急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表達與心肌損傷、心律失常、虛實辨證的相關性分析

范金茹，歐陽過，陳 彤，王建湘，廖建萍，周斐然，謝榮苑

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急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表達與心肌損傷、心律失常、虛實辨證的相關性分析

范金茹，歐陽過，陳 彤，王建湘，廖建萍，周斐然，謝榮苑

目的 分析急性心肌梗死大鼠肌漿網Ca2+-ATP酶信使RNA(SERCA2a mRNA)表達與心肌組織形態學，心律失常及虛實辨證評分的相關性。方法 將40只SD大鼠分為假手術組、模型組、心痛方組、硫氮卓酮組。采用結扎法制備心肌梗死模型，采用RT-PCR法測定SERCA2a mRNA表達，心肌細胞HE染色觀察形態學改變，心電圖檢測心律失常，虛實辨證評分進行虛實辨證。結果 心肌損傷程度與SERCA2a mRNA表達呈負相關(r=-0.780，P=0.00)；未發生心律失常組SERCA2a mRNA表達明顯增多(P<0.00)；SERCA2a mRNA表達與虛實辨證評分呈正相關(r=0.969，P=0.01)。結論 SERCA2a mRNA對心肌組織具有保護作用，SERCA2a mRNA表達與心律失常、虛實辨證具有相關性。

急性心肌梗死；肌漿網Ca2+-ATP酶信使RNA；心律失常；心肌損傷；虛實辨證

最新研究調查顯示，心血管病為我國居民的首位死因，其中急性心肌梗死死亡率呈快速上升態勢，嚴重危害人類健康[1]。有研究發現，急性心肌梗死早期心律失常的發生與鈣通道調節基因肌漿網Ca2+-ATP酶信使RNA(SERCA2a mRNA)密切相關[2]。心肌梗死屬中醫“胸痹、心痛”范疇，病機為本虛標實，虛實夾雜[3]。目前尚缺少鈣穩態調節與中醫虛實辨證相關性研究。本課題對SERCA2a mRNA進行研究，觀察對心肌損傷及心律失常的影響，并探討與中醫虛實證型的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠40只，體重200 g～250 g，鼠齡8周～10周，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2011-003。

1.2 主要儀器和試劑 生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司，BL-420F)；動物人工呼吸機(浙江醫科大學儀器實驗廠，DH-140)；熒光定量PCR儀(廠家ABI，Step One Plus)；臺式高速冷凍離心機(Heal Force，Neofuge 15R)；PCR試劑盒、PCR引物(武漢谷歌生物試劑有限公司提供)。

1.3 藥品 心痛方中藥超微顆粒(湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，批號：681211)組方：柴胡10 g，瓜蔞10 g，桃仁10 g，川芎10 g，白芥子10 g，蒲黃10 g，郁金10 g，九香蟲5 g，甘草5 g；硫氮卓酮(湖南中達騖馬制藥有限責任公司生產，國藥準字號：H20065734)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組 SPF級雄性SD大鼠40只，按隨機表隨機分組，分為假手術組(A組)、模型組(B組)、心痛方組(C組)、硫氮卓酮組(D組)4組，每組10只。

1.4.2 造模方法 以結扎冠狀動脈前降支建立大鼠急性心肌梗死模型[4-5]。穿線、或結扎后即刻記錄心電圖，以左室前壁呈發紺或Ⅱ導聯S-T段弓背向上抬高大于0.1 mV并持續0.5 h以上，并于結扎點下心肌顏色改變為結扎成功標志(S-T段無改變者淘汰)。假手術組僅開胸，不結扎。

1.4.3 給藥方案 手術后給藥7 d(前3 d給藥同時予青霉素鈉肌注抗感染)，均采用灌胃法給藥，以60 kg人為標準，參照劑量-體表面積換算方法計算大鼠給藥量，藥物濃度按大鼠1 mL/100 g灌胃容量配制，心痛方組采用中藥超微顆粒沖調成湯劑，濃縮后以1.08 g/kg劑量給藥；硫氮卓酮組以2.61 mg/kg劑量藥液灌胃；模型組和假手術組均予以等量生理鹽水灌胃。每日1次，連續7 d，于第7 d灌胃30 min后處死大鼠。

1.4.4 RT-PCR法測定SERCA2a mRNA表達 取左心室心肌(結扎缺血及壞死區域)約50 mg，將其剪碎，放入1 mL Trizo液中，用1‰ 集碳酸二乙酯(DEPC)液體浸泡的電動勻漿器勻漿，Trizo法提取RNA，參考AMV反轉錄酶說明書進行反轉錄。根據基因庫基因序列，以Primer5軟件進行設計SERCA 2am RNA和β-actin引物：SERCA2a引物，上游5'-AGA TAG CGG GCA TAC TG-3'，下游5'-TCT ATC GCC CGT ATG AC-3'，擴增片段長592 bps；β-actin引物，上游5'-CAC TAT CGG CAA TGA GCG-3'，下游5'-GTG ATA GCC GTT ACT CGC-3'，擴增片段長223 bps。通過凝膠圖像分析儀實行吸光度掃描來觀察條帶的灰度強弱，SERCA2a mRNA吸光度值同GAPDH吸光度的比值表示結果。

