HPLC法測定鹽酸表阿霉素-索拉非尼PLGA栓塞微球的載藥量和包封產率Δ

劉斌斌，簡 暉，黃珊珊，劉 微，朱益雷，羅曉健，李 翔#（.江西中醫藥大學藥學院，南昌330006；.中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，南昌 330006）

HPLC法測定鹽酸表阿霉素-索拉非尼PLGA栓塞微球的載藥量和包封產率Δ

劉斌斌1＊，簡 暉1，2，黃珊珊1，劉 微2，朱益雷1，羅曉健1，2，李 翔1，2#（1.江西中醫藥大學藥學院，南昌330006；2.中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，南昌 330006）

目的：建立測定鹽酸表阿霉素-索拉非尼聚乳酸-羥基乙酸聚合物（PLGA）栓塞微球載藥量和包封產率的方法。方法：采用高效液相色譜法測定該制劑中鹽酸表阿霉素和索拉非尼的含量，再通過公式計算載藥量和包封產率。色譜柱為Phenomenex Luna 5u C8（2）100A，流動相為甲醇-[水（含0.05%三氟乙酸和0.14%十二烷基硫酸鈉）]（75∶25，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為252 nm，柱溫為25℃，進樣量為10 μL。結果：鹽酸表阿霉素和索拉非尼檢測質量濃度線性范圍分別為2.020～101.00 μg/mL（r＝0.999 8）、2.048～102.40 μg/mL（r＝0.999 7）；定量限分別為3.297 0、2.546 8 μg/mL；檢測限分別為0.989 1、0.764 1 μg/mL；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；回收率分別為96.41%～101.80%（RSD＝1.64%，n＝9）、99.46%～101.45%（RSD＝0.70%，n＝9）。3批樣品中兩種成分的載藥量≥1.17%，包封產率≥58%。結論：該方法操作簡單、結果準確，可用于測定鹽酸表阿霉素-索拉非尼PLGA栓塞微球的載藥量和包封產率。

鹽酸表阿霉素；索拉非尼；聚乳酸-羥基乙酸聚合物；栓塞微球；高效液相色譜法；載藥量；包封產率

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for the determination of drug loading and encapsulation efficiency of Epirubicin hydrochloride-sorafenib-loaded Polylactic Acid-glycolic Acid Polymer（PLGA）embolic microspheres.METHODS：HPLC method was adopted to determine the contents of epirubicin hydrochloride and sorafenib in the preparation，and then drug loading and encapsulation efficiency were calculated by formula.The determination was performed on Phenomenex Luna 5u C8（2）100A column with mobile phase consisted of methanol-water（containing 0.05%trifluoroacetic acid and 0.14%dium dodecyl sulfate）（75∶25，V/V）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 252 nm，and the column temperature was maintained at 25℃.The injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear ranges were 2.020-101.00 μg/mL for epirubicin hydrochloride（r＝0.999 8）and 2.048-102.40 μg/mL for sorafenib（r＝0.999 7），respectively.The limits of quantification were 3.297 0，2.546 8 μg/ mL，respectively.The detection limits were 0.989 1，0.764 1 μg/mL，respectively.RSDs of precision，stability and repeatability tests were all less than 2.0%.The recoveries were 96.41%-101.80%（RSD＝1.64%，n＝9），99.46%-101.45%（RSD＝0.70%，n＝9），respectively.Drug loading of two components in 3 batches of samples were no lower than 1.17%，encapsulation efficiency no lower than 58%.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，can be used to determine drug loading and encapsulation efficiency of Epirubicin hydrochloride-sorafenib PLGA embolic microspheres.

KEYWORDSEpirubicin hydrochloride；Sorafenib；PLGA；Embolic microspheres；HPLC；Drug loading；Encapsulation efficiency

