基于聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜的石墨烯/金納米粒子/葡萄糖氧化酶柔性電極的制備及檢測葡萄糖

徐杰+孫文+賀路影+張芹+蘇文金

摘 要 采用化學(xué)氣相沉積法生長多晶石墨烯（Graphene， G），轉(zhuǎn)移至聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜表面，通過控制金溶膠蒸發(fā)速率，在多晶石墨烯表面組裝均勻分布的亞單層金納米粒子（AuNPs）；然后修飾巰基乙酸，通過共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)將葡萄糖氧化酶固定于AuNPs表面，構(gòu)建基于PET膜的石墨烯/金納米粒子/葡萄糖氧化酶（G/AuNPs/GOD）柔性電極。此電極在工作電位0.6 V（vs.SCE電極）、pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液、室溫25℃條件下，差分脈沖伏安法響應(yīng)電流與被測葡萄糖濃度在0.05～10.55 mmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為I（108A）=0.2629 C（mmol/L）+1.4149，線性相關(guān)系數(shù) r=0.9955，檢出限1 μmol/L （3σ）。 G/AuNPs/GOD柔性電極的制備可為特定環(huán)境和可穿戴設(shè)備的葡萄糖檢測提供了新的途徑和方法，拓展了葡萄糖檢測的應(yīng)用范圍。

關(guān)鍵詞 葡萄糖； 柔性電極； 葡萄糖氧化酶； 石墨烯； 金納米粒子

1 引 言

葡萄糖的檢測在醫(yī)學(xué)、工業(yè)生產(chǎn)、食品、環(huán)境等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用 [1]。其中，基于葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase， GOD）的電化學(xué)檢測方法是應(yīng)用最廣泛的方法之一，例如長期使用的生化分析儀或植入式的血糖傳感器等設(shè)備均采用了此方法。葡萄糖氧化酶電極主要利用酶對底物的專一選擇性和催化反應(yīng)的高效性，可在復(fù)雜樣品（如血液）中直接、高靈敏地檢測葡萄糖的催化氧化產(chǎn)物，而不易受其它成分干擾；同時(shí)具有較高的穩(wěn)定性，可多次或長期使用。與所有的生物酶電極類似，葡萄糖氧化酶電極制備的關(guān)鍵是如何將酶長期穩(wěn)定固定在電極表面，保持酶的活性。目前已經(jīng)發(fā)展了許多酶的固定方法，如電化學(xué)法[2，3]、層層自組裝法[4]，共價(jià)交聯(lián)法[5]、溶膠-凝膠法[6～8]等。新的納米材料的出現(xiàn)，如金納米粒子[9]、碳納米管[10]、石墨烯[11～13]、石墨烯/金納米粒子復(fù)合物[14～16]等，不但具有高的比表面以固定更多的酶，還可以增強(qiáng)電子傳遞的能力。在已報(bào)道的石墨烯相關(guān)研究中，主要使用其微納米顆粒或懸浮液形式進(jìn)行加工，如Hui等[11]將石墨烯粉末懸浮液滴涂在金盤電極上，滴加葡萄糖氧化酶和Nafion溶液成膜，制備葡萄糖檢測電極；Wang等[14]在玻碳電極上滴加石墨烯懸浮液，干燥后再浸入氯金酸溶液，利用電化學(xué)法共合成石墨烯/金納米粒子復(fù)合物，再滴加葡萄糖氧化酶形成葡萄糖檢測電極。這些研究充分利用了石墨烯納米結(jié)構(gòu)（片或卷）大的比表面積和良好的電子傳遞能力，顯著改善了葡萄糖酶電極的性能。但石墨烯作為可大面積制備的二維納米材料，在柔性電極和可穿戴裝備方面的應(yīng)用仍較少。

本研究將化學(xué)氣相沉積法生長于銅箔上的多晶石墨烯轉(zhuǎn)移至聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜表面，通過控制金溶膠蒸發(fā)速率，在多晶石墨烯表面組裝均勻分布的亞單層金納米粒子，修飾巰基乙酸，然后將葡萄糖氧化酶共價(jià)固定于金粒子表面，構(gòu)建了基于PET薄膜的石墨烯/金納米粒子/葡萄糖氧化酶G/AuNPs/GOD柔性電極，利用電鏡、傅立葉變換紅外（FTIR）光譜、電子能譜對電極進(jìn)行表征，考察了柔性電極對葡萄糖檢測的線性范圍、檢出限、穩(wěn)定性、重復(fù)性、選擇性等性能。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；CHI 760 D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；Rigaku Ultima IV型 X-射線衍射儀（日本理學(xué)公司）；NicoletAvatar 330傅里葉變換紅外光譜儀 （美國熱電公司）；Mill-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

