直噴離子化質譜簡單快速鑒別關木通

張朝輝+谷陟欣+劉婧靖+陳應莊+陳波+馬銘

摘 要 采用直噴離子化質譜技術，通過對關木通的敞開式質譜輪廓分析，對關木通和其它兩種木通（木通、川木通）進行了快速鑒別，建立了關木通中木蘭花堿的快速測定方法。結果表明，可以利用標志性成分木蘭花堿對馬兜鈴科關木通進行鑒別； 同時，在正離子模式下，以荷葉堿為內標，木蘭花堿與內標的信號強度比與木蘭花堿標準溶液的濃度，在0.50～20.00 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數為0.9989，檢出限為0.1 mg/L。 本方法簡單、快速、無需樣品前處理，可用于有毒藥材關木通的直接、原位、快速分析和鑒定。本研究結果對木通中藥材的質量控制具有重要參考價值。

關鍵詞 直噴離子化質譜； 關木通； 木蘭花堿； 馬兜鈴酸A

1 引 言

木通為常用中藥，可分為木通、川木通與關木通，歷史上三者被允許混用。雖然傳統上它們統稱為木通，但三者來源不同，木通屬于木通科，川木通屬于毛茛科，關木通屬于馬兜鈴科[1]。丁林生等[2，3]對關木通的化學成分進行研究，發現其含馬兜鈴酸和木蘭花堿等成分。關木通中含有的馬兜鈴酸A會引起人體腎臟損害，屬“有毒”類中藥，已于2003年被取消了用藥標準。但由于歷史遺留問題以及木通資源短缺等原因，關木通在市場上作為木通、川木通的替代品的現象屢禁不止。因此，建立一種快速、簡單的關木通、木通和川木通的鑒別方法至關重要。

傳統的鑒別木通方法主要是根據3種藥材外觀性狀的異同，依靠經驗進行區分，鑒別結果不夠準確。謝麗莎等[4]利用紫外光譜組法對3種木通進行了鑒別，但是它們的紫外吸收光譜很接近，需先求得吸光系數再根據吸光系數的差異進行鑒別； 李睿等[5]采用近紅外漫反射光譜法對3種木通進行了鑒別，但該方法需要經二階導數處理后建立聚類分析模型； 孫萍等[6]利用LC-MS技術對3種木通進行了鑒定，但需要經過繁瑣的樣品前處理過程，有機溶劑消耗大、操作繁瑣費時。

敞開式質譜技術作為一種快速分析技術，具有無需或僅需簡單的樣品前處理、可實現樣品原位分析等優點[7～9]。自2004年Cooks等[10]提出該技術以來，得到了迅速發展。直噴離子化技術是敞開式質譜技術的一種，由于它具有簡單、易操作、溶劑消耗少等特點，近年來被廣泛應用于環境、食品、藥品及公共安全等領域[11～13]。然而，利用直噴離子化技術直接鑒別3種木通的研究還未見文獻報道。

本研究采用直噴離子化質譜技術，通過對關木通的敞開式質譜輪廓進行分析，提出了將木蘭花堿作為關木通標志性成分進行鑒別的方法，并采用荷葉堿作為內標，對關木通中的木蘭花堿含量進行了半定量測定。本方法簡單、快速、靈敏，對木通的真偽鑒別，尤其是有毒中藥材關木通的鑒別具有重要意義。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Thermo Finnigan-LCQ離子阱質譜，配LCQ-tune工作站（英國菲尼根公司）； 高壓直流電源（天津東文高壓電源有限公司）； LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）； 高速萬能粉碎機（北京市永光明醫療儀器有限公司）； KQ3200E型超聲波發生器（昆山市超聲儀器有限公司）； 噴霧濾紙購買于沃特曼公司。

馬兜鈴酸A和荷葉堿對照品（中國藥品生物制品檢定所）； 木蘭花堿對照品（上海源葉生物科技有限公司）； 甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純，購于國藥集團； 實驗用水為二次蒸餾水。木通科木通、毛茛科川木通、馬兜鈴科關木通等藥材均由九芝堂藥學專家提供并進行鑒定。

2.2 質譜條件

實驗采用ESI離子源正離子模式，掃描范圍m/z 100～1000； 無需氣體； 噴霧電壓：+3.50 kV； 毛細管錐孔電壓：10 V； 源溫度：250℃。二級質譜碰撞能量：30%。

2.3 實驗方法

直噴離子化技術主要在一個三角形濾紙（或其他小尖端物體）上進行：少量樣品被提前加在濾紙（或其它小尖端物品）上，再用少量溶劑濕潤樣品載體或樣品本身，施加高壓，此時樣品被離子化，進入質譜儀。此技術分為樣品裝載、分離、離子化3個過程。直噴離子化示意圖如圖1。為了保證結果的重現性和準確性，濾紙或樣品尖端距質譜入口的距離固定在5～10 mm左右。實驗中，液體樣品的進樣采用紙噴霧方式，固體樣品的進樣采用直接噴霧方式。

