FHL1A在膠質瘤組織中的表達及其與膠質瘤患者預后的關系

韋喜生 鄭曉君 曾弼良 劉英香 范元平

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FHL1A在膠質瘤組織中的表達及其與膠質瘤患者預后的關系

韋喜生 鄭曉君 曾弼良 劉英香 范元平

目的 探討FHL1A在膠質瘤組織中的表達及其與膠質瘤患者預后的關系。方法 采用免疫組化法檢測FHL1A在89例膠質瘤組織中的表達，同時采用該方法與western blot法對38例配對樣本(同一患者的腫瘤組織及其周圍正常組織)FHL1A表達差異進行檢測，并對各病例的預后影響與FHL1A表達差異間關系進行分析比較。結果 FHL1A 在膠質瘤中表達明顯低于其在周圍正常組織中表達，且差異具有統計學意義(P<0.05)。同時FHL1A 的表達與膠質瘤級別呈負相關，FHL1A表達低的患者預后效果差。結論 FHL1A的表達與膠質瘤的預后及惡性程度密切相關，對臨床診斷及預后判斷有參考價值。

膠質瘤；FHL1A;預后

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1229～1232)

膠質瘤是一種中樞神經系統的惡性腫瘤，具有對放化療不敏感、易體外成瘤以及多向分化的特點，而對于膠質瘤干細胞信號通路以及調控分子的研究成為目前診斷及治療膠質瘤的關鍵科學問題[1]。不少研究表明，Notch 信號通路與膠質瘤對于化療的耐受有著密切關系，即該通路參與膠質瘤細胞的維持、增殖、自我更新以及分化活動[2-4]，而FHL1主要通過參與Notch 信號通路、Cas 信號通路及Src信號通路的信號傳導，為其中的重要蛋白質家族[5]，而其中亞型FHL1A與該類通路的關系，即與膠質瘤的關系尚少有報道。因此研究FHL1A與膠質瘤的預后關系不僅能夠闡明以上信號通路與膠質瘤預后的關系，更能夠評價其對膠質瘤發生發展以及預后的作用。故本研究通過對不同類型膠質瘤患者腫瘤組織及其周圍正常組織中FHL1A表達水平的測定，探討其與膠質瘤的預后及惡性程度的相關性。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

膠質瘤標本主要來源于我們所在醫院的膠質瘤治療中心。樣本例數為89例，搜集時間為2013年至2015年。樣本中膠質瘤類型主要包括：8 例WHOⅠ級，18 例WHOⅡ級(6 例少突膠質細胞瘤和12 例星形細胞瘤)，15 例WHO Ⅲ級(6例間變型少突膠質細胞瘤、9 例間變型星形膠質細胞瘤)，48 例WHOⅣ級；搜集樣本中來源于男性的樣本44 例，女性樣本 45 例，樣本來源的年齡范圍為19～ 77 歲，平均年齡(33.7±22.1) 歲。 此外，采用IHC以及 western blot進行配對樣本(來源于同一患者的腫瘤組織及其自身的周圍正常腦組織)分析，樣本例數為38例，搜集時間為2013年-2015年。38例配對樣本中有7 例WHOⅡ級，21 例WHOⅢ級，10 例WHOⅣ級。所有腫瘤樣本的檢驗均由我們所在醫院病理科的2位以上副高醫師進行確診及病理分級后進行。本研究所有程序均經醫院的醫學倫理委員審核、批準。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑 蘇木精、畫圈筆、DAB 顯色試劑盒、抗體封閉液(凱基生物有限公司)；即用型 Dako 二抗(羊抗兔)、鼠抗人β-actin(sigma)、兔抗人 FHL1 抗體(proteintech)、HRP-羊抗鼠 IgG、HRP-羊抗兔 IgG(凱基生物有限公司)。Tris-Hcl、SDS、甘油、甘氨酸、甲醇、檸檬酸、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4(南京化學試劑有限公司)；伊利脫脂奶粉。

1.2.2 儀器 生物組織包埋機(KL)(湖北康龍電子儀器有限公司)，自動恒溫攤烤烘片機(蘇州奧德機械設備有限公司)，生物組織自動脫水機(湖北慧達儀器有限公司)，石蠟組織切片機(RM2235GTK-2002)(德國Leica 公司)。