葡萄糖氧化酶（GOD， 100～250 U/mg，廈門慧嘉生物科技有限公司）；氯金酸（HAuCl4·4H2O）、H2O2（30%）；、檸檬酸鈉（C6H5Na3O7·2H2O）；Na2HPO4、NaH2PO4（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（>18.2 MΩ·cm）。

2.2 G/AuNPs電極的制備

多晶石墨烯/PET薄膜電極由廈門大學(xué)物理系蔡偉偉課題組提供，制備方法為在銅箔上采用化學(xué)氣相沉積法生長石墨烯，然后通過PMMA轉(zhuǎn)移至PET薄膜表面制備[17]。

Au納米粒子（AuNPs）按照文獻(xiàn)[8]方法用檸檬酸還原氯金酸制備合成：在沸騰條件下，向200 mL 0.01% （m/V） HAuCl4溶液中快速加入1.4 mL 1% （m/V）檸檬酸三鈉，反應(yīng)30 min，得到55 nm AuNPs。取100 mL AuNPs原液， 6000 r/min離心，移去上層清液，得到2 mL濃縮液。再加5 mL超純水離心清洗兩次，移去上層清液，制得2 mL備用AuNPs濃縮液。取20 μL滴加到5 mm × 10 mm的石墨烯基電極的一側(cè)，將其置于加蓋的培養(yǎng)皿中蒸發(fā)直至完全干燥，AuNPs形成0.3 cm半徑的圓形圖案，即制得面積為0.28 cm2的G/AuNPs電極。

2.3 G/AuNPs/GOD電極的制備

將G/AuNPs電極置于含1%（V/V） 巰基乙酸（TGA）溶液中浸泡12 h，用超純水淋洗后將G/AuNPs-TGA電極浸入含0.01 mol/L 4-二甲氨基吡啶（DMAP）的碳二亞胺（EDC，0.05 mol/L）與N-羥基丁二酰亞胺（NHS，0.05 mol/L）[19，20]混合溶液中浸泡1 h，取出后用超純水淋洗，再將其放入10 mg/mL GOD溶液中浸泡2 h，用pH 7.0 的PBS溶液淋洗，即制得G/AuNPs/GOD電極（圖1）。于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 葡萄糖濃度檢測

采用三電極體系，以制備的G/AuNPs/GOD電極為工作電極， 飽和甘汞電極為參比電極，鉑片電極為對電極進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在室溫條件下，于20 mL 0.1 mol/L pH 7.0 的PBS中在0～1.2 V電壓下進(jìn)行循環(huán)伏安測試、控制電位為0.6 V條件下進(jìn)行計(jì)時(shí)電流測試， 控制掃速50 mV/s， 在0～1.1 V電壓范圍單向掃描進(jìn)行示差脈沖伏安測試，分別記錄G/AuNPs/GOD電極對葡萄糖的電流響應(yīng)。

3 結(jié)果與討論

3.1 G/AuNPs/GOD電極的表征

從電鏡結(jié)果（圖2）可見，在室溫條件下，于加蓋的表面皿中蒸發(fā)干燥的方法可制備得到較大面積、分布比較規(guī)整均一的AuNPs亞單層結(jié)構(gòu)。溶液在固體表面蒸干后，會形成明顯邊緣堆積而中央稀薄的現(xiàn)象，即咖啡環(huán)效應(yīng)。通過控制固體表面的親疏水性和蒸發(fā)速度，可顯著抑制咖啡環(huán)效應(yīng)，獲得較均勻的沉積效果。由于石墨烯表面富含苯環(huán)結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的疏水性，本研究使用加蓋的蒸發(fā)皿，使其蒸發(fā)速率較慢，因而顯著減輕了咖啡環(huán)效應(yīng)，獲得較均勻的亞單層結(jié)構(gòu)。

采用傅立葉變換紅外（FTIR） 光譜對電極修飾過程進(jìn)行表征。圖3是 AuNPs上修飾巰基乙酸的 FTIR 光譜，在 637 cm1處有一微弱的振動峰，歸屬于CS鍵的對稱振動，說明巰基乙酸在金納米粒子表面成功修飾。圖3c是AuNPs-TGA電極偶聯(lián)GOD后的 FTIR 光譜曲線[21]，與修飾前相比，637 cm1處的小峰消失， 而1644 cm1處出現(xiàn)一個(gè)新峰，主要?dú)w屬為GOD上CO的伸縮振動，而1095 cm1峰更加明顯，其歸屬于CO單鍵的伸縮振動，這表明葡萄糖氧化酶通過酰胺鍵偶聯(lián)到金納米粒子表面。

