固相萃取—液相色譜—飛行時間質(zhì)譜法快速篩查與確證谷物和果蔬中25種殺菌劑殘留

崔春艷+張紅醫(yī)+吳興強(qiáng)+范春林+龐國芳

摘 要 利用固相萃取-液相色譜-飛行時間質(zhì)譜（SPE-LC-Q-TOF/MS）技術(shù)建立了谷物、 蔬菜和水果中25種殺菌劑農(nóng)藥殘留的快速篩查和確證檢測方法。樣品經(jīng)1%（V/V）乙酸-乙腈溶液提取，經(jīng)Crabon/NH2柱凈化，乙腈-甲苯（3∶1， V/V）洗脫，C18色譜柱分離，乙腈和0.1% 甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸銨）梯度洗脫，采用LC-Q-TOF/MS檢測，外標(biāo)法定量。建立了25種殺菌劑的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級譜圖庫，通過化合物的精確質(zhì)量數(shù)、 保留時間、 同位素峰分布、 同位素比例等信息對檢測結(jié)果進(jìn)行自動檢索，在無對照標(biāo)準(zhǔn)品的情況下實現(xiàn)了25種農(nóng)藥的定性鑒定。結(jié)果表明，25種殺菌劑在0.02～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.9950， 加標(biāo)回收率在71.8%～114.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.1%～21.3% （n=3）。25種殺菌劑檢出限為0.01～5.00 μg/kg，定量限為0.02～20.00 μg/kg。本方法簡便、 快速、 可靠，可用于谷物、 蔬菜、 水果中25種殺菌劑的快速篩查。

關(guān)鍵詞 殺菌劑； 固相萃取； 谷物； 果蔬； 液相色譜-飛行時間質(zhì)譜

1 引 言

殺菌劑廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，其銷量占全球農(nóng)藥交易量的26%，銷售額高達(dá)133億美元[1]。殺菌劑的非正確使用會對食品安全、 生命健康和環(huán)境構(gòu)成威脅，為此我國頒布了GB 2763-2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》，并于2017年6月執(zhí)行。殺菌劑檢測方法主要有氣相色譜法（GC）[2]、 液相色譜法（LC）[3]、 氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[4，5]、 液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）[6]、 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）[7]、 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[8～10]等。液相色譜法因不必過分關(guān)注分析物的沸點而比氣相色譜法應(yīng)用更廣； 基于低分辨率質(zhì)譜的LC-MS 和LC-MS/MS法常因分辨率低而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。基于高分辨質(zhì)譜的液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法（LC-Q-TOF/MS）[11，12]，既可以獲得化合物的分子離子信息，又可以在碰撞碎裂后獲得豐富的碎片離子信息，可有20個定性點[13]，其高通量快速篩查和確證能力強(qiáng)，在殺菌劑殘留檢測方面具有較好的應(yīng)用前景。谷物和果蔬中農(nóng)藥殘留檢測前通常要經(jīng)過凈化和除雜的前處理步驟，主要方法有固相萃取（SPE）[12，14]、 固相微萃取（SPME）[15]、 分散固相萃取（DSPE）[16，17]、 分散液-液微萃取（DLLME）[2，18，19]及QuEChERS[6，7，10，20，21]等。微萃取方法難以直接應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)樣品，QuEChERS方法的處理結(jié)果也常在回收率和抗干擾等方面弱于固相萃取方法。

甲氧基丙烯酸酯類與琥珀酸脫氫酶抑制劑是兩類常用的殺菌劑， 本研究建立了快速篩查谷物和果蔬中這兩類殺菌劑中的25種殺菌劑殘留的SPE-LC-Q-TOF/MS法，本方法簡便、 快速、 定性準(zhǔn)確，可用于實際樣品中殺菌劑的快速篩查。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1290-6550液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），配有Dual AJS ESI 源； KDC-40低速離心機(jī)（中國中佳公司）； SR-2DS水平振蕩器（日本TAITEC公司）； MX-S渦旋攪拌器（美國Scilogex公司）； N-EVAP 112氮吹濃縮儀（美國Organomation Associates 公司）； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）。

25種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品： 純度≥95%（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）； 乙腈、 丙酮和乙酸乙酯均為色譜純（Honeywell）； 氯化鈉、 無水Na2SO4和無水MgSO4 （北京化工廠）； 甲酸和乙酸銨 （賽默飛世爾科技中國有限公司）； Crabon/NH2固相萃取柱（美國Waters公司）； Cleanert C18和Cleanert PC/PSA固相萃取柱（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配

