腎缺血再灌注損傷大鼠肺內谷胱甘肽過氧化物酶1的表達變化

于國霞，霍宏昌，王素玲，王 切

(1.河北省石家莊市婦幼保健院藥劑科，河北 石家莊 050051；2.河北省血液中心檢驗科，河北 石家莊 050071；3. 河北醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室，河北 石家莊 050017)

·論 著·

腎缺血再灌注損傷大鼠肺內谷胱甘肽過氧化物酶1的表達變化

于國霞1，霍宏昌1，王素玲2，王 切3*

(1.河北省石家莊市婦幼保健院藥劑科，河北 石家莊 050051；2.河北省血液中心檢驗科，河北 石家莊 050071；3. 河北醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室，河北 石家莊 050017)

目的觀察谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPX-1)在腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury,RIRI)大鼠肺內的表達變化，探討GPX-1清除過氧化物保護肺臟免遭過氧化損傷的作用。方法切除Wistar大鼠右腎，無損傷動脈夾夾閉左腎動脈，建立大鼠RIRI模型。腎臟血液重新灌注24 h后取血、腎臟、肺臟。血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，SCr)濃度分別采用酶偶聯速率法和苦味酸法測定；HE染色法觀察大鼠腎形態結構改變；肺組織過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量分別采用鉬酸比色法和硫代巴比妥酸比色法測定，GPX-1的mRNA和蛋白表達水平分別采用RT-PCR和Western blotting法測定，并對GPX-1表達水平與MDA含量、H2O2含量作相關性分析。結果與對照組相比，RIRI組大鼠腎組織形態結構受損明顯，BUN和SCr含量、肺組織MDA含量和H2O2含量也明顯升高；RIRI組大鼠肺組織GPX-1 mRNA和蛋白表達水平也明顯增強，并與MDA含量、H2O2含量均呈正相關。結論RIRI使肺組織也處于氧化應激狀態并遭受過氧化損傷；GPX-1可能通過清除過氧化物，保護肺臟免遭過氧化損傷。

腎動脈；再灌注損傷；谷胱甘肽過氧化物酶1；大鼠

腎缺血再灌注損傷(renal ischaemia-reperfusion injury，RIRI)是保留腎單位手術、腎動脈阻斷術、腎臟移植等臨床治療過程中不可避免的結果，也是導致術后腎臟功能恢復延遲、甚至引發急性腎衰竭的主要原因[1-3]。已有研究表明，在缺血再灌注發生過程中，會有大量活性氧族(reactive oxygen species，ROS)產生，從而導致腎損傷。因此，氧化應激可能是導致RIRI的主要原因[4-6]。谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)是一類抗氧化酶家族，能將ROS成員還原為水和醇，從而保護生物膜和細胞成分，對抗氧化應激。GPX-1是GPX家族中含量最豐富的家族成員，主要存在于細胞質和線粒體中，且在肺臟廣泛表達，在保護肺臟對抗氧化應激中具有重要作用[7-9]。肺臟血供豐富，氧含量高，對缺氧反應極為敏感。本研究制造大鼠RIRI模型，觀察肺組織丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)含量、抗氧化酶GPX-1基因和蛋白表達水平變化，探討RIRI發生后肺組織內的氧化應激狀態及GPX-1的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 RIRI模型建立以及樣品處理 雄性Wistar大鼠12只，購于河北省實驗動物中心，體質量190～210 g，隨機分為RIRI組6只和對照組6只。6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5 mL/kg)，將大鼠固定于手術臺，自劍突向下做約4 cm長腹部正中切口，結扎大鼠右側腎蒂后切除其右側腎臟。RIRI組大鼠分離左側腎動脈并采用無創動脈夾于腎門處將其夾閉,阻斷其血液供應，肉眼可見左側腎臟由鮮紅色逐漸變為暗紅色，提示腎動脈夾閉成功。45 min 后棄去動脈夾, 重新恢復腎臟血液灌注,肉眼可見左側腎臟又迅速轉變為鮮紅色,提示重新灌注成功。對照組大鼠只分離左側腎動脈但并不夾閉阻斷血供。術后大鼠均單籠飼養、自由食水。恢復血液供應24 h后重新麻醉大鼠，收集血液，3 000 r/min離心10 min，分離血清，用于血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(serum creatinine,SCr)濃度檢測；取部分腎臟組織固定于4%多聚甲醛中，用于蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色法觀察腎臟形態學改變；取部分肺臟組織迅速置于液氮中，用于MDA含量、H2O2含量、GPX-1 mRNA及蛋白水平測定。