通過X射線能譜（EDS）對制備的各個(gè)電極進(jìn)行了表面元素分析，結(jié)果見表1，石墨烯表面分布均勻的金納米粒子主要含有C、O和Au 3種元素；當(dāng)金納米粒子修飾電極浸入到巰基乙酸溶液中反應(yīng)一段時(shí)間后，其表面新增加了S元素，表明巰基乙酸通過AuS鍵修飾到AuNPs表面；偶聯(lián)葡萄糖氧化酶后，電極表面新增加了N元素，其來源只可能是葡萄糖氧化酶，說明葡萄糖氧化酶修飾到柔性電極表面。金納米粒子與PET基底上的石墨烯表面之間主要是較強(qiáng)的物理吸附作用，制備完成后， 即使長時(shí)間浸泡在緩沖溶液中，石墨烯表面的金納米粒子也不會脫落。

3.2 G/AuNPs/GOD電極的電化學(xué)性能

采用循環(huán)伏安法表征了G/AuNPs電極、G/AuNPs/TGA電極及G/AuNPs/GOD 3種電極的電化學(xué)性能（圖4）。這3種電極施加相同電壓時(shí)，響應(yīng)電流依次減小，而氧化還原電勢差依次增大，表明在制備過程中，TGA和酶的修飾使電極表面導(dǎo)電性下降，電子交換速率變慢，電極表面電化學(xué)反應(yīng)的不可逆性增加。這些電極在0.9和0.4 V出現(xiàn)氧化還原峰，是金納米粒子吸附O或者OH而產(chǎn)生的氧化還原吸附峰[22]。

圖5A是G/AuNPs/GOD電極對不同濃度的葡萄糖溶液的循環(huán)伏安圖。隨溶液中葡萄糖濃度增加，氧化峰電流增大，電流強(qiáng)度與葡萄糖濃度成正相關(guān)。由于葡萄糖不具有電化學(xué)活性，電流的增加與酶催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和過氧化氫相關(guān)。酶反應(yīng)過程與通常的氧化酶類似，如式（1）與式（2）所示。

FAD以黃素腺嘌呤二核苷酸輔基氧化酶的形式存在。式（3）是電化學(xué)反應(yīng)步驟，主要由葡萄糖過氧化酶中輔酶與葡萄糖反應(yīng)生成過氧化氫失去電子發(fā)生氧化而產(chǎn)生電流[23]。

掃描速度在 5～200 mV/s范圍內(nèi)變化時(shí)，隨著掃速增加，氧化還原電流逐步增大（圖5B），峰電流與掃速的平方根成正比（圖5B內(nèi)插圖），說明此電極對葡萄糖的電化學(xué)氧化還原過程受擴(kuò)散控制。

3.3 G/AuNPs/GOD柔性電極葡萄糖檢測

圖6A是不同濃度葡萄糖溶液的差分脈沖伏安（DPV）曲線。葡萄糖濃度較低時(shí)，濃度增加引起響應(yīng)電流變化較大；葡萄糖濃度較大時(shí)，由于受溶液氧分壓的限制，其濃度的增加引起的電流增量很小。從葡萄糖溶液的計(jì)時(shí)電流曲線（圖6B）可見，最大響應(yīng)時(shí)間小于10 s，說明此電極對葡萄糖有快速靈敏的響應(yīng)。定量曲線如圖6B插圖所示，響應(yīng)電流值隨葡萄糖濃度升高而增大， 在0.05～10.55 mmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為I （108A） =0.2629C （mmol/L）+1.4149， 檢出限為 1 μmol/L（3σ），低于文獻(xiàn)[11，14]報(bào)道的采用粉末石墨烯懸浮液在玻碳電極和金電極上制備的GOD電極（表2）。

考察了G/AuNPs/GOD電極對葡萄糖響應(yīng)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，對G/AuNPs/GOD電極進(jìn)行了100次循環(huán)掃描結(jié)果表明，隨著循環(huán)次數(shù)的增加， 電流先降低， 隨后趨于穩(wěn)定，第100次測試得到電流為首次測試電流的65%。電流的衰減可能與循環(huán)過程中產(chǎn)生的過氧化氫使酶活性部分喪失有關(guān)[27]。采用相同方法制備10支G/AuNPs/GOD電極測定0.2 mmol/L葡萄糖溶液，10電極電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 4.7% （n=10），表明此方法制備的葡萄糖生物傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

