基于含有活性銅的碳點電化學傳感器選擇性檢測尿酸

劉紅英+金騰飛+戴大響+焦明儒+黃成+張名鎮+顧春川

摘 要 采用水熱法制備了含有活性銅的碳點，利用熒光光譜和紫外可見吸收光譜對其光學性質進行了表征。通過電沉積法將其修飾于玻碳電極表面， 構建了電化學生物傳感器，采用循環伏安法、交流阻抗法和差分脈沖伏安法對電極的電化學行為進行了考察， 并對其電化學反應機理進行了探討。結果表明，此傳感器對尿酸具有良好的電催化效果，可有效消除抗壞血酸和多巴胺等物質的干擾。在最佳條件下，氧化峰電流與尿酸的濃度在1.00～300 μmol/L范圍內呈良好的線性關系， 檢出限為0.30 μmol/L（S/N=3）。此傳感器具有制作簡單、選擇性好、靈敏度高和線性范圍寬等優點，有望應用于實際樣品的檢測。

關鍵詞 活性銅； 碳點； 電化學； 生物傳感器； 尿酸

1 引 言

尿酸（UA）是人體嘌呤的代謝產物[1]，在體內含量過高會導致痛風性關節炎、高尿酸血癥和Lesh Nyan綜合癥等疾病[2]。近年來，隨著生活水平提高，越來越多的人處于尿酸過高的亞健康甚至疾病狀態。由此可見，UA濃度的準確檢測在臨床醫學領域具有重要意義。發展靈敏、快速、低廉的UA檢測方法非常重要。

目前，UA的測定方法有色譜法[3]、分光光度法[4]、熒光法[5]、化學發光法[6]、電化學發光法[7]、電化學法[8，9]等。其中，電化學方法具有選擇性好、靈敏度高、操作簡單和成本低廉等優點而廣泛應用于UA的測定[10]。然而，傳統電極上其氧化電位與抗壞血酸（AA）的電位接近，容易受到AA的影響[11]。為了解決這一問題，已發展很多策略。Hiroaki等[12]報道了一種銅修飾電極選擇性檢測UA。Cu可與UA形成配合物，沉積在電極表面，將AA與UA很好地區分。另一方面，納米材料具有獨特的光學與電學性質以及比表面積大、反應活性高、吸附能力強等優良特性，為電極的表面修飾提供了新的研究途徑[13]。

碳點是尺寸小于10.0 nm的納米顆粒，是近年發展起來的一類新型“零維”碳納米材料。由于其具有優良的光學性質、良好的生物相容性、化學惰性及低毒性，引起了研究者的關注，成為材料科學前沿領域的一個新研究熱點[14]。在過去的幾年里，碳點的研究已經取得許多重要成果，在生物成像[15]、藥物輸送[16]、傳感器[17]及能量轉換[18]等領域得到很大發展。最近，Ren等利用水熱法合成了具有類酶性質的含有活性銅的碳點（CuCDs）[19]， XPS分析該碳點中的銅呈現0和+1價， 該材料能夠將活性銅對UA的選擇性檢測與碳點優良的電催化性質結合起來。

本研究首先采用水熱法合成含有活性銅的碳點，通過電沉積法將其修飾在玻碳電極表面，制備CuCDs/GCE電極，如圖1所示。利用碳點較大的比表面積和高的電子傳遞速率， 以及活性銅對電極界面上基質的電子轉移速率的促進作用和對UA的選擇性，實現對UA的測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F4000型熒光分光光度計（日本日立公司）； Shimadzu 3600 UVVis光譜儀（日本島津公司）； CHI660A電化學工作站（上海辰華儀器有限公司），采用三電極系統：以飽和甘汞電極為參比電極，Pt絲電極為對電極，裸玻碳電極（GCE，φ=3 mm）或修飾玻碳電極為工作電極； ZF20D暗箱三用紫外分析儀（上海驥輝科學儀器有限公司）。

聚甲基丙烯酸鈉（PMAA，30%，Sigma 公司）； UA、AA、多巴胺（DA）、Cu（NO3）2、K3Fe（CN）6、K4Fe（CN）6（國藥集團化學試劑有限公司）。0.100 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）由NaH2PO4、Na2HPO4和KCl 配制，并用0.100 mol/L H3PO4或NaOH調節pH值。實驗所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

2.2 含有活性銅碳點的制備

采用水熱法一步合成含有活性銅碳點[20]： 首先稱取2.50 g PMAA和適量Cu（NO3）2于燒杯中，加入50.0 mL去離子水， 混合均勻后倒入水熱反應釜中，240℃反應9 h。 所得產物13000 r/min離心30 min， 去除溶液中的大顆粒殘渣。用截留分子量為1 kD的透析袋透析純化12 h， 最終在4℃下避光保存。

不含活性銅碳點的制備方法同上，所不同的是將PMAA和Cu（NO3）2的混合溶液換成PMAA溶液。

2.3 修飾電極的制備

分別用粒徑為1.00、0.30和0.05 μm的氧化鋁粉末配合麂皮打磨電極，再依次用丙酮、乙醇和去離子水超聲清洗。將其置入含有活性銅的碳點溶液中，利用電沉積法，在0～2.0 V的電位范圍以100 mV/s掃速循環掃描10圈，制得CuCDs/GCE電極。將打磨好的玻碳電極置于不含活性銅的碳點溶液中，在相同條件下電化學沉積制得CDs/GCE。