各單標(biāo)準(zhǔn)儲備液為1.0 mg/mL的甲醇溶液（嘧菌酯為二氯甲烷溶液）。標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10 μg/mL的25種目標(biāo)殺菌劑的混合溶液。

2.3 樣品預(yù)處理

2.3.1 樣品的制備 大米、 燕麥樣品通過攪拌機(jī)粉碎，裝入塑料小瓶，密封，標(biāo)記，置于干燥處。蘋果、 葡萄、 黃瓜和番茄樣品通過攪拌機(jī)打碎，裝入塑料小瓶，密封，標(biāo)記，置于20℃條件下儲存（使用前先解凍至室溫）。

2.3.2 樣品提取 稱取10 g（精確至0.01 g）果蔬試樣，置入50 mL離心管中（谷物試樣稱取5 g（精確至0.01 g），置入50 mL離心管中，加入10 mL超純水，靜置30 min），加入20 mL 1%（V/V）乙酸的乙腈提取，渦旋1 min，加入1 g NaCl，4 g無水MgSO4，搖勻后振蕩6 min，以4200 r/min離心5 min，取10 mL上清液至150 mL雞心瓶，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2 mL。

2.3.3 樣品凈化 Crabon/NH2柱中填入約2 cm高的無水Na2SO4，用4 mL淋洗液乙腈-甲苯（3∶1，V/V）進(jìn)行活化。過柱子，下接80 mL雞心瓶待用，將濃縮液移至柱中，并使用2 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）溶液洗滌雞心瓶3次，待液面距離Na2SO4約0.4 cm時，在柱上加20 mL貯液器，加入20 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）洗脫，待所有液體收集完畢之后，取出雞心瓶。40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至0.5 mL，氮吹至干，用1 mL乙腈-0.1%甲酸溶液（2∶8，V/V）復(fù)溶，超聲溶解，過0.22 μm濾膜，供LC-Q-TOF/MS分析。

2.4 農(nóng)藥化合物的篩查與確證

2.4.1 TOF/MS數(shù)據(jù)庫的建立 實驗選擇25種農(nóng)藥，配制成濃度為1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在確定的色譜與質(zhì)譜條件下對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，在儀器的定性軟件Find by formula功能中輸入目標(biāo)化合物的分子式對數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索。記錄25種農(nóng)藥的保留時間、 精確分子量、 母離子以及離子化形式（+H，+NH4，+Na），母離子精確分子質(zhì)量的采集標(biāo)準(zhǔn)為小于10 ppm。將化合物名稱，分子式，保留時間，精確分子量輸入CSV格式的文件中，作為TOF/MS數(shù)據(jù)庫，此庫用于初步篩查。

2.4.2 Q-TOF/MS數(shù)據(jù)庫的建立 在建立TOF/MS數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，采集Q-TOF/MS數(shù)據(jù)庫信息，在Q-TOF Targeted MS/MS采集界面輸入農(nóng)藥的母離子、 保留時間以及8個不同的碰撞能量，并設(shè)置碎片離子掃描范圍（50～母離子質(zhì)核比+10），進(jìn)行碎片離子數(shù)據(jù)采集。在Targeted MS/MS功能中提取目標(biāo)化合物不同碰撞能量下的碎片信息，選取碎片離子信息較豐富的4個碰撞能量下的質(zhì)譜圖導(dǎo)出為CEF格式的文件，然后將譜圖導(dǎo)入PCDL軟件中，與對應(yīng)的農(nóng)藥信息相關(guān)聯(lián)，從而建立了Q-TOF/MS數(shù)據(jù)庫。25種型殺菌劑的分子式、 保留時間、 精確質(zhì)量數(shù)、 母離子及碰撞能等信息見表1。

2.4.3 實際樣品篩查與確證 在確定的色譜與質(zhì)譜條件下對實際樣品進(jìn)行測定，采集數(shù)據(jù)在TOF/MS數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，給出初步篩查結(jié)果，篩查結(jié)果以得分作為依據(jù)，得分權(quán)重分別為精確分子量占100、 同位素峰分布占50和同位素比例占50。實測值與理論值進(jìn)行比較，最終給出得分，TOF得分值≥60時，確定該化合物為目標(biāo)化合物。依據(jù)初步篩查結(jié)果建立目標(biāo)化合物的二級方法，二級方法即為在Targeted MS/MS采集模式下輸入化合物母離子、 保留時間、 碰撞能量等信息，對實際樣品進(jìn)行再次檢測，將檢測譜圖與Q-TOF/MS數(shù)據(jù)庫中譜圖，在鏡像對比條件下匹配確證。其Q-TOF得分值≥60，即確認(rèn)檢出該目標(biāo)化合物。

