、P65、Survivin蛋白表達及患者臨床特征的關系 A20基因缺失發生率在ABC-DLBCL和GCB-DLBCL患者間(30.6%vs. 8.3%)、A20蛋白表達陽性與陰性患者間(5.9%vs. 30.2%)、P65蛋白表達陽性與陰性患者間(31.4%vs. 8.0%)、Survivin蛋白表達陽性與陰性患者間(33.3%vs. 7.4%)、Ki-67蛋白低表達與高表達患者間(5.3%vs. 29.3%)比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；而在不同性別及臨床分期患者間、復發與未復發患者間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。Pearson相關分析顯示：A20蛋白表達與A20基因缺失呈負相關(r=-0.259，P=0.023)，P65蛋白和Survivin蛋白表達與A20基因缺失呈正相關(r=0.280、0.313，P=0.015、0.007)，見表2。

A：A20蛋白表達；B：P65蛋白表達；C：Survivin蛋白表達

圖2 DLBCL中A20、p65和Survivin蛋白

表2 A20基因缺失與A20、P65、Survivin蛋白表達的相關關系(n=60)

2.4 腫瘤細胞凋亡檢測 DLBCL腫瘤細胞核中見棕黃色陽性信號(圖3)。細胞凋亡水平與A20基因缺失和A20蛋白表達的關系、與P65和Survivin蛋白表達的關系見表3。

圖3 DLBCL細胞凋亡水平檢測(TUNEL，×400)

特征n腫瘤細胞凋亡率≥2%<2%χ2PDLBCL類型0．0120．913 ABC?DLBCL361323 GBC?DLBCL24915A20基因缺失4．7210．030 是15213 否572532A20蛋白表達14．5610．000 陽性21156 陰性511239P65蛋白表達6．0000．014 陽性401030 陰性321715Survivin蛋白表達5．6380．018 陽性37928 陰性351817

2.5 隨訪 60例DLBCL中有隨訪結果者36例，獲訪率為60.0%，隨訪時間4～48個月，中位隨訪時間為33.1個月。隨訪結果顯示：存活26例，死亡10例(7例死于腫瘤，2例死于化療反應，1例死于其他疾病)；共11例復發；25例術后接受化療治療，其余病例治療方案不詳。A20基因缺失病例和未缺失病例生存曲線比較見圖4，A20基因缺失病例生存狀況明顯較未缺失病例差，差異有統計學意義(P=0.015)。COX回歸分析結果顯示：年齡、Ki67的表達、A20基因的缺失、DLBCL類型對DLBCL患者的生存時間有影響，見表4。

圖4 A20基因缺失病例與未缺失病例的生存曲線比較

變量βSEWaldχ2PRR年齡0．0570．0208．0510．0051．059Ki67-1．0400．4924．4700．0340．354A20基因缺失-1．9050．6598．3590．0040．140DLBCL類型-2．0620．6609．7640．0020．127

3 討 論

A20基因位于染色體6q23.3，其編碼的A20蛋白是一種新型的鋅指蛋白，具有去泛素化酶的功能[6]。目前，A20蛋白在腫瘤發生、發展中的作用報道較多，A20可通過抑制twist1表達而抑制肝細胞癌的生長和轉移[7]，它還是NF-κB的負調節因子，故被視為腫瘤抑制基因。A20可通過多種途徑機制抑制NF-κB的活化：它可抑制卡波西肉瘤相關皰疹病毒FLICE抑制蛋白(vFLIP)誘導的NF-κB活化[8]；A20的鋅指7與線性的多泛素鏈結合可以抑制LUBAC介導的NF-κB活化[9]；在腫瘤壞死因子(TNF)作用下或者TNF-R1應答過表達時，A20蛋白能夠與NF-κB抑制蛋白激酶γ亞基(IKKγ)相互作用，阻斷IKKγ將上游信號傳遞給IKKα和IKKβ亞基，從而阻止NF-κB的活化[10]。NF-κB信號傳導通路的持續活化是DLBCL的一個重要特性，它通過控制多種細胞因子和生存基因表達，對淋巴細胞的分化、凋亡、成熟、增生及先天免疫反應發揮重要作用。

A20基因異常在多種淋巴造血組織腫瘤都被發現[11-13]。這些異常對相應的淋巴瘤臨床過程、治療和預后產生不同程度的影響：伴有A20基因的缺失或突變的眼附屬器黏膜相關淋巴組織(MALT)型淋巴瘤放療需更大的劑量[14-15]。本課題組前期研究發現，在部分DLBCL中存在A20基因的甲基化和錯義突變，這些A20基因的異常在ABC-DLBCL中較GCB-DLBCL多見，而且伴有A20基因突變和甲基化的DLBCL患者具有較差的臨床過程和預后，A20甲基化者復發率高，A20突變者生存狀況較差[16-17]。本研究發現，在DLBCL中存在A20基因的缺失，缺失率為21.7%，ABC-DLBCL中A20基因缺失較GCB-DLBCL更多見。在復發的DLBCL病例中A20基因缺失更多見，生存狀況也較差，這與本課題組前期發現的A20錯義突變和甲基化對DLBCL的影響相似。

