金納米簇熒光猝滅型探針高靈敏檢測精胺

安曉剛+杜捷+齊偉男+劉璐+李小燕+甘海玲+盧小泉

摘 要 以紫脲酸銨（Murexide，MU）為還原劑及保護劑，采用水熱合成法，合成了紫脲酸銨保護的熒光金納米簇（MU-Au NCs），合成方法簡單、快速。基于精胺對MU-Au NCs的熒光猝滅現象，建立了快速、超靈敏檢測精胺的“Turn off”型熒光分析方法，在優化的條件下，本方法檢測精胺的線性范圍為0.003～300 μmol/L，檢測限為1 nmol/L（S/N=3）。本方法為構建精胺生物傳感器及實際樣品檢測提供了理論基礎和參考。

關鍵詞 紫脲酸銨； 金納米簇； 熒光猝滅； 精胺； 生物胺

1 引 言

生物胺（Biogenic amines， BA）主要包括精胺（Spermine， SPM）、腐胺（Putrescine， PUT）和亞精胺（Spermidine， SPD）， 通過微生物產生的活性物質在食物的儲存和加工過程中形成[1，2]， 廣泛存在于食品中[1，3]， 易對生物胺敏感人群健康造成危害[1，3，4]。研究發現， 癌癥患者體內 SPM 水平會顯著增加[5]， 臨床上將 SPM 水平作為早期診斷腫瘤的標志物和治療效果的評價指標之一， 但對于SPM代謝改變的具體機制尚不完全清楚。因此， 檢測生物胺含量對于保證消費者的健康具有重要意義。然而， 除個別規定外[1]， 我國以及歐洲對于食物中生物胺含量均未做出明確限定和要求。近年來， 由于食品安全問題頻頻發生， 引起了人們對食品安全的高度重視， 食品中生物胺含量檢測成為近年研究熱點。目前， 生物胺檢測分析方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）[6，7]、毛細管電泳法[8，9]等， 這些方法對操作人員的技術要求較高， 操作繁瑣。因此， 靈敏、有效的檢測方法， 對于食品質量監測、保護消費者健康具有重要的現實意義。

靈敏度是衡量檢測方法性能的重要指標。近些年出現的一些生物分子超靈敏檢測方法， 因其簡單、高效、靈敏， 在臨床診斷[10]、食品質量控制[11]和環境監測等領域得到廣泛應用。傳統的標記物包括電化學活性分子[12]、熒光染料[13]、高量子產率的聚合物[14]以及酶如辣根過氧化物酶（HRP）[15]等， 但這些材料通常存在熒光性質不穩定、容易光漂白等不足。貴金屬納米簇是近年來興起的熒光標記材料， 具有低毒、熒光性質穩定、生物相容性好等優點， 極大提高了檢測的靈敏度[16，17]， 彌補了傳統標記物的不足， 而且提高了信號放大能力和分子檢測的靈敏度， 且方法簡便。

紫脲酸銨（Murexide， MU）是一種紅紫酸銨鹽， 微溶于冷水， 能與很多陽離子形成不同顏色的絡合物， 常被作為一種絡合滴定指示劑用于分析化學絡合滴定[18]、電極表面修飾[18～21]及生物分子檢測[22～26]。由于其具有分子量小、對pH值敏感、還原性強， 能與很多陽離子形成不同顏色的絡合物的優點， 常作為生物分子檢測指示劑[24]。如Grudpan等[24]將 MU 作為流動注射法檢測 Ca2+的顏色指示劑； Shamsipur等[27]將 MU 用于制備銅鎳配合物。

本研究以紫脲酸銨為還原劑及保護劑， 采用簡單、快速的水熱法， 合成了具有藍色熒光、熒光性質穩定、生物相容性好、分散性以及水溶性好的金納米簇（MU-Au NCs）。基于精胺對其的熒光猝滅現象， 建立了快速、超靈敏檢測精胺的“Turn Off”型熒光分析方法， 對精胺線性檢測范圍為0.003～300 μmol/L， 檢出限為 1 nmol/L。本研究不僅拓展了金納米簇的種類， 而且建立了簡單、超靈敏檢測精胺的分析方法， 為生物實際樣品及食物中生物胺含量檢測提供了理論依據和技術參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

安捷倫-G9800A 熒光分光光度計（美國Agilent公司）； TENSOR-37 型傅立葉變換紅外光譜儀（德國布魯克公司）； JEM-2100 高分辨率透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）； Veeco Nanoscope 3D 原子力顯微鏡（美國 Veeco Nanoscope公司）； FLS 920 穩態/瞬態熒光光譜儀（美國 Edinbergh 公司）； PB-10 PH 計（德國 Sartorius 公司）； FA 2004型分析電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）； ZD-A 21 真空冷凍干燥機（南京載智自動化設備有限公司）；