原發性肝癌（Primary hepatocellular carcinoma，PHC）是最常見的惡性腫瘤之一，在我國的發病率和致死率均占全球總發病率和致死率的一半以上[1]。載藥栓塞微球是一種用于治療原發性肝癌中、晚期患者的新型藥物遞送系統，其聯合了肝動脈栓塞和局部化療兩種治療技術優勢，越來越受到國內外研究者的關注[2-3]。目前，栓塞微球的研究多停留在載單個抗腫瘤藥物階段，本課題組通過水包油包水（W/O/W）復乳溶劑揮發法制備了鹽酸表阿霉素-索拉非尼聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）栓塞微球[在載單個抗癌藥物（鹽酸表阿霉素）基礎上，同時負載了索拉非尼]。索拉非尼是第一個系統應用于晚期肝癌治療并被證實有效的多靶點、多酶抑制劑[4-5]，還具有抑制腫瘤細胞增殖和血管新生的作用，可增強肝癌肝動脈栓塞治療效果，減少肝癌的復發與轉移[6-7]；并采用高效液相色譜法（HPLC）測定該制劑中鹽酸表阿霉素和索拉非尼的含量，再通過公式計算載藥量和包封產率，以期為其質量控制和工藝評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括四元泵、自動進樣器、二級管陣列檢測器（DAD）、色譜工作站（美國Agilent公司）；ZNCL-G型磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；A25-Digital型高剪切分散乳化機（上海弗魯克流體機械制造有限公司）；KQ-5200型超聲波清洗機（鞏義市予華儀器有限責任公司，功率：200 W，頻率：40 kHz）；AB204-S型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q型純水處理系統（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸表阿霉素原料藥（上海灝云化工科技有限公司，批號：20151115）；索拉非尼原料藥（臺州市鴻耀化工有限公司，批號：20160331）；鹽酸表阿霉素對照品（德國Lipoid公司，批號：97040H00114，純度：99.3%）；索拉非尼對照品（德國Bayer公司，批號：PY637215，純度：99.5%）；PLGA（山東省醫療器械研究所，乳酸∶羥基乙酸＝50∶50，摩爾比，相對分子質量4萬）[8]；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 栓塞微球的制備

分別精密稱取20 mg鹽酸表阿霉素和索拉非尼原料藥，將鹽酸表阿霉素原料藥溶于0.75 mL水中作為內水相，索拉非尼原料藥用二甲基亞砜0.5 mL溶解后加入到10 mL含10%PLGA的二氯甲烷溶液中作為有機相；在剪切速度為10 000 r/min條件下，將內水相逐漸注入有機相中形成初乳，繼續剪切60 s；隨后將初乳緩慢注入外水相（含2%氯化鈉和1%聚乙烯醇的水溶液）中，在冰浴中用磁力攪拌器（400 r/min）持續攪拌0.5 h，將冰浴的冰水換為常溫水，再將磁力攪拌器設置為30℃繼續攪拌（400 r/min）4 h，經反復濾過、洗滌后干燥即得載藥栓塞微球（批號：20160910、20160911、20160912）。同法制備不含藥的空白微球。

2.2 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna 5u C8（2）100A（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-[水（含0.05%三氟乙酸和0.14%十二烷基硫酸鈉）]（75∶25，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：252 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液 取鹽酸表阿霉素對照品25.25 mg、索拉非尼對照品25.60 mg，精密稱定，置于同一25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品貯備液。精密量取上述混合對照品貯備液1 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得含鹽酸表阿霉素質量濃度為0.101 0 mg/mL、索拉非尼質量濃度為0.102 4 mg/mL的混合對照品溶液，于4℃冰箱內保存備用。

2.3.2 供試品溶液 取樣品約40 mg（含鹽酸表阿霉素和索拉非尼各約0.5 mg），精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，加二氯甲烷0.5 mL，超聲處理10 min，放至室溫，加適量甲醇輕微震蕩混勻后，定容，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.3 陰性對照溶液 取空白微球樣品約40 mg，再按

“2.3.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.4 系統適用性試驗

精密量取“2.3”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數以鹽酸表阿霉素和索拉非尼色譜峰計均＞3 000，保留時間分別為4.89、8.71 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 線性關系考察

精密量取“2.3.1”項下混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分別置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液各適量，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以鹽酸表阿霉素和索拉非尼質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得鹽酸表阿霉素回歸方程為y＝20.467x－9.186 6（r＝0.999 8），索拉非尼回歸方程為y＝38.390x－6.688 4（r＝0.999 7）。結果表明，鹽酸表阿霉素和索拉非尼檢測質量濃度線性范圍分別為2.020～101.00、2.048～102.40 μg/mL。

2.6 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.3.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD。結果，鹽酸表阿霉素和索拉非尼的LOQ分別為3.297 0、2.546 8 μg/mL，LOD分別為0.989 1、0.764 1 μg/mL。