1.3 方法

1.3.1 實驗試劑配置 ①上樣緩沖液：1 g SDS(10%)，5 ml甘油，50 mg BPB(0.5%)，2.5 ml 1M Tris-Hcl(pH6.8)，蒸餾水溶解并定容至10 ml，分裝為每份 500 μl，室溫保存待用。使用前加入2-ME稀釋。②蛋白電泳緩沖液：94 g甘氨酸，15.1 g Tris 堿，5 g SDS混合后用蒸餾水定容至 1 L，室溫保存待用。使用前采用蒸餾水稀釋5倍。③膜轉移緩沖液：3.035 g Tris 堿和14.41 g Glycine中加入200 ml甲醇后用蒸餾水定容到1 L，現配現用。⑤封閉緩沖液：用100 ml PBST將脫脂奶粉溶解為5%的濃度，現配現用。

1.3.2 免疫組化 采用多聚甲醛將樣本固定，并用石蠟包埋，冷凍切片后進行免疫組化染色。使用二甲苯將待測標本進行脫蠟，脫蠟3次，每次做好標記，并采用酒精梯度水化(梯度為100%，100%，95%，95%，90%，85%，80%，75%)，采用0.3%的過氧化氫避光封閉條件下孵育12 min，用抗原修復液將樣本修復，PBS清洗載玻片3次并用抗體封閉半小時后，加入FHL1一抗(1∶150稀釋)75 ml，4 ℃過夜，PBS洗滌3次，采用DAB顯色10 min，自來水終止顯色，蘇木精復染3 min，鹽酸酒精酚化，梯度酒精脫水干燥5 min，二甲苯透明3次，中性樹膠封片。

1.3.3 Western Blot 采用PBS將100 g組織樣本上血液洗凈，勻漿、離心后取上清進行蛋白定量，并于-80 ℃保存待用。采用12%分離膠及5%的濃縮膠，將預先準備好的總蛋白上樣，利用恒壓進行蛋白電泳，用緩沖液封閉室溫孵育后加入抗體，其中FHL1抗體(1∶1 000稀釋)，其他二抗(1∶2 000稀釋)，進行37 ℃孵育，1 h后采用顯色液顯影(顯影液A∶B=1∶1)。

1.3.4 預后評價 在患者接受30天治療后采用隨訪方式對患者進行改良 Rankin’s 評分[6]，其中按照患者日常生活是否可以自理分為6級評分，0分為生活可以完全自理，5分為生活不能自理、完全依賴他人、且量便失禁。得分在0～2分的患者說明其預后良好，得分在3～5分者預后不良。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 FHL1 A在膠質瘤和相應瘤周正常腦組織中的表達

通過對38例患者的膠質瘤及腫瘤組織周圍的正常組織標本進行western blot以及免疫組化檢測，結果發現，FHL1A在腫瘤組織周圍的正常組織中表達(125.3±10.3)高于在膠質瘤中的表達(12.3±2.0)，且差異具有統計學意義(t=4.303，P=0.0311)。

2.2 不同膠質瘤級別患者的預后評價

經改良Rankin’s法評分后，WHO Ⅳ級組得分(4.9±1.8)最高，WHOⅠ級組得分(2.2±0.7)最低，WHO Ⅱ級得分(3.8±0.8)，WHO Ⅲ級得分(4.1±1.0)，不同級別患者得分具有統計學差異(F=11.35，P<0.05)。

2.3 FHL1A表達與膠質瘤臨床病理特征的關系

對所搜集的89 例患者的膠質瘤石蠟標本進行免疫組化分析，根據患者預后評價結果，對 FHL1A的表達與患者的預后以及臨床特點進行相關性分析，結果發現 FHL1A表達與膠質瘤級別具有負相關性，見表1。

3 討論

腦部腫瘤占人類全身腫瘤發生率的2%，而膠質瘤是人體腦部腫瘤中最為常見的一種腫瘤，其致死率極高，預后較差[7]。且該類腫瘤在體內彌散性較快，對化療及常規放射性療法具有抵抗作用。而僅通過手術切除法治療的患者，其生命也只能延續6～9個月。因此，對于膠質瘤的治療以及預后探討成為目前研究的熱點及難點[8]。

表1 FHL1A表達與膠質瘤臨床病理特征的關系/例

通常情況下，腫瘤的發生、發展與轉移都與細胞之間黏著有密切的關系[9]，Notch 信號通路中的FHL 家族蛋白是參與黏著斑激酶的重要信號傳導蛋白[10]。該類家族蛋白主要由4個半 LIM 結構域組成，包括FHL5(ACT)、FHL4、FHL3、FHL2以及FHL1蛋白[11]。FHL1為1種腫瘤抑制因子，在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌以及膠質瘤中的表達呈明顯降低，且參與有關Notch 信號通路、Cas 信號通路及Src信號通路，影響細胞正常的生長、分化以及骨架的重塑，對腫瘤細胞的發展以及轉移具有一定的抑制作用[12]。而有關FHL1A是否參與膠質瘤的發生、發展，以及該指標與膠質瘤的預后關系少有報道。