在淋巴瘤中有關A20基因的異常對其編碼蛋白表達的影響，以及與NF-κB下游分子表達的關系報道較少。本課題組既往研究發現，A20基因的小分子干擾RNA(siRNA)干擾DLBCL細胞OCI-LY1內的A20表達后，NF-κB的P65和P50表達明顯降低，細胞的生長和凋亡明顯受到抑制，多藥耐藥基因1(multi-drug resistance gene 1)及其編碼蛋白P-gp的表達都明顯上調[18]。Survivin蛋白是NF-κB的下游靶基因，有研究報道，Survivin在侵襲性和高侵襲性的非霍奇金淋巴瘤中都有高表達，其表達能預測相應淋巴瘤的臨床過程和預后[19]；Survivin表達產生的凋亡抑制作用還對多種腫瘤的化療耐藥和血管形成有重要影響，它作為生物靶向治療的靶標在多種惡性腫瘤中有體外實驗的研究報道[20]。經過Pearson相關分析發現，A20蛋白表達與A20基因缺失呈負相關(r=-0.259，P=0.023)，P65蛋白和Survivin蛋白表達與A20基因缺失呈正相關(r=0.280、0.313，P=0.015、0.007)，因此有理由推測淋巴瘤中Survivin蛋白表達異常可能與A20基因異常導致的NF-κB持續活化有關。本研究還發現，A20基因缺失的DLBCL患者A20蛋白表達降低，P65蛋白和Survivin蛋白表達都明顯增強，且腫瘤凋亡明顯抑制。結果表明：DLBCL中A20基因的缺失對A20蛋白表達可能有影響，A20表達的減少可能削弱了對NF-κB信號通路的負調控作用，使NF-κB下游靶基因Survivin的表達上調，從而影響腫瘤細胞的凋亡和增殖。

綜上所述，A20基因的缺失對DLBCL的臨床過程和預后有一定影響，可能是DLBCL不良預后的預測相關因子；DLBCL中Survivin表達上調可能是A20基因缺失導致A20表達下調的結果，Survivin的表達可能是淋巴瘤腫瘤細胞凋亡抑制和增殖活性增強重要的分子機制之一。

[1]Menon MP，Pittaluga S，Jaffe ES．The histological and biological spectrum of diffuse large B-cell lymphoma in the WHO classification[J]．Cancer J，2012，18(5)：411-420．

[2]Morton LM，Cerhan JR，Hartge P，et al．Immunostaining to identify molecular subtypes of diffuse large B-cell lymphoma in a population-based epidemiologic study in the pre-rituximab era[J]．Int J Mol Epidemiol Genet，2011，2(3)：245-252．

[3]Grégoire M，Guilloton F，Pangault C，et al．Neutrophils trigger a NF-κB dependent polarization of tumor-supportive stromal cells in germinal center B-cell lymphomas[J]．Oncotarget，2015，6(18)：16471-16487．

[4]Kaneko N，Kita A，Yamanaka K，et al．Combination of YM155,a survivin suppressant with a STAT3 inhibitor:a new strategy to treat diffuse large B-cell lymphoma[J]．Leuk Res，2013，37(9)：1156-1161．

[5]Leslie LA，Younes A．Targeting oncogenic and epigenetic survival pathways in lymphoma[J]．Leuk Lymphoma，2013，54(11)：2365-2376．

[6]Bosanac I，Wertz IE，Pan B，et al．Ubiquitin binding to A20 ZnF4 is required for modulation of NF-κB signaling[J]．Mol Cell，2010，40(4)：548-557．

[7]Chen HY，Hu L，Luo ZL，et al．A20 suppresses hepatocellular carcinoma proliferation and metastasis through inhibition of Twist1 expression[J]．Mol Cancer，2015，14：186.

[8]Sakakibara S，Espigol-Frigole G，Gasperini P，et al．A20/TNFAIP3 inhibits NF-κB activation induced by the Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus vFLIP oncoprotein[J]．Oncogene，2013，32(10)：1223-1232.

[9]Verhelst K，Carpentier I，Kreike M，et al．A20 inhibits LUBAC-mediated NF-κB activation by binding linear polyubiquitin chains via its Zinc finger 7[J]．EMBO J，2012，31(19)：3845-3855.