1.2 主要試劑 Trizol、dNTP、Taq DNA聚合酶為Invitrogen公司產品；反轉錄試劑盒為Promega公司產品；SCr和BUN檢測試劑盒為中生北控生物科技有限公司產品；MDA和H2O2檢測試劑盒為南京建成科技有限公司產品。GPX-1一抗(兔抗鼠)為Abcam公司產品，二抗(羊抗兔)為Zymed公司產品。

1.3 BUN、SCr含量檢測 大鼠SCr含量采用苦味酸法測定，BUN含量采用酶偶聯速率法測定，標本處理及檢測過程均按試劑盒操作說明進行。

1.4 腎臟形態學觀察 HE染色法觀察大鼠腎臟組織形態結構改變。按常規組織切片的操作步驟處理固定后的腎組織修塊：脫水、透明、浸蠟、包埋，切片厚約5 μm，HE染色后封片，光學顯微鏡下觀察腎組織形態結構改變并拍照。

1.5 肺組織勻漿內MDA含量測定 將預冷的勻漿緩沖液(1 mmol/L鹽酸苯甲脒，50 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH 7.4，0.5 mol/L 氯化鈉，0.1%吐溫20， 1 mmol/L PMSF，5 mmol/Lβ-巰基乙醇,1 mmol/L EDTANa3)加入冰凍肺組織內，冰浴下勻漿，將勻漿液4 000 r/min 4 ℃離心20 min，收集上清即制成10%肺組織勻漿，勻漿內MDA含量按照南京建成MDA測定試劑盒檢測步驟進行。

1.6 肺組織勻漿制備及H2O2含量檢測 將冰凍肺組織按照10 mg/100 μL比例加入預冷勻漿緩沖液(1 mmol/L鹽酸苯甲脒，50 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH 7.4，0.5 mol/L氯化鈉，0.1%吐溫20，1 mmol/L PMSF，5 mmol/Lβ-巰基乙醇，1 mmol/L EDTANa3)，冰浴下勻漿，將勻漿液4 000 r/min 4 ℃離心20min，收集上清即為10%肺組織勻漿。大鼠肺組織勻漿內H2O2含量采用鉬酸比色法檢測，以每克肺組織勻漿樣本蛋白所含過氧化氫的量(mmol/g pro)表示，整個檢測過程按試劑盒操作說明進行。

1.7 肺組織GPX-1 mRNA水平測定 TRIzol法裂解提取肺組織總RNA并反轉錄成cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內對照進行RT-PCR。以GPX-1擴增產物灰度值與GAPDH灰度值之比表示GPX-1 mRNA的相對表達量。

1.8 大鼠肺組織GPX-1蛋白水平檢測 Western blot法測定大鼠肺組織GPX-1蛋白相對表達水平。大鼠肺組織勻漿制備勻漿液, 離心取上清，煮沸法使蛋白變性，改良Lowry法進行蛋白總量測定。SDS-PAGE凝膠電泳蛋白上樣量為66 μg。半干轉膜、5%脫脂奶粉封閉后,在PVDF膜上加入GPX-1一抗，置于搖床振蕩過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標記IgG抗體。顯影、定影、晾干后，凝膠成像系統掃描膠片拍照并進行圖像分析，以GPX-1光密度值與內對照GAPDH光密度值之比表示GPX-1的蛋白相對表達量。

1.9 相關性分析 大鼠肺組織GPX-1 mRNA和蛋白表達水平與其肺組織MDA含量、H2O2含量的相關性采用Pearson相關分析。

1.10 統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件處理數據。計量資料比較采用t檢驗；相關性采用Pearson相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠腎組織形態結構改變 光學顯微鏡下可見：RIRI組大鼠腎小管管腔擴張明顯；腎小囊囊腔擴張；部分腎小球萎縮，體積變小；腎小管間隙擴大，腎間質水腫；集合管管腔擴張。正常組大鼠腎小囊、腎血管球、集合管、遠曲小管及近曲小管形態結構清晰規整。見圖1,2。

圖1 RIRI組腎小球、腎小管形態改變(HE ×400)

Figure 1 The morphological changes of glomeruli and tubules in RIRI group(HE ×400)

圖2 對照組腎小球、腎小管形態結構(HE ×400)

Figure 2 The morphological of glomeruli and tubules in control group(HE ×400)

2.2 2組SCr和BUN含量比較 RIRI組大鼠BUN和SCr含量均明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