本研究通過采用western blot 以及免疫組化檢測對膠質瘤患者腫瘤組織以及其腫瘤組織周圍的正常組織中FHL1A的表達量進行檢測，結果發現，FHL1A在膠質瘤組織中的表達明顯低于其在腫瘤組織周圍的正常組織，且具有統計學差異(P<0.05)。說明該項指標與膠質瘤的發生有著密切的關系。根據文獻調研我們發現，FHL1A 主要通過抑制 AKT 的磷酸化，進而干涉PI3K/AKT 信號通路的正常功能，對腫瘤細胞的細胞周期具有一定的影響，促進參與抑制細胞周期蛋白的依賴性激酶P21的表達，進而通過影響膠質瘤細胞的周期來控制膠質瘤細胞的增殖，起到抑制腫瘤細胞增殖的作用[13-14]。同時，FHL為Notch信號通路中重要的蛋白家族，而Notch信號通路與膠質瘤對于化療藥物的敏感性有密切關系，可以調節膠質瘤細胞對于化療的耐受程度，對膠質瘤的預后有著極大的影響。而FHL1A可以有效地阻斷Notch信號通路中磷酸化過程[15]，進而阻斷該通路的信號傳導，可以耗竭膠質瘤干細胞，并且增加膠質瘤細胞對于化療藥物以及放射性治療的敏感性，提高治愈率，改善膠質瘤的預后。

此外，本研究還通過對不同腫瘤級別的樣本中FHL1A表達進行檢測后發現，膠質瘤腫瘤級別越高，其中FHL1A表達量越低，說明膠質瘤腫瘤級別與FHL1A表達水平存在負性相關性，經統計學分析發現P值小于0.05。改良的Rankin’s法評分中分數越高說明患者預后效果越差，其自理能力恢復越差。本研究中采用改良Rankin’s法評分法對各入選患者的預后進行評價，結果發現，腫瘤級別越高的患者術后預后結果越差，也進一步證實了FHL1A表達水平與患者預后的相關性，兩者也存在負性相關性。實驗中還考察了FHL1A與患者年齡、性別以及做腫瘤切除手術的范圍之間的關系，結果發現，FHL1A與上述一些臨床指標間并不存在相關性，經統計學分析P值大于0.05。而FHL1A卻與患者腫瘤級別類型密切相關，從側面反映出FHL1A與膠質瘤發生發展的關系。

本研究探討了FHL1A表達水平的高低與膠質瘤患者病情的嚴重程度的關系，結果表明該項指標可以作為膠質瘤病情演化嚴重程度的一項參照指標，FHL1A表達較高的患者，其膠質瘤級別較高，且預后不良，該項指標的表達與患者預后呈現負性相關性。因此，該項指標對于臨床檢測及預后判斷具有一定借鑒價值。

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(編輯：甘 艷)

Expression of FHL1A in Gliomas Tissues and Its Correlations with Prognosis

WEI Xisheng，ZHENG Xiaojun，ZENG Biliang，et al.

The 421 Hospital of PLA，Guangzhou，510318

Objective To investigate the expressions of FHL1A in gliomas tissue and the relationship between their expressions and prognosis of patients with gliomas.Methods Immunohistochemistry SP methods were applied to detect the expression of FHL1A in 89 cases of gliomas organization and western blot also applied to analyze the expression levels differences of FHL1A of 38 matched samples(normal tumor tissue and surrounding normal tissue of the same patients).The relationship between the expression levels and the glioma prognosis were analyzed.Results The expression of FHL1A in gliomas was significantly lower than the corresponding peritumoral normal brain tissue，and the difference had statistical significance(P<0.05)；The expression of FHL1A was inversely correlated with tumor grade of gliomas and the lower expression of the FHL1A of patients，the worse prognosis appeared in patients.Conclusion The expression of FHL1A is closely related to the prognosis and malignancy of glioma，and has reference values for clinical diagnosis and prognosis.

Gliomas；FHL1A；Prognosis

510318 解放軍第四二一醫院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.08.003

R730.264

A

1001-5930(2017)08-1229-04

2017-04-06

2017-05-25)