1.4.5 HE染色法觀察心肌形態學改變 取心室組織浸沒于4%多聚甲醛24 h固定，置入梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，經修片，切片成片厚4 μm，HE染色，于光學顯微鏡下觀察心肌形態學[6]。根據心肌形態學改變進行心肌損傷程度評分：心肌纖維排列整齊、無壞死、無炎癥細胞浸潤記0分；心肌纖維出現凝固性壞死并輕度炎癥細胞浸潤記1分；大量心肌纖維凝固性壞死并重度炎癥細胞浸潤記2分。

1.4.6 心電圖觀察大鼠心律失常 觀察大鼠心律失常發生：第1次在造模(或假手術)成功后給藥前進行心電圖常規記錄；第2次給藥后第7天，大鼠處死前并根據實際情況隨時記錄。

1.4.7 大鼠虛實辨證評分 根據中醫辨證標準，大鼠一般狀況(精神狀態、皮膚毛發、鼻尾顏色、呼吸頻率、活動量)為觀測指標[7]，采取量化分級評分判斷虛證實證。根據大鼠精神狀態、皮膚毛發、鼻尾顏色、呼吸頻率、活動量情況分級打分：精神狀態評分(精神萎靡，反應遲鈍，眼瞼下垂計1分；倦怠乏力，反應欠靈敏計2分；動作緩慢，缺乏生氣計3分；活潑好動，反應靈敏計4分)；皮膚及毛發評分(皮膚松弛，皮下無脂肪，抓之觸骨，全身毛發枯槁，豎立計1分；皮膚松弛，少許脂肪，易抓取，背部毛發干枯，無光澤計2分；皮膚張力減小，背部毛發少光澤計3分；皮膚與脂肪連接緊密，柔韌有彈性，毛發柔順有光澤計4分)；鼻、尾顏色(淡紅少澤計1分，粉紅光淡計2分，紅潤有光澤計3分、青紫少澤計4分)；呼頻率：動物安靜時，測每分鐘呼吸次數，取3次均值(呼吸頻率170次/min～200次/min計1分；呼吸頻率130次/min～169次/min計2分，呼吸頻率110次/min～129次/min計3分；呼吸頻率計70次/min～109次/min計4分)；活動量評分(活動少1分；活動量較少計2分；活動較多計3分；活動多計4分)。大鼠累計得分≤10分辨為虛證，累計得分>10分辨為實證。

2 結 果

2.1 造模結果 40只大鼠，手術中模型組死亡1只，造模后用藥前假手術組、硫氮卓酮組、心痛方組各死亡1只，每組納入實驗大鼠為9只。造模用藥后假手術組大鼠未出現心律失常及死亡；模型組7只發生心律失常(5例室性早搏，1例室速，1例室顫)，3只大鼠死亡；硫氮卓酮組6只發生心律失常(2例室性早搏，2例房性心律失常，1例傳導阻滯，1例室速)，2只大鼠死亡；心痛方組1只發生心律失常(室速)，1只大鼠死亡。由于死亡大鼠均發生心律失常，未納入統計。

2.2 各組大鼠心肌損傷程度比較 與假手術組比較，模型組及硫氮卓酮組心肌損傷程度評分明顯增高(P<0.01)；心痛方組差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較，心痛方組心肌損傷程度評分明顯降低(P<0.01)；與硫氮卓酮組比較，心痛方組差異無統計意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌損傷程度比較(±s) 分

2.3 大鼠心肌SERCA2a mRNA表達與心肌細胞形態學改變相關系分析 大鼠SERCA2a mRNA表達量與心肌損傷程度呈負相關(r=-0.780，P=0.00)。

2.4 大鼠心肌SERCA2a mRNA表達與心律失常關系 與心律失常組比較，未發生心律失常組SERCA2a mRNA表達明顯增多(P<0.01)，提示大鼠心肌SERCA2a mRNA的表達增高能減少急性心肌梗死大鼠心律失常的發生。詳見表2。

組別nSERCA2amRNA心律失常組80.79±0.20未發生心律失常組221.37±0.281) 與心律失常組比較,1)P<0.01。

2.5 急性心肌梗死大鼠心肌SERCA2a mRNA的表達與虛實評分相關性分析 SERCA2a mRNA表達增加，評分越高，SERCA2a mRNA表達與心肌評分損傷程度關系呈正相關(r=0.969，P<0.01)。