氯金酸（HAuCl4， 分析純， 金含量> 47.8%， 天津市光復精細化工研究所）； 精胺（純度 98%， Aladdin公司）； 紫脲酸銨（分析純， Aladdin 公司）； 谷胱甘肽（純度 99%， 北京百靈威科技有限公司）； 透析袋（MWCO 500～1000 Da， 上海源葉生物科技有限公司）； 其余試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司， 純度均大于 99%； 實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1 紫脲酸銨保護的金納米簇（MU-Au NCs）的合成 在4.48 mL 二次蒸餾水中加入 520 μL 48 mmol/L氯金酸溶液， 30℃恒溫水浴和磁力攪拌下， 將 5 mL 10 mmol/L紫脲酸銨溶液逐滴加到上述溶液中， 反應 30 min后取出， 14000 r/min離心20 min， 取上清液， 透析 48 h， 收集透析內液， 即得到紫脲酸銨保護的金納米簇（MU-Au NCs）， 4℃保存， 備用。

2.2.2 MU-Au NCs性質表征 采用熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜、熒光壽命分析及高分辨透射電子顯微鏡對制備的 MU-Au NCs 形貌、粒徑大小及光學性能進行了表征。熒光光譜采用 Agilent G 9800A 熒光分光光度計測定， 激發、發射狹縫寬度均設定為5； 熒光壽命分析采用 FLS 920 穩態/瞬態熒光光譜儀測定， 參比溶液為LUDOX 硅溶膠（30% 硅膠水溶液）； 原子力顯微鏡（AFM）圖譜采用美國 Veeco Nanoscope 3D 原子力顯微鏡測得， 將樣品分散在無水乙醇中， 用表面打磨干凈云母片（或硅片）沾取， 自然晾干， 進行樣品掃描。

2.2.3 對精胺的檢測 取 2 mL MU-Au NCs 溶液用 pH 7.0 的 PBS 緩沖液稀釋至 3 mL， 分別加入500 μL不同濃度的標準精胺溶液（以二次蒸餾水為空白樣品）， 混合均勻， 反應 30 min 后進行熒光檢測。空白樣與待測樣品熒光強度差值用ΔF（ΔF=F0-F1）表示， 熒光猝滅程度用（F0-F1）/F0表示， 其中F0和 F1分別代表空白溶液和樣品溶液的熒光強度。

2.2.4 樣品處理與分析 取5 g 待測冷鮮豬肉樣品加入20 mL 的0.4 mol/L 的HClO4， 經勻漿機粉碎勻漿， 4℃， 2500 r/min離心10 min， 收集上清液[28]。對沉淀部分進行再次提取， 方法同上。混合兩次提取的上清液， 用0.4 mol/L HClO4定容至25 mL， 然后加入pH 7.0 的 PBS（0.12 mol/L）緩沖液。

取 2 mL MU-Au NCs 溶液， 加入上述樣品提取液 1 mL， 分別加入 300 μL濃度為1×108 mol/L， 1×107 mol/L， 1×106 mol/L的標準精胺溶液， 反應 30 min后檢測熒光， 平行3次實驗， 計算RSD值。

3 結果與討論

3.1 MU-Au NCs的微觀形貌表征

高分辨透射電子顯微鏡（TEM）及原子力顯微鏡（AFM）表征結果如圖 1所示。透射電鏡圖譜（圖1A）表明， MU-Au NCs 具有良好的分散性， 平均粒徑為 2 nm， 晶格明顯， 為 0.23 nm， 間距幾乎相同， 與金納米簇的典型特征一致， 證明制備得到的是金納米簇。AFM圖（圖1B）顯示 MU-Au NCs 呈球形， 高度小于 2 nm。

3.2 MU-Au NCs的紅外光譜分析

化學反應前后物質中化學鍵及官能團的變化可以間接反映化學反應機理。不同物質的傅里葉變換紅外光譜圖如圖2所示。

在紫脲酸銨的紅外光譜中， 3658 cm1處為NH 的伸縮振動， 3041 cm1處為 CC 的伸縮振動， 2838 cm1處為CH的伸縮振動， 1690 cm1處為CO的伸縮振動， 1291 cm1處為CO的彎曲振動。對于紫脲酸銨與氯金酸反應制備的金納米簇（MU-Au NCs）， 3735 cm1處為NH的伸縮振動， 3421 cm1處為OH的伸縮振動， 2896 cm1處為CH的伸縮振動， 1632 cm1處為CO的伸縮振動， 1060 cm1處可能為COAu的彎曲振動。對比發現， 紫脲酸銨與氯金酸反應后， NH伸縮振動減弱， 紫脲酸銨于3041 cm1處的CC伸縮振動及 1291 cm1處的CO彎曲振動消失， 1690 cm1處的CO伸縮振動減弱， 于3421 cm1處產生了劇烈的OH的伸縮振動， 并于 1060 cm1處產生了一個新的彎曲振動特征峰， 可能為 COAu的彎曲振動。以上變化表明， 紫脲酸銨與氯金酸發生了相互作用， 紫脲酸銨分子修飾到Au NCs表面。