G/AuNPs/GOD柔性電極在 4℃ 下 pH 6.5 的緩沖溶液中放置20 天后進(jìn)行測試，對 0.1 mmol/L葡萄糖溶液的響應(yīng)仍保持初始響應(yīng)的78%。

為了考察G/AuNPs/GOD電極的對葡萄糖測定的選擇性，測定食品中其它糖類存在時(shí)葡萄糖的響應(yīng)（圖7）。結(jié)果表明，制備的酶電極僅對葡萄糖有明顯的電流響應(yīng)，而對同等濃度的果糖、核糖和半乳糖幾乎均無響應(yīng)，說明此電極對葡萄糖的檢測具有較好的專一性。

4 結(jié) 論

通過在PET薄膜轉(zhuǎn)移的多晶石墨烯表面組裝AuNPs和GOD，構(gòu)建了G/AuNPs/GOD柔性電極。在工作電位0.6 V （vs.SCE）、pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液、室溫25℃條件下，構(gòu)建的生物傳感器具有寬的線性范圍， 檢出限為1 μmol/L。此柔性電極的制備可為特定環(huán)境和可穿戴設(shè)備的葡萄糖檢測提供新的途徑和方法。

References

1 Clark L C， Lyons C. Ann. NY Acad. Sci.， 1962， 102（1）： 29-32

2 Liu X， Neoh K G， Cen L. Biosens. Bioelectron.， 2004， 19（8）： 823-834

3 Turkmen E， Bas S Z， Gulce H， Yildiz S. Electrochim. Acta， 2014， 123： 93-102

4 Salimi A， Noorbakhsh A. Electrochim. Acta， 2011， 56： 6097-6105

5 Unnikrishnan B， Palanisamy S， Chen S M. Biosens. Bioelectron.， 2013， 39： 70-75

6 Chen X J， Zhu J W， Tian R， Yao C. Sens. Actuators B， 2012， 163（1）： 272-280

7 Qu F L， Sun H Y， Zhang Y， Lu H M， Yang M H. Sens. Actuators B， 2012， 166： 837-841

8 Huang H M， Huang P K， Kuo W H. J. Sol-Gel Sci. Technol.， 2013， 67： 492-500

9 Wang H H， Ohnukia H， Endo H， Izumi M. Sens. Actuators B， 2012， 168： 249-255

10 Fu G L， Yue X L， Dai Z F. Biosens. Bioelectron.， 2011， 26： 3973-3976

11 Hui J N， Cui J W， Xu G Q， Adeloju S B， Wu Y C. Mater. Lett.， 2013， 108： 88-91

12 Al-Sagur H， Komathi S. Biosensor. Bioelectron.， 2017， 92： 638-645

13 Li S， Zhang Q， Lu Y L， Chen X， Liu Q. Sens. Actuators B： Chem.， 2017， 244： 290-298

14 Wang X L， Zhang X L. Electrochim. Acta， 2013， 112： 774-782

15 Shumba M， Nyokong T. Electrochim. Acta， 2017， 236： 212-220

16 Mashayekhi M F， Mandi A， Ahmad M. Process Biochemistry， 2017， 56： 71-80

17 Li X S， Cai W W， An J， Kim S， Nah J， Yang D X， Piner R， Velamakanni A， Jung I， Tutuc E， Banerjee S K， Colombo L， Ruoff R S. Science， 2009， 324： 1312-1314

18 Frens G. Nat. Phys. Sci.， 1973， 241： 20-22

19 Liu Y， Yu D， Zeng C， Miao Z C， Dai L M. Langmuir， 2010， 26（9）： 6158-6160

20 Claussen J C， Wickner M M， Fisher T S， Porterfield D M. ACS Appl. Mater. Inter.， 2011， 3： 1765-1770

21 Unnikrishnan B， Palanisamy S， Chen S M. Biosensor. Bioelectron.， 2013， 39： 70-75

22 Conway B E. Prog. Surf. Sci.， 1995， 49（4）： 331-452

23 Dixon B M， Lowry J P， ONeill R D. J. Neurosci. Meth.， 2002， 119（2）： 135-142

24 Jiang X Y， Wu Y H， Mao X Y， Cui X J， Zhu L D. Sens. Actuators B， 2011， 153（1）： 158-163

25 Yang L Q， Ren X L， Tang F Q， Zhang L. Biosens. Bioelectron.， 2009， 25（4）： 889-895

26 Kang X H， Wang J， Wu H， Aksay I A， Liu J， Lin Y H. Biosens. Bioelectron.， 2009， 25（4） 901-905

27 Uang Y M， Chou T C. Biosens. Bioelectron.， 2003， 19（3）： 141-147