3 討 論

急性心肌梗死具有高死亡率、高致殘率特點，這與冠狀動脈急性閉塞后心肌損傷和并發心律失常密切相關。有研究發現，心肌Ca2+濃度增加引起心肌損傷，心肌梗死面積顯著增大[8]，心肌Ca2+濃度增加可能是急性心肌缺血早期室性心律失常的主要機制[9]。心肌細胞內Ca2+主要儲存于肌漿網和線粒體內，靜息狀態胞漿內游離Ca2+濃度低，缺血缺氧造成心肌細胞損傷后胞漿內Ca2+濃度明顯升高[10]。SERCA2a是一種P型離子激活型ATP酶，通過消耗三磷酸腺苷(adenosine triphos-phate，ATP)將胞漿中多余的Ca2+泵入肌漿網中，以維持心肌細胞內外巨大的濃度差，因此SERCA2a可調控心肌胞漿濃度和維持心肌細胞鈣穩態[11]。已有研究表明，SERCA2a表達增多通過增加肌漿網的Ca2+再攝取以改善心力衰竭[12-13]。

本實驗研究發現，SERCA2a mRNA表達增強時，心肌損傷程度降低，提示SERCA2a mRNA表達對急性缺血缺氧后心肌具有明顯保護作用。未發生心律失常組SERCA2a mRNA表達明顯升高，提示增加SERCA2aRNA活性可減少心律失常發生。SERCA2aRNA減輕心肌損傷，減少心律失常發生的機制尚未明確，可能與SERCA2a將心肌胞漿多余的Ca2+泵到肌漿網，減少Ca2+超載有關。

冠心病屬中醫“胸痹、心痛”范疇，急性期主要表現邪盛標實，后發展多為虛證或虛實夾雜[14]。急性心肌梗死則類似中醫“真心痛”，屬胸痹嚴重病證，發生時以痰瘀互結，寒凝氣滯表現為主，常因實致虛，甚者亡陰亡陽，陰陽離決。本研究發現，心肌梗死后實證組大鼠SERCA2a mRNA表達明顯高于虛證組大鼠，兩者關系呈正相關。推測其原因可能與心肌能量物質ATP含量相關。冠狀動脈閉塞后，心肌供血急劇減少，而SERCA2a依賴能量將胞漿中的Ca2+攝入肌漿網中。故ATP增多時，SERCA2a mRNA活性增強，中醫癥狀學多表現為實證；ATP產生減少時，SERCA2a mRNA活性減弱，中醫癥狀學多表現為虛證。

心痛方以“心痛治肝，肝心同治”，“急則治其標，治實以防虛變”為特色，根據疏肝化瘀豁痰法立方，為主治痰瘀互結氣郁證胸痹心痛的有效驗方，其臨床療效確切，前期動物實驗從炎癥反應通路證實心痛方能縮小大鼠心肌梗死面積，抑制血小板-白細胞相互反應，對心肌有保護作用[15-16]。本實驗顯示，心痛方能顯著增加SERCA2a mRNA表達，明顯降低心肌損傷，減少心律失常的發生，對心肌組織具有保護作用，提示其保護機制可能與增加SERCA2a活性密切相關。SERCA2a活性與虛實辨證密切相關，但機制尚未明確需進一步研究。

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(本文編輯薛妮)

Correlation of SERCA2a mRNA with Myocardial Injury,Arrhythmia,Syndrome Differentiation of Deficiency and Excess in Rats with Acute Myocardial Infarction

Fan Jinru，Ouyang Guo，Chen Tong， Wang Jianxiang， Liao Jianping， Zhou Feiran，Xie Rongyuan

The First Hospital，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，Hunan，China

Objective To investigate the correlation of sarco-endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a (SERCA2a) mRNA with myocardial injury，arrhythmia，syndrome differentiation of deficiency and excess in rats with acute myocardial infarction (AMI).Methods Forty Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into sham operation group，model group，Xintongfang group and Diltiazem control group.The myocardial infarction model was established by using ligation method.Expression of SERCA2a mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method.The arrhythmia was tested by electrocardiogram. The morphological changes were observed by Hematoxylin-Eosin (HE) staining. The syndrome differentiation of deficiency and excess was made by scoring criteria. Results The degree of myocardial injury was negatively correlated with SERCA2a mRNA expression(r=-0.780，P=0.00).Expression of SERCA2a mRNA in non- arrhythmia group was significantly increased (P<0.01) . The expression of SERCA2a mRNA was positively correlated with syndrome differentiation score (r=0.969，P=0.01).Conclusion SERCA2a mRNA has protective effect on myocardial tissue，and SERCA2a mRNA expression is associated with arrhythmia and syndrome differentiation of deficiency and excess.

acute myocardial infarction；sarco-endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a mRNA；arrhythmia；myocardialinjang；syndrome differentiation of deficiency and excess

湖南省教育廳科學研究項目(No.16A159)

湖南中醫藥大學第一附屬醫院(長沙 410007)，E-mail：fanjr218@sina.com

信息：范金茹，歐陽過，陳彤，等.急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表達與心肌損傷、心律失常、虛實辨證的相關性分析[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(14)：1716-1718.

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.14.010

1672-1349(2017)14-1716-03

2017-02-28)