[10]Hymowitz SG，Wertz IE．A20:from ubiquitin editing to tumour suppression[J]．Nat Rev Cancer，2010，10(5)：332-341．

[11]Ando M，Sato Y，Takata K，et al．A20 (TNFAIP3) deletion in Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disorders/lymphomas[J]．PLoS One，2013，8(2)：e56741.

[12]Dong G，Chanudet E，Zeng N，et al．A20,ABIN-1/2,and CARD11 mutations and their prognostic value in gastrointestinal diffuse large B-cell lymphoma[J]．Clin Cancer Res，2011，17(6)：1440-1451.

[13]Nomoto J，Hiramoto N，Kato M，et al．Deletion of the TNFAIP3/A20 gene detected by FICTION analysis in classical Hodgkin lymphoma[J]．BMC Cancer，2012，12：457.

[14]Bi Y，Zeng N，Chanudet E，et al．A20 inactivation in ocular adnexal MALT lymphoma[J]．Haematologica，2012，97(6)：926-930．

[15]Troppan K，Hofer S，Wenzl K，et al．Frequent down regulation of the tumor suppressor gene A20 in multiple myeloma[J]．PLoS One，2015，10(4)：e0123922．

[16]李逸，陳琴，李品浩，等．A20基因甲基化對彌漫性大B細胞性淋巴瘤的影響[J]．診斷病理學雜志，2015，22(12)：772-775．

[17]庹櫻籃，陳琴，楊文秀．A20突變與彌漫大B細胞淋巴瘤臨床病理特征及預后的關系[J]．中國腫瘤臨床，2015，42(20)：1018-1024．

[18]王玲玲，楊文秀，李逸，等．TNFAIP3siRNA對彌漫大B細胞淋巴瘤OCI-LY1細胞NF-κB活性及增殖的影響[J]．臨床與實驗病理學雜志，2016，32(4)：405-408，412．

[19]Schlette EJ，Medeiros LJ，Goy A，et al．Survivin expression predicts poorer prognosis in anaplastic large-cell lymphoma[J]．J Clin Oncol，2004，22(9)：1682-1688.

[20]Huang J，Lyu H，Wang J，et al．MicroRNA regulation and therapeutic targeting of survivin in cancer[J]．Am J Cancer Res，2015，5(1)：20-31.

Impacts of A20 gene deletion on clinicopathological features and prognosis of diffuse large B cell lymphoma and relative molecular mechanism*

FengJianglong1，YangWenxiu2△，WangJiarui1，LiBo2

(1.DepartmentofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China；2.DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

Objective To detect the A20 gene deletion,investigate the impacts of A20 gene deletion on clinicopathological features and prognosis of DLBCL,and relationship between activation of NF-κB pathway and relative molecular pathogenesis.Methods A20 gene deletion was detected by fluorescence in situ hybridization (FISH).The expression of A20,Survivin,P65 and Ki-67 were detected by immunohistochemistry stain.Apoptosis was assayed by TUNEL.Follow-up and statistical analysis were done.Results The deletion rate of A20 gene was 21.7%.The deletion rate of A20 gene was obviously higher in ABC-like DLBCL than that in GCB-like DLBCL (30.6%vs. 8.3%,P<0.05).It was observed that there was a negative correlation between A20 protein expression and A20 gene deletion (r=-0.259,P=0.023).The expression of P65 and Survivin protein was positively correlated with the A20 gene deletion (r=0.280，P=0.015；r=0.313，P=0.007).Apoptosis rate was significantly reduced in DLBCL patients with A20 gene deletion.The apoptosis rate was higher in cases with positive expression of A20 protein,while that was lower in cases with positive expression of p65 and Survivin protein than those with negative expression of corresponding protein.There was no statistically significant difference in apoptosis rate between ABC-like and GCB-like DLBCL patients (P>0.05).COX regression analysis indicated that age,A20 gene deletion,types of DLBCL and Ki67 expression were independent factors associated with survival status.Log-rank test showed that there was a statistical difference in survival status between the cases with and without A20 gene deletion (P=0.015).Conclusion A20 gene deletion may associate with the attenuation of A20 protein expression.The latter weakens negative feedback regulation of A20 protein for NF-κB pathway.An up-regulated expression of Survivin and abnormal proliferation and apoptosis may be result from the abnormal activation of NF-κB.A20 gene deletion brings certain influence on clinical course and prognosis of DLBCL.

lymphoma；A20 gene；NF-κB；Survivin；prognosis；gene deletion

國家自然科學基金資助項目(NO.81160299)。 作者簡介：馮江龍(1991-)，在讀碩士，主要從事淋巴瘤發病機制方面的研究。△

，E-mail：ypq1964@163.com。

R361+.2

A

1671-8348(2017)19-2594-05

2017-02-18

2017-04-16)