2.5 LC-Q-TOF/MS測定條件

2.5.1 色譜條件 液相色譜條件： ZORBAX SB-C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm，3.5 μm）； 流動相： A 為0.1% 甲酸溶液（含5 mmol /L乙酸銨），B為乙腈； 洗脫梯度： 0～3 min，1%～30% B； 3～6 min，30%～40% B； 6～9 min，40% B； 9～15 min，40%～60% B； 15～19 min，60%～99% B； 19～23 min99% B； 23～23.01 min 99%～1% B。后運(yùn)行4 min，柱溫： 40℃； 流速： 0.4 mL/min； 進(jìn)樣量： 10 μL。

2.5.2 質(zhì)譜條件 離子源： 電噴霧電離（ESI）源，正離子模式（ ESI + ）； 干燥氣溫度： 225 ℃； 干燥氣流速14 L/min，霧化氣壓力40 psi，鞘氣溫度325℃，鞘氣流速10 L/min，毛細(xì)管電壓： 4000 V，碎裂電壓400 V，錐孔電壓 65 V。全掃描質(zhì)核比范圍為m/z 100～1700，掃描速率為2 spectra/s，采用內(nèi)標(biāo)參比溶液對儀器質(zhì)量精度進(jìn)行實時校正，內(nèi)標(biāo)參比溶液包含嘌呤（離子精確質(zhì)量數(shù)為121.050873）和HP-0921（離子精確質(zhì)量數(shù)為922.009798）。

3 結(jié)果與討論

3.1 固相萃取小柱的選擇

考察了Carbon-NH2、 Cleanert C18和Cleanert PC/PSA 3種固相萃取柱的凈化效果。盡管Cleanert C18有很好的去非極性雜質(zhì)效果，但有色樣品經(jīng)過Cleanert C18處理后，仍存較多色素，存在污染色譜柱的風(fēng)險。 Carbon-NH2和Cleanert PC/PSA可有效去除樣品中的色素。圖1為經(jīng)不同固相萃取小柱處理后谷物果蔬中25種殺菌劑的回收率。Carbon-NH2固相萃取柱的加標(biāo)回收率更高一些，故在后續(xù)工作中選擇Carbon-NH2為凈化柱。

3.2 提取溶劑的選擇

本研究對提取溶劑的種類進(jìn)行了考察，根據(jù)25種化合物的理化性質(zhì)，首先選擇乙腈、 丙酮和乙酸乙酯作為提取劑。提取效率有明顯的差別，丙酮的加標(biāo)回收率個別的殺菌劑低于70%，多在70%～80%之間。乙酸乙酯的加標(biāo)回收率在70%～90%之間，乙腈的加標(biāo)回收率大多在80%～100%之間。在此基礎(chǔ)上，本實驗比較了1%（V/V）乙酸-乙腈與乙腈對實驗結(jié)果的影響，結(jié)果表明，1%（V/V）乙酸-乙腈對25種化合物的提取效率更好（圖2）。因此，本研究選擇1%（V/V）乙酸-乙腈作為提取溶劑。

3.3 洗脫溶劑及洗脫體積的選擇

本研究對洗脫溶劑及洗脫體積進(jìn)行了考察，比較了乙腈、 乙腈-甲苯（10∶1，V/V）、 乙腈-甲苯（5∶1，V/V）、 乙腈-甲苯（3∶1，V/V）作為洗脫溶劑的洗脫效果。結(jié)果表明，4種洗脫溶劑對25種化合物的洗脫效果都能滿足要求，乙腈-甲苯（3∶1，V/V）的洗脫能力最好，故選擇乙腈-甲苯（3∶1，V/V）作為洗脫溶劑。

進(jìn)一步對洗脫體積（10、 15、 20和25 mL）進(jìn)行了優(yōu)化，洗脫體積過大會造成浪費，若體積不足，則會造成洗脫效果不好，目標(biāo)物回收率低。結(jié)果表明，洗脫體積為20 mL時，洗脫效果最好。