3.3 MU-Au NCs 的光學性質表征

熒光性質是貴金屬納米簇的主要性質之一。如圖 3A 所示， MU-AuNCs 在 330 nm處有紫外吸收峰， 在 280和 335 nm 有熒光激發峰， 在 445 nm 處有熒光發射峰。此金納米簇溶液在可見光下呈無色透明， 在 365 nm 波長紫外燈下發出藍色熒光（圖3A插圖）。熒光壽命分析結果如圖3B 所示， MU-Au NCs的熒光壽命持續時間約20 ns， 與參比溶液 LUDOX 相比， 熒光壽命持續時間約是其 3 倍。熒光穩定性實驗結果如圖3 C所示， 此金簇在1～12月內熒光性質較穩定， 具有良好的熒光性質。

3.4 精胺對MU-Au NCs 熒光猝滅響應

樣品檢測的特異性對于熒光探針檢測的實際應用是非常重要的。為了探究構建的金納米簇熒光猝滅型探針檢測精胺的特異性， 選擇精胺測定常見的干擾物谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸、組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）等、評價此熒光探針的特異性， 取高于最高檢測限濃度10 倍的干擾物加入MU-Au NCs溶液中， 觀察干擾物對精胺檢測的影響， 計算熒光強度差值ΔF值和熒光猝滅程度。如圖 4A所示， 測試的干擾物對精胺檢測影響較小， 說明此探針對精胺檢測的選擇性和特異性比較好。圖4B的結果說明， 不同濃度的精胺對MU-Au NCs 熒光猝滅強度不同， 可利用此原理進行精胺的檢測。

3.5 實驗條件優化

pH值及離子強度是主要影響因素， 對實驗結果影響較大。由圖5A可見， 當 pH=7時， 對精胺檢測有一定的影響， 但總體影響較小， 為后續實驗及應用方便， 故選擇最適 pH=7。圖5B表明， 在測試的范圍內， 離子強度對精胺猝滅金納米簇熒光強度的影響也較小。綜合上述實驗結果， pH值 及離子強度對精胺檢測的影響較小， 后續實驗中離子干擾影響可以忽略。

3.6 方法的檢測性能

不同濃度的精胺存在時， MU-Au NCs 的熒光光譜如圖6所示， 隨著精胺濃度增大， MU-Au NCs 的熒光猝滅程度增大。熒光猝滅程度（F0-F1）/F0與精胺濃度在0.003～300 μmol/L范圍內呈線性關系，線性方程為y=0.0023x+0.0356（r=0.9982）， 檢出限為 1 nmol/L（S/N=3）。

將本方法與文獻報道的其它方法進行比較（表1）可知， 本方法對精胺的檢測范圍較寬， 且檢出限相對較低。盡管本方法與文獻報道的超高液相色譜-三重四極桿質譜（UHPLC-TQMS）方法相比， 靈敏度（檢測限）稍低， 但本方法操作簡單、快速， 適于常規的快速檢測。

3.7 實際樣品分析

為了評價所構建的熒光探針對實際樣品中 SPM 檢測的實用性， 檢測了市售冷鮮豬肉在貯藏過程中的精胺含量。采用標準加樣回收法對豬肉提取液中的 SPM 含量進行了測定， 結果見表 2。豬肉中 SPM 的平均回收率為 97.1%～105.6%， 表明此熒光探針能夠適用于實際樣品中精胺的檢測要求。

4 結 論

以紫脲酸銨作為還原劑及保護劑， 采用水熱合成法， 簡單、快速合成了直徑<2 nm的熒光金納米簇（MU-Au NCs）。基于精胺對紫脲酸銨保護的金納米簇的熒光猝滅現象， 建立了快速、超靈敏檢測精胺的“Turn off”型熒光分析方法， 對精胺線性檢測范圍為0.003～300 μmol/L， 檢出限為 1 nmol/L。本研究拓展了金納米簇的種類， 為構建基于貴金屬納米簇的生物傳感器及生物樣品檢測提供了基礎和參考。

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