2.4 木蘭花堿紙噴霧半定量分析

標準曲線的繪制：采用荷葉堿作為內標，以木蘭花堿與荷葉堿的信號強度比作為縱坐標，木蘭花堿標準溶液的濃度作為橫坐標建立標準曲線。木蘭花堿的系列標準溶液濃度分別為0.50、1.00、5.00、10.00和20.00 mg/L，內標荷葉堿的含量均為4 mg/L。用沃特曼濾紙做載體，取15 μL混合標準溶液進行噴霧分析。

樣品溶液的處理：稱取關木通藥材粉末0.4 g， 加入20.00 mL無水乙醇（含冰乙酸0.50 mL），浸泡0.5 h，超聲提取0.5 h，2000 r/min離心15 min，取上清液，加入計算量的內標溶液，最后用甲醇稀釋至20 mL（內標荷葉堿的含量為4 mg/L）。

3 結果與討論

3.1 木通、川木通與關木通藥材直接噴霧分析

在2.2節質譜條件下，對3種木通藥材進行了直接噴霧和一級全掃描質譜分析（圖2）。由圖2可知，在關木通的質譜中可以明顯觀測到m/z 342.08強峰，而木通、川木通在上述特征峰位置均無相應的峰出現。

3.2 關木通的特征峰分析

3.2.1 標準溶液紙噴霧分析 根據關木通中特征峰m/z 342.08的信息，推測此特征峰可能為馬兜鈴酸A （C17H11NO7，分子量341.27 ）或木蘭花堿（C20H24NO+4，分子量342.41）。為此，在同樣質譜條件下，對兩種物質的標準溶液進行了紙噴霧質譜分析。由圖3B可知，馬兜鈴酸A一級質譜主要質譜峰為[M+NH4]+（m/z 358.95）離子、[2M+NH4]+（m/z 699.76）離子和[2M+Na]+（m/z 704.83）離子，其中[2M+Na]+離子為基峰，在m/z 342處沒有相應的分子離子峰，此結果與文獻報道吻合[14] 。而木蘭花堿的一級質譜在m/z 342處有很強的峰 （圖3A）。

3.2.2 m/z 342紙噴霧二級質譜分析 為了進一步驗證關木通中的m/z 342峰的歸屬，對關木通提取液和木蘭花堿標準溶液中m/z 342峰進行了紙噴霧二級質譜分析。由圖4可知，兩者的碎片幾乎完全一樣，各碎片離子的相對豐度也基本一致，且都以m/z 297.07為基峰，由此可以證明，關木通藥材中的m/z 342.08峰確為木蘭花堿。

3.2.3 關木通中馬兜鈴酸A和木蘭花堿成分的液相色譜分析 為了驗證關木通中的馬兜鈴酸A和木蘭花堿成分，同時利用液相色譜進行了結果驗證，結果見圖5。比較標準溶液和提取液的液相色譜分析結果及各峰相應的紫外圖譜可知，關木通中確實存在馬兜鈴酸A和木蘭花堿成分。

然而，關木通的敞開式質譜直噴測定結果中，并沒有發現馬兜鈴酸A的特征離子，究其原因，馬兜鈴酸A加合離子多，敞開式質譜響應靈敏度較低。另一方面，從木蘭花堿（5 mg/L）和馬兜鈴酸A（10 mg/L）混合標準溶液的一級質譜圖（圖6）可見，木蘭花堿的存在干擾了馬兜鈴酸A的響應。

由于木蘭花堿的質譜響應好，壓低了馬兜鈴酸A的信號，從譜圖上只能見到木蘭花堿的峰，而見不到馬兜鈴酸A的峰。由此可見，利用馬兜鈴酸A難以進行關木通的鑒定，相反，采用響應信號好的木蘭花堿進行鑒別，可以獲得更可靠的關木通鑒定結果。

3.3 關木通中木蘭花堿的半定量分析

因馬兜鈴酸A和木蘭花堿分子量相近，紫外響應也很接近，相互干擾測定。采用敞開式質譜分析方法，可以去除關木通中馬兜鈴酸A的干擾，對其中的木蘭花堿進行半定量測定。以荷葉堿為內標，以木蘭花堿與內標的信號強度比為縱坐標，木蘭花堿標準溶液的濃度為橫坐標建立線性關系，在 0.50～20.00 mg/L范圍內測得兩者線性相關，相關系數達到0.9989，檢出限為0.1 mg/L，對1.00、5.00和10.00 mg/L 3個濃度水平的木蘭花堿平行測定，測得木蘭花堿濃度的RSD<5%。

按照2.4節進行樣品處理，平行6次，測得關木通提取液中木蘭花堿的平均含量為984.3 μg/g，RSD為4.7%。說明本方法可用作關木通中木蘭花堿半定量分析的依據。本方法在無需樣品預處理的情況下，能夠根據木蘭花堿快速鑒別關木通，并且檢測結果穩定，具有較好的重復性。

4 結 論

采用直噴離子化質譜檢測技術，在無需樣品預處理的前提下，通過對關木通藥材進行直噴分析，分析了其中馬兜鈴酸A和木蘭花堿的敞開式質譜，獲得了其正離子模式下的指紋圖譜，找出了其中的標志性成分木蘭花堿，建立了快速檢測關木通中木蘭花堿的半定量分析方法，可成功應用于有毒藥材關木通與木通、川木通的鑒別。本方法簡單、快速、準確，為中藥材的質量控制提供了參考。

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