3.4 線性范圍、 檢出限和定量限

以空白樣品制備系列濃度（0.02～200 μg/L）的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，在確定的色譜和質(zhì)譜條件下測定， 以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，6種基質(zhì)中線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.9950； 以3倍的信噪比計算檢出限，以10倍的信噪比計算定量限，大米、 燕麥、 黃瓜、 番茄、 葡萄和蘋果基質(zhì)中農(nóng)藥的檢出限分別為0.02～5 μg/kg、 0.02～5 μg/kg、 0.02～5 μg/kg、 0.01～5 μg/kg、 0.02～2 μg/kg和0.02～5 μg/kg，定量限分別為0.05～20 μg/kg、 0.05～10 μg/kg、 0.1～20 μg/kg、 0.02～20 μg/kg、 0.05～5 μg/kg和0.05～15 μg/kg。6種基質(zhì)中25種殺菌劑的線性范圍、 相關(guān)系數(shù)、 檢出限和定量限見附表1。表2為大米中25種殺菌劑的線性范圍、 相關(guān)系數(shù)、 檢出限和定量限。

3.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)主要是考慮基質(zhì)中是否含有干擾待測組分定量檢測的成分，這些影響可能由于在離子化過程中待測組分與樣品中干擾成分的競爭產(chǎn)生的[22]。本研究中，將基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品的線性校準(zhǔn)曲線的斜率（A）與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)品得到的斜率（B）進(jìn)行比較，評價由不同基質(zhì)引起的基質(zhì)誘導(dǎo)信號抑制或增強(qiáng)。若A/B的值在0.9～1.1之間，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。反之，基質(zhì)效應(yīng)不可忽略[20]。本研究中采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制校準(zhǔn)曲線以消除基質(zhì)效應(yīng)，使定量更準(zhǔn)確。6種基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)見附表1。

3.6 回收率和精密度

在大米、 燕麥、 番茄、 黃瓜、 葡萄、 蘋果中各添加質(zhì)量濃度為5、 20、 50 μg/kg的25種殺菌劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。應(yīng)用2.3節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，測定回收率，每個添加水平重復(fù)測定3次。結(jié)果顯示大米、 燕麥、 黃瓜、 番茄、 葡萄和蘋果基質(zhì)中25種殺菌劑的加標(biāo)回收率范圍分別為73.4%～111.7%、 72.2%～114%、 71.8%～107.7%、 75.7%～106%、 76.4%～102.2%和81.8%～113.2%。 RSD范圍分別為0.5%～13.9%、 0.4%～21.3%、 0.1%～14.6%、 0.2%～9.5%、 0.2%～9.6%和0.6%～19.8%。（見附表2），表3為大米中25種殺菌劑的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3.7 實際樣品分析

應(yīng)用本方法對市售的68例樣品（番茄、 黃瓜、 葡萄各14例，蘋果18例，大米5例，燕麥3例）中25種殺菌劑進(jìn)行測定。樣品來自北京、 天津和石家莊各大超市及農(nóng)貿(mào)市場。18例蘋果樣品中檢出3種殺菌劑（嘧菌酯、 氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯），14例葡萄樣品中檢出4種殺菌劑（嘧菌酯、 氟吡菌酰胺、 吡唑醚菌酯和肟菌酯），14例番茄樣品中檢出5種殺菌劑（嘧菌酯、 氟吡菌酰胺、 吡唑醚菌酯、 氟唑菌酰胺和肟菌酯），14例黃瓜樣品中檢出4種殺菌劑（嘧菌酯、 啶酰菌胺、 氟吡菌酰胺和肟菌酯），5例大米樣品中均未檢出，3例燕麥樣品中檢出2種殺菌劑（氟吡菌酰胺和氟嘧菌酯）。68例樣品檢出殺菌劑、 TOF得分、 Q-TOF得分及定量結(jié)果見表4。

4 結(jié) 論

本研究采用固相萃取的方法對谷物、 蔬菜和水果樣品進(jìn)行前處理，并通過建立一級數(shù)據(jù)庫與二級譜圖庫，應(yīng)用LC-Q-TOF/MS數(shù)據(jù)庫的檢索功能，實現(xiàn)了無需標(biāo)準(zhǔn)品對照，對谷物和果蔬中25種殺菌劑的篩查與確證。25種殺菌劑在0.02～200 μg/L范圍線性良好，回收率為71.8%～114.0%。本方法快速、簡單、 凈化效果好、 靈敏度高，可以用于谷物和果蔬中殺菌劑的快速篩查，為食品安全提供了保障。

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