3 結果與討論

3.1 CuCDs的表征

透射電鏡（圖2A）顯示， 所合成的CuCDs具有良好的結晶性和單分散性，平均粒徑為5.5 nm。紫外可見吸收光譜（圖2B（a））顯示， CuCDs從紫外區到可見區均有吸收， 且在260 nm附近有一個明顯的紫外吸收峰。CuCDs在365 nm波長紫外燈激發下發出強的藍綠色熒光。對其熒光性能進行研究發現，在350 nm激發波長下獲得位于460 nm的最大發射，如圖2B（b）所示，與文獻[20]報道的一致。

3.2 修飾電極的電化學表征

CuCDs通過電沉積法形成CuCDs/GCE，沉積過程如圖3A所示。在外加電場下，表面包覆了PMAA的CuCDs以平行方式沉積到電極表面。用交流阻抗技術對此電極進行表征。圖3分別為裸GCE，CDs/GCE和CuCDs/GCE在Fe（CN）36溶液中的交流阻抗圖譜。裸GCE的電子轉移阻抗值為90.0 Ω，CDs修飾到電極表面后，其阻抗值降至78.0 Ω，表明其電子轉移阻礙性變小，說明CDs具有良好的導電性。當CuCDs修飾后，阻抗僅為68.0 Ω，表明活性銅能促進電極表面的電子傳遞，電荷傳輸電阻減小。這證明了CuCDs已成功固定于電極表面，且活性銅和碳點兩者能夠產生協同效應， 有利于電荷傳輸。

3.3 UA在CuCDs/GCE上的電化學響應

為了實現對UA的電化學檢測，考察了100 μmol/L UA在不同修飾電極上的電化學行為。如圖3C所示， UA在裸GCE上無明顯的峰，而在CDs/GCE上有一個微弱的峰，位于0.326 V。在電極表面引入CuCDs后， UA在0.299 V呈現一個尖銳的氧化峰， 比CDs/GCE的氧化峰電位負移了0.027 V，且峰電流增加了2.30倍。這表明CuCDs/GCE對UA的氧化具有較好的催化作用。推測原因如下：一是碳點的顆粒較小，具有非常大的比表面積和高的電子傳遞速率； 二是活性銅的引入能有效改善電極的導電性，促進了電極界面上基質的電子轉移速率； 三是活性銅在碳點表面的均勻分布更好地發揮了協同催化效應。

3.4 pH值和掃速的影響

圖4A為不同pH值下UA 在CuCDs/GCE上的循環伏安曲線。由圖4A可見，UA在pH 7.0的PBS中獲得了最大峰電流。鑒于人體體液為中性環境，故UA檢測時選擇pH 7.0的PBS為支持電解質。UA的氧化峰電位隨pH值的增加而發生明顯負移。且與pH值呈良好的線性關系，線性方程為E（mV）=0.807-0.0705pH （R2=0.995），斜率為70.0 mV/pH，與理論值59.0 mV/pH相接近[21]，表明UA的電化學反應是一個等質子等電子的過程。根據文獻[22]，UA的氧化是一個兩電子參與的過程，因此電極上UA的反應近似為兩電子兩質子過程，方程式如式（1）所示。

在10～200 mV/s范圍內，研究了掃描速度對UA氧化峰電流的影響。圖4B為不同掃速下CuCDs/GCE在含有UA的PBS緩沖液中的循環伏安圖，UA的氧化峰電流隨掃速的增加而增大，且呈線性關系， 線性方程為I=0.0589V-2.58 （R2=0.9976），表明UA在CuCDs/GCE受吸附控制。

3.5 電化學檢測

最佳條件下，采用示差脈沖伏安法對不同濃度的UA進行檢測。如圖5所示，UA的氧化峰電流隨其濃度的增加而增大。在1.00～300 μmol/L范圍內，峰電流與UA濃度呈良好的線性關系，線性方程式為I=0.0613C +1.0453 （R2=0.993），檢出限為0.30 μmol/L （S/N=3）， 比較了不同修飾電極對UA檢測的線性范圍和檢出限。如表1所示，本傳感器線性范圍更寬，檢出限更低，具有更好的檢測性能。

3.6 干擾實驗

UA的測定干擾主要來自AA、DA和葡萄糖。 在最佳條件下，分別考察1.0 mmol/L的AA和葡萄糖、0.100 mmol/L DA對UA測定的影響。如圖6A所示，此修飾電極能很好地區分AA和UA，且響應信號的相對標準偏差（RSD）小于5.0%。 DA（圖6B）和葡萄糖（圖6C）也對UA的測定無影響，說明此電極的選擇性良好。

3.7 傳感器的重現性與穩定性

分別考察了CuCDs/GCE的穩定性和重現性。在UA濃度為100 μmol/L時，測得6根電極的電化學響應電流的相對標準偏差為4.30%，表明此傳感器具有良好的重現性。將傳感器置于4℃保存1個月，對UA測定的電化學信號標準偏差為6.50%，表明此傳感器對UA的測定具有良好的穩定性。

3.8 實際樣品中UA濃度的測定

利用修飾電極對5份血清樣本進行了分析，并與醫院檢測結果比對（表2），結果表明，此電極可用于實際樣品的測定。

4 結 論

采用水熱法制得含有活性銅的碳點，采用電沉積法將其固定在電極表面，制得電化學傳感器。利用碳點較大的比表面積和高的電子傳遞速率，及活性銅對電極界面上基質的電子轉移速率的促進作用和對尿酸的選擇性，實現對尿酸的選擇性測定。此傳感器制備簡單，且能夠有效消除抗壞血酸和多巴胺對尿酸測定的干擾，表現出線性范圍寬、重現性與穩定性好、抗干擾能力強等優點，有望應用于實際樣品的檢測。

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