組別BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)對照組 4.462±0.541103.444±8.465RIRI組13.685±4.397131.153±17.814t5.0933.459P0.0000.006

2.3 2組肺組織MDA和H2O2含量比較 RIRI組大鼠肺組織MDA 和H2O2含量均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

組別MDAH2O2對照組 7.63±1.6824.52±2.96RIRI組10.89±1.7437.36±4.36t3.2925.963P0.0080.000

2.4 2組肺組織GPX-1 mRNA和蛋白表達量比較 RIRI組大鼠肺組織GPX-1 mRNA和蛋白相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖3、4，見表3。

圖3 GPX-1的mRNA表達

Figure 3 The mRNA expression of GPX-1

圖4 GPX-1的蛋白表達

Figure 4 The protein expression of GPX-1

表3 2組GPX-1 mRNA和GPX-1 蛋白表達比較
Table3 Comparison of expression of GPX-1 mRNA and protein of GPX-1 between two groups

組別GPX-1mRNAGPX-1蛋白Con 0.55±0.060.45±0.07RIRI0.78±0.120.68±0.07t3.6664.786P0.0040.001

2.5 相關性分析 大鼠肺組織GPX-1 mRNA表達水平與MDA含量、H2O2含量呈正相關(P<0.05)；GPX-1蛋白表達水平與MDA含量、H2O2含量也呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 肺組織GPX-1 mRNA和蛋白表達水平與MDA、H2O2含量的相關性Table 4 The Correlation between GPX-1 mRNA, protein expression and MDA, H2O2 content in lung

3 討 論

腎臟是泌尿系統的重要器官，在維持電解質、水平衡，血流動力學以及機體內環境的平衡穩定中發揮著重要作用[10]。RIRI是腎臟手術治療過程中不可避免的病理生理反應，極大地增加了患者術后并發癥的發生率和病死率。因此，對RIRI發生機制和防治途徑的探討已經成為醫療界的一個研究焦點。實驗研究表明氧化應激可能是導致RIRI發生的主要機制之一[11]。肺臟富含血液和氧氣，對缺血缺氧反應極為敏感。本研究的目的為：觀察RIRI發生后腎臟處于高度氧化應激狀態時，肺組織是否也同樣處于氧化應激狀態并遭受過氧化損傷，抗氧化酶GPX-1的表達又如何改變。

對于RIRI的研究是通過動物模型來實現的。無損傷血管夾夾閉大鼠左腎動脈阻斷其血液供應，45 min 后棄去血管夾重新恢復血液灌注從而誘導大鼠RIRI模型。BUN和SCr是臨床上檢驗腎臟功能的常用指標。有研究顯示RIRI可以導致含氮代謝產物在血漿內的積累，如BUN和SCr。本研究結果與其一致。本研究HE染色結果顯示RIRI組大鼠的腎小球和腎小管形態結構均明顯受損。表明本研究RIRI模型是成功的，RIRI組大鼠腎臟的形態結構和功能均嚴重損傷。

ROS是一類高活性分子家族，它們可由肺內的多種細胞類型針對來自于環境內的物理和化學劑刺激因子而產生。ROS在肺臟大量產生或因ROS清除機制受損導致其過度積累時，會引發氧化應激損傷。ROS成員主要包括超氧陰離子、H2O2和羥自由基等。這些代謝活躍分子能與細胞內和細胞膜上的重要結構蛋白、功能蛋白以及核酸DNA等物質發生過氧化反應，導致蛋白質和核酸變性、細胞膜結構損傷、線粒體功能障礙，甚至細胞死亡[12]。其中H2O2是ROS成員中含量最豐富代謝最穩定的形式。因此，H2O2被認為是引發組織細胞氧化應激損傷的一個主要因素，除去多余的H2O2對防止組織損傷至關重要[13-14]。本研究結果顯示RIRI組大鼠肺組織內H2O2含量明顯高于對照組。說明在RIRI發生時，不僅腎臟會處于氧化應激狀態，肺組織內也同時會出現大量ROS，處于高度氧化應激狀態。此外，MDA 是細胞膜和細胞內的脂類物質與ROS發生過氧化反應所形成的終末代謝產物之一, 其含量的高低能直接反映脂類物質與ROS發生過氧化反應的速度和強度。因此，MDA常被作為評價組織細胞發生過氧化損傷程度的標志物之一[15-16]。本研究結果顯示RIRI組大鼠肺組織內不僅H2O2含量明顯升高，MDA含量也明顯高于對照組。表明在RIRI發生時，肺組織不僅處于高度氧化應激狀態并已遭受嚴重過氧化損傷。