2.7 精密度試驗

取“2.3.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，鹽酸表阿霉素和索拉非尼峰面積的RSD分別為0.08%、0.14%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性試驗

精密吸取“2.3.2”項下供試品溶液（批號：20160911）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，鹽酸表阿霉素和索拉非尼峰面積的RSD分別為0.27%、0.80%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.9 重復性試驗

取樣品（批號：20160910）6份，每份約40 mg，精密稱定，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，鹽酸表阿霉素和索拉非尼峰面積的RSD分別為1.14%、1.22%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.10 回收率試驗

取空白微球樣品（批號：20160913）適量，共9份，分別置于10 mL棕色量瓶中，各加入低、中、高質量的鹽酸表阿霉素和索拉非尼對照品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

2.11 樣品含量、載藥量和包封產率測定

取“2.1”項下3批樣品各適量，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算鹽酸表阿霉素和索拉非尼的含量，再根據載藥量（載藥量＝微球中藥物的含量/微球的總質量×100%）和包封產率（包封產率＝微球中藥物的含量/系統中總投藥量×100%）的公式計算樣品的載藥量和包封產率，結果見表2。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

將供試品溶液在190～400 nm波長范圍內掃描，結果鹽酸表阿霉素在234、252、288 nm波長處有最大吸收，索拉非尼在205、255 nm波長處有最大吸收[9-10]。由于供試品溶液中含甲醇，其在205 nm波長處會形成末端吸收，易造成干擾；綜合峰形等因素最終確定檢測波長為252 nm。

3.2 流動相的選擇

本課題組考察了不同比例的甲醇-水（含0.05%三氟乙酸）、乙腈-水（含0.05%三氟乙酸）、甲醇-乙腈（含0.05%三氟乙酸）為流動相系統。結果，甲醇-水（含0.05%三氟乙酸，80∶20，V/V）為流動相時相比其他兩種流動相系統，基線更穩定、且各成分分離較好，但是鹽酸表阿霉素峰保留時間少于2 min，容易與溶劑峰形成干擾；在水中添加十二烷基硫酸鈉并調整流動相比例，所得的色譜中鹽酸表阿霉素峰的保留時間延長至4.89 min，避免了溶劑峰的干擾。因此，最終確定流動相為甲醇-[水（含0.05%三氟乙酸和0.14%十二烷基硫酸鈉）]（75∶25，V/V）。

表1 回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

表2 樣品含量、載藥量和包封產率測定結果（n＝3）Tab 2 Results of content，drug loading and entrapment efficiency determination（n＝3）

3.3 提取方法的考察

微球中藥物的含量測定需先將藥物從微球中提取出來，處理方法主要有酶解法[11]、研磨法[12]和溶解提取法[13]等。對于聚乳酸類微球，一般采用溶解提取法，即采用對載體溶解度更大的二氯甲烷、乙腈、丙酮等溶劑使微球溶解將藥物提取出來再進行測定。本試驗中，選用二氯甲烷破壞PLGA載體骨架使藥物充分釋放后，直接加甲醇將藥物稀釋、定容，避免了由傳統液-液萃取法所導致的操作煩瑣且提取率不高的缺點。

綜上所述，本方法操作簡單、結果準確，可用于測定鹽酸表阿霉素-索拉非尼PLGA栓塞微球的載藥量和包封產率。

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Determination of Drug Loading and Encapsulation Efficiency of Epirubicin Hydrochloride-sorafenib PLGA Embolic Microspheres by HPLC

LIU Binbin1，JIAN Hui1，2，HUANG Shanshan1，LIU Wei2，ZHU Yilei1，LUO Xiaojian1，2，LI Xiang1，2（1.College of Pharmacy，Jiangxi University of TCM，Nanchang 330006，China；2.National Pharmaceutical Engineering Center for TCM Solid Preparation，Nanchang 330006，China）

R917

A

1001-0408（2017）21-2967-04

2017-02-07

2017-04-19）

（編輯：劉 柳）

國家自然科學基金資助項目（No.81603054）；江西省衛生計生委中醫藥科研課題（No.2016A008）；江西省博士后科研項目（No.2016KY08）

＊碩士研究生。研究方向：新藥及藥物新劑型。電話：0791-87119661。E-mail：liubiny@163.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：新藥及藥物新劑型。E-mail：sterlinghawk@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.24