機體內存在氧化還原反應系統與抗氧化系統。當機體處于正常狀態時，氧化還原反應系統與抗氧化系統處于平衡狀態。當這種平衡狀態被打破時，就會導致ROS在體內的大量積聚，并誘發氧化應激反應的發生。細胞內具有發達的酶防御系統來對抗ROS的過度產生，包括GPX。GPX是一類抗氧化酶家族，能催化具有破壞性的H2O2以及大量氫過氧化物(如DNA過氧化物和脂質過氧化物)還原為水和醇，從而保護生物膜和細胞成分對抗氧化應激反應。通過對GPX硒蛋白組的分析發現，哺乳動物共有6個家族成員。胞內硒依賴性GPX-1是GPX家族的主要成員，且在機體內表達廣泛，尤其在肺部的肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞等廣泛表達[7-9]。提示GPX-1可能在肺臟發揮重要的抗氧化作用。本研究結果顯示，RIRI發生時大鼠肺組織GPX-1 mRNA和蛋白表達水平與對照組相比均明顯升高，并且GPX-1 mRNA和蛋白表達水平與MDA、H2O2含量均呈正相關。推測RIRI發生時，肺組織內由于有大量ROS產生并與脂類物質發生過氧化反應，從而引發過氧化損傷的發生。為清除積累過多的ROS并維持機體處于氧化還原平衡狀態，機體反饋性地上調抗氧化酶GPX-1的表達以清除機體內過多的ROS，從而保護肺組織免遭氧化應激損傷。

總之，RIRI可使肺臟組織也處于氧化應激狀態，并遭受過氧化損傷；抗氧化酶GPX-1可能在清除ROS保護肺組織免遭進一步過氧化損傷中發揮了重要作用。本研究為尋求RIRI所誘發的肺組織損傷防治途徑提供了一條新思路。

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(本文編輯：許卓文)

Expression change of GPX-1 in lung of renal ischemia reperfusion injury rats

YU Guo-xia1, HUO Hong-chang1, WANG Su-ling2, WANG Qie3*

(1.DepartmentofPharmacy,MaternalandChildHealthCareHospitalofShijiazhuang050051,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,HebeiBloodCenter,HebeiProvince,Shijiazhuang050071,China； 3.DepartmentofAnatomy,theSchoolofBasicMedicalSciences,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To observe the expression change of glutathione peroxidase1(GPX-1) in lung of renal ischemia reperfusion injury(RIRI) model and to explore the role of GPX-1 in protecting lung against peroxide damage by scavenging peroxide. Methods The left renal artery of Wistar rats was clipped with non-damage vascular clamp after removing the right kidney to create RIRI model. After 24 hours of renal blood perfusion, the blood, kidney and lung were collected. The serum blood urea nitrogen(BUN) and serum creatinine(SCr) were detected with picric acid method and enzyme coupling rate method, respectively. The morphological changes of kidney was observed with HE staining, the malondialdehyde(MDA)and hydrogen peroxide(H2O2) content in lung tissue were determined by thiobarbituric acid colorimetric method and molybdate colorimetric method, respectively. The GPX-1 mRNA and protein expression were evaluated by RT-PCR and Western blotting, respectively. The correlation between MDA content, H2O2content and GPX-1 expression level was analyzed. Results Compared with the control group, the morphological structure of lung tissue of RIRI model was significantly damaged, the BUN and SCr level, the MDA and H2O2content in lung tissue of RIRI were significantly increased, mRNA and protein level of GPX-1 were also significantly enhanced. There were positive correlation between MDA and GPX-1 mRNA, between MDA and GPX-1 pretein, between H2O2and GPX-1 mRNA, between H2O2and GPX-1 pretein. Conclusion The RIRI can make lung tissue to be in oxidative stress and be subjected to peroxidative damage. GPX-1 may protect lung against peroxide damage by scavenging superoxide.

renal artery; reperfusion injury; glutathione peroxidase 1; rats

2017-02-17；

2017-03-01

河北省醫學科學研究重點課題(20160088)

于國霞(1977-),女,河北石家莊人,河北省石家莊市婦幼保健院主管中藥師，醫學學士，從事臨床藥學研究。

*通訊作者。E-mail:wangqie1012@163.com

R322.121；R619.9

A

1007-3205(2017)08